Glykovaný hemoglobin Ing. Martina Podborská, Ph.D. OKB FN Brno Zpracováno s pomocí přednášek RNDr. Petra Breineka Školní rok 2016/2017 2 Glykovaný hemoglobin (HbA1c)  http://old.lf3.cuni.cz/diabetologie/Inz_Glykace.htm Hemoglobin [http://sweet-about- me.webnode.cz]  HbA1c je základní vyšetření pro dlouhodobé sledování diabetu mellitu 3 HbA1c – klinický význam  rutinní a efektivní nástroj sledování průběhu DM (diabetu)  HbA1c ukazatel dlouhodobé průměrné koncentrace glukózy v krvi (období cca 6-8 týdnů nazpět) umožňuje posoudit dlouhodobou kompenzaci diabetu  diagnostické kritérium DM  kontrola terapie  včasné odhalení hrozících komplikací  hodnocení vyšetření: Hodnota HbA1c Interpretace výsledků < 4,5 % Dobrá kompenzace diabetu 4,5 – 5,3 % Uspokojivá kompenzace diabetu ˃ 5,3 % Neuspokojivá kompenzace diabetu 4 Glykace  Glukóza je aktivní molekula – účastní se glykačních a autooxidačních reakcí vznik reaktivních látek zvyšujících oxidační stres, které zasahují do mechanismů zánětlivé reakce  Glykace bílkovin je založena na chemické vazbě glukózy na N-koncové aminokyseliny bílkovin:  aldehydická skupina glukózy reaguje s volnou aminoskupinou proteinů bez enzymové katalýzy za vzniku glykovaného proteinu 5 Glykace  HbA1c („dlouhý cukr“) je látka, která vzniká v organismu neenzymatickou reakcí tzv. glykací mezi hemoglobinem (červené krevní barvivo) a glukózou (krevním cukrem)  GLYKACE: je neenzymové navázání (adice) cukru na proteiny za vzniku fruktosaminu  faktory ovlivňující neenzymovou glykaci proteinů:  koncentrace sacharidů a proteinů a jejich kolísání (koncentrace proteinů v krvi je relativně konstantní, rychlost glykace je úměrná koncentraci sacharidů)  doba expozice  biologický poločas daného proteinu  teplota 6 Glykace hemoglobinu  rychlá tvorba labilní Schiffovy báze (aldimin)  pomalý Amadoriho přesmyk za vzniku stabilního ketoaminu (ireversibilní)  koncentrace závisí na koncentraci glukózy a poločasu života erytrocytů 7 HbA1c – glykace  Zdroj: přednáška „HbA1c“ RNDr. Petra Breineka  HbA1c vzniká glykací na N-konci b-řetězce hemoglobinu 8 Hemoglobin  Složená bílkovina – hemoprotein:  bílkovina – globin  hem  Illustration copyright 2000 by Nucleus Communications, Inc. All rights reserved. http://www.nucleusinc.com  https://fmss12ucheme.wordpress.com/2013/05/06/hemoglobin/  hlavní fce: je to transportní molekula plynů a tvoří 95 % objemu erytrocytů 9 Hemoglobiny  Zdroj: přednáška „HbA1c“ RNDr. Petra Breineka 10 Výhody stanovení HbA1c vs. glykémie  není třeba konzervovat krev (větší stabilita)  menší intraindividuální variabilita (CV<2%)  HbA1c není ovlivněn krátkodobou glykémií  nemocný nemusí být lačný  využití pro diagnostiku i kontrolu léčby 11 Vyjadřování výsledků HbA1c  není třeba konzervovat krev (větší stabilita)  od 1.1. 2012: mmol/mol (např.45 mmol HbA1c/mol Hb)  (%) DCCT (převážně v USA) (Diabetes Control and Complication Trial)  2010, konsensus ADA, IFCC, IFD, EASD, ISPAP 12 Rozhodovací meze HbA1c Referenční interval 20 – 42 mmol/mol Rozhodovací meze Kompenzovaný diabetes (dospělí, negravidní) 43 – 60 mmol/mol  Preanalytické požadavky:  Analyzovaný materiál: B – odběr do EDTA  stabilita: 2d (+20 až +25°C); 1 týden (+4 až +8°C); 1rok (<-20°C lépe při -80°C)  Poznámky:  snížená hodnota doby života erytrocytů  hemoglobinopatie, karbamylace (uremičtí pacienti) – ovlivnění koncentrace HbA1c v rutinních metodách 13 Požadavky na analytickou kvalitu měření Intraindividuální biologická variabilita 1,9 Preciznost odvozená z biologických variabilit 1,0 Interindividuální biologická variabilita 5,7 Pravdivost odvozená z biologických variabilit 1,5 Celková biologická variabilita Celková chyba odvozená z biologických variabilit 3,1 Mezilehlá preciznost CV < 1,0 % Pravdivost (Bias) B < 1,5 % Celková chyba TE < 6,9 % Metrologická návaznost referenční metoda LC-ESI/MS  www.westgard.cz  Doporučení ČDS a ČSKB; vydáno v únoru 2012, aktuální korekce 18.2.2015 14 Nejistota výsledků měření  na základě kombinace dílčích nejistot odpovídajících preciznosti, hodnotě bias a hodnotě Cvi lze odhadnout výslednou kombinovanou nejistotu výsledků měření (Uc) 6 až 9% (95% interval spolehlivosti) 15 HbA1c – metody stanovení 1. Referenční metody:  izolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HbA1c)  enzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C)  analytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů) a) LC/ESI/MS: Glykovaný hemoglobin (HbA1c) je ze směsi peptidů separován, detekován, identifikován hmotnostní spektrometrií a kvantifikován na podkladě rozdílných hodnot m/z. Z poměru hodnot m/z analyzovaných vzorků a kalibrátorů se vypočítá hodnota HbA1c. a) CE/ESI/MS: První separace se provede pomocí HPLC, jednotlivé frakce se sbírají, následuje další separace této směsi pomocí CE. Glykovaný a neglykovaný hexapeptid jsou odděleny na základě různých elektromigračních časů a kvantifikovány spektrofotometrickým detektorem. 16 HbA1c – metody stanovení 2. Doporučené rutinní metody - chromatografické: a) Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová):  založena na interakci glykovaného hemoglobinu s imobilizovaným boronátovým aniontem  po eluci neglykovaných frakcí hemoglobinu, dojde k uvolnění vazby a po eluci se stanoví hemoglobinové frakce detektorem, který měří absorbance při 415 nm  koncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na chromatogramu  Princip boronátové chromatografie 17 HbA1c – metody stanovení 2. Doporučené rutinní metody - chromatografické: b) Kapalinová chromatografie s výměnou iontů (IEC)  separace hemoglobinů a jeho složek na slabě kyselých ionexech  jednotlivé frakce hemoglobinu jsou rozděleny podle jejich různých fyzikálněchemických vlastností (velikost náboje) v měnícím se prostředí (změna koncentrace iontů, změna pH)  frakce se po rozdělení detekují v mobilní fázi detektorem, který měří absorbance při 415 nm  koncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na chromatogramu podle kalibrační křivky pomocí softwaru chromatografu c) HPLC (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie) 18 HbA1c – metody stanovení  HPLC 19 HbA1c – metody stanovení  HPLC 20 HbA1c – metody stanovení  HPLC 21 HbA1c – metody stanovení 2. Doporučené rutinní metody - imunoanalytické:  založeny na vazbě protilátek proti b N-terminálně glykované tetrapeptidové nebo hexapeptidové skupině  Imunoturbudimetrie, imunonefelometrie:  nejčastěji se používá stanovení TINIA  k analyzovanému vzorku (lyzovaná krev) se přidá specifická protilátka proti HbA1c; nenavázaná (přebytek) protilátka se stanoví po reakci s polyhaptenovým činidlem za vzniku nerozpustného komplexu  rychlost reakce se stanoví turbidimetricky většinou při 340 nm a je nepřímo úměrná koncentraci HbA1c v analyzovaném vzorku HbA1c + antiHbA1c komplex HbA1c-antiHbA1c antiHbA1c (přebytek) + polyhapten komplex anti-polyhapten  CMIA 22 HbA1c – metody stanovení 2. Doporučené rutinní metody - imunoanalytické:  CMIA: např. Abbott Architect i2000 SR  hemolýza erytrocytů, uvolnění HbA1c  inkubace s magnetickými mikročásticemi, navázání antigenu (HbA1c)  promytí, odstranění nenavázaného antigenu  přidání Anti-HbA1c mab (konjugát) značený akridiniem  vazba konjugátu na mikročástice  promytí, odstranění nenavázaného konjugátu  chemiluminiscence (po změně pH a přidání peroxidu) 23 HbA1c – metody stanovení 2. Doporučené rutinní metody - elektroforetické:  elektroforéza v agarózovém gelu (ELFO)  kapilární elektroforéza (HPCE)  izoelektrická fokusace (IEF) 24 Co může ovlivnit hodnocení vyšetření HbA1c  doba života erytrocytů (120 ± 10 d) !  přítomnost vzácnějších typů hemoglobinu (1165 variant Hb, např. HbS, HbC, HbE, HbD)  hemolýza, ikterus  těžké krvácení  věk, rasa, terapie,… Děkuji za pozornost.