Parametry metod automatické fotometrické analýzy Miroslava Beňovská KLM LF MU Parametry metod automatické fotometrické analýzy • aplikační kód (jednoznačná definice metody) • název metody • biologický materiál (sérum, plazma, moč…) • typ měření změn absorbance (end-point, kinetické měření) • délka inkubace – doba trvání reakce ( do 10 min) • měřící body reakce • vlnová délka • objem pipetovaného vzorku, • objem pipetovaných reagencií (R1, R2, R3…) • podmínky při opakování analýzy s menším, stejným nebo větším • objemem vzorku • způsob/typ kalibrace • parametry pro zajištění validní kalibrace (limity pro citlivost a • opakovatelnost) • pracovní rozsah metody a další parametry k ověření integrity • výsledku (absorbanční limit, limit pro kontrolu linearity průběhu • reakce) Parametry metod automatické imunochemické analýzy •Obdobné • •Některé parametry jako typ měření, měřící body reakce, vlnová délka atd. jsou vynechané Parametry metod automatické analýzy •Způsoby zadávání: • •Kompletní aplikace od výrobce – instalace přes web nebo pomocí čárového kódu, možnost úpravy pouze některých parametrů • •Manuální vkládání jednotlivých parametrů • (ustupuje, možnost chyby, používá se u metod a reagenciemi jiného výrobce než je výrobce analyzátoru) • Popis významných parametrů Vlnové délky, bichromatické měření Všechny testy pro klinickou chemii jsou v současné době měřeny simultánně při dvou vlnových délkách – hlavní a vedlejší sejmout0011 Bichromatické měření •Koncentrace se počítá z rozdílu absorbance obou měření. •Výhodné, neboť kompenzuje : •variace světelné emise fotometru •citlivost fotodiod •bublinky nebo částečky v cestě světla • • •Hlavní vlnová délka je dána absorpčním maximem reakce •Vedlejší vlnová délka je zvolena tak, aby •rozdíl absorbancí mezi hlavní a vedlejší λ byl co největší •současně se při ní musí minimálně uplatňovat interference •současně má být co nejblíže k hlavní λ • • •Na analyzátorech bývá běžně možnost využívat pro různé •metody 12-14 vlnových délek Měřící body reakce •Absorbance reakčních roztoků v kyvetě je periodicky měřena po každém cyklu přístroje (kolem 20s) během reakčního času (10 minut) • •Přístroje jsou schopny přidávat vzorky a činidla v určité fázi reakčního času dle typu prováděného měření • •Přesná specifikace měřícím bodem sejmout0010 Typy měření: End point – jednobodové (měří se absorbance na konci reakce) sejmout0012 End point - dvojbodové (blank + konec reakce) sejmout0013 End point - tříbodové (např. pro ISE) Kinetické (rate) – měří se změna absorbance za časovou jednotku Při reakci dochází k nárůstu (stanovení CK) či poklesu absorbance (stanovení ALT, AST) sejmout0014 sejmout0003 F:\Roche\Export\Screenshots\cobas c 8000 DM 2015-09-30T192726.png Kinetické měření Způsoby kalibrace •Automatické analyzátory umožňují např. tyto typy •kalibrace: • • •Lineární dvoubodovou – pro fotometrické metody •Nelineární – pro turbidimetrické, imunoturbidimetrické • metody • Příklady: Spline • Logit-log 5P • RCM2T2 exponenciální funkce • Ověření integrity výsledku •Aby se zabránilo vydání nesprávného výsledku při extrémní koncentraci, analyzátory automaticky provádí zkoušky na ověření správnosti výsledku • •Není-li výsledek po technické stránce v pořádku, je označen chybovým hlášením a ve většině případů automaticky naředěn • •Používají se následující zkoušky: test na linearitu, • test na dodržení absorbančního limitu, test na kontrolu vyčerpání substrátu, test detekující Hook efekt •Test na linearitu •Je prováděn automaticky u všech kinetických metod •Linearita je kontrolována pomocí lineární regresní analýzy. Není-li splněna, vzorek je označen chybovým hlášením (př. Lin.) •Test na dodržení absorbančního limitu •Naměřená absorbance vzorku je tak vysoká, že nelze zajistit spolehlivé výsledky •U vzorků se objeví chybové hlášení a musí se ředit •Integrita výsledku je zajištěna nastavením absorbančního limitu •Test na kontrolu vyčerpání substrátu •Uplatňuje se absorpční limit i kontrola linearity •Není-li reakce lineární, do výpočtu jsou zahrnuty pouze body z lineární oblasti sejmout0024 sejmout0006 Test detekující Hook efekt •Objevuje se u imunoturbidimetrických stanovení • •Koncentrace stanovovaného analytu ve vzorku vysoká • •Leží na pravé straně Heidelbergovy křivky • •Chybně stanovená nízká koncentrace měřením absorbance je s využitím Prozone Check detekována a označena chybovým hlášením •Stanovení je pak znovu provedeno z menšího objemu nebo z naředěného vzorku • •Prozone Check je nejčastěji proveden následovně: Po skončení reakce se stoupající směrnicí absorbance je přidán další definovaný objem antigenu. Absorbance je měřena před i po přidání antigenu (viz 1-Point Assay) • •Používá se výjimečně – postup je zpravidla nahrazen automatickým ředěním již od nižších koncentrací Test detekující Hook efekt - při nadbytku antigenu u imunoturbidimetrických stanovení (Prozone Check) - koncentrace antigenu je tak vysoká, že dochází k rozpouštění precipitátu sejmout0023 Pracovní rozsah (technický limit )– výsledky, které leží mimo technický limit jsou označeny chybovým hlášením a nesmí být vydány dokud nejsou změřeny bez chybového hlášení - nejčastěji po naředění – souvisí s rozsahem kalibrace Repeat limit – výsledky mimo repeat limit jsou technicky správně, jsou pouze mimo limit zvolený laboratoří pro opakování (silně patologické hodnoty) sejmout0008 Instalace metod jiného dodavatele (než dodavatel analyzátoru) G:\Roche\Export\Screenshots\cobas c 8000 DM 2018-11-23T121126.png G:\Roche\Export\Screenshots\cobas c 8000 DM 2018-11-23T121147.png Vkládání reagencií od jiného dodavatele (než dodavatel analyzátoru) G:\Roche\Export\Screenshots\cobas c 8000 DM 2018-11-23T121327.png Mez stanovitelnosti •Spodní hranice pracovního rozsahu • (Chemiluminiscenční a fluorescenční techniky patří k nejcitlivějším metodikám - řádově fento až zeptomoly (10-15 až 10-21 molu) • Vybrané charakteristiky automatických metod •Minimální reakční objem: •Významná charakteristika analyzátoru •Dříve se od něho odvíjela cena •V současnosti asi100 ul - šetrné k životnímu prostředí •Některé stroje reagencie předřeďují. Pracují pak s menším objemem (Avia 1650, Siemens) • • •Minimální pipetovací objem – 1 ul: •Minimální objem se týká vzorku, kontrolních a kalibračních materiálů •Reagencie jsou pipetovány proti vzorku většinou minimálně v desetinásobném nadbytku •Při potřebě provést analýzu z menšího objemu vzorku než 1 ul se vzorek předředí Příklady parametrů používaných u automatické analýzy •Analyzátor na klinickou chemii: •Minimální reakční objem: 100 µl •Objem vzorku: 2 – 25 µl •Vlnové délky: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800 nm •Reakční teplota: 37°C •Reakční čas: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 minut • • •Stanovení ISE: •Metody: Na, K, Cl •Objem vzorku: 15 µl •Objem diluentu:: 450ul/vzorek •Ředění: 1 : 31 •Objem vnitřního standardu: 1050 ul/vzorek •Referenční roztok: 130 ul/vzorek •Možnost korekce na nespecifické výsledky • •Existuje možnost vložit korekční faktory – např. pro kreatinin, kdy se u Jaffého metody projevuje vliv reakce proteinů • • Pořadí přidávání reakčních komponent •Existují dva typy pipetování • • •1. Nejdříve se pipetuje vzorek (jehla se musí dotknout dna) a potom činidlo - př. analyzátory řady Cobas, Roche • • •2. Nejprve se pipetuje činidlo (výplach jehly vodou), potom vzorek – př. analyzátory Integra, Roche • Chyba přenosem – carry over •Chybové hlášení u vzorku s nízkou koncentrací po vzorku s vysokou koncentrací (automatické opakování u imunochemických analyzátorů) • •Test na tuto chybu Močový mikroskopický analyzátor •Výběr jednotek • - µl/ml • - na zorné pole (není doporučeno) • •Založení kategorie od určitého počtu elementů – např. kvasinky > 5 • spermie > 3 • •Instalace jednotlivých šarží kontrol a kalibrátorů • •Chybová hlášení •