Lékařská mykologie Iva Kocmanová •…houbové infekce kůže a kožních adnex jsou čtvrtou nejčastější lidskou zdravotní komplikací (po zubních kazech, vysokém tlaku a migréně)… • • •vaginální kandidóza cca 75 mil. •chronické aspergilózy cca 6 mil. • •kryptokoková meningitida cca 1 mil. •pneumocystová pneumonie cca 400 tis. •invazivní kandidóza cca 400 tis. •invazivní aspergilóza cca 200 tis. • •/za rok • Prolog zdroj: WHO Úvod Houby jsou organismy eukaryotní (pravé jádro; mitochondrie), jednobuněčné i vícebuněčné, heterotrofní, buněčná stěna složená z polysacharidů (chitin; glukan; galaktomanan; manan etc.). Mykologie nauka o houbách (řec. mykes, lat. fungi) Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy 1. Morfologie; základní pojmy Hyfa: houbové tělo bez ohledu na diferenciaci Mycelium: jen vegetativní část, žádný reprodukční orgán, zajišťuje výměnu látek a energie mezi houbou a prostředím Reprodukční struktury: sporangiofory, konidiofory, stromata, plodnice, mikrokonidie, makrokonidie, blastokonidie etc. 1. Rozmnožování hub anamorfa (nepohlavní stadium) + teleomorfa (pohlavní stadium) = holomorfa ANAMORFA A TELEOMORFA Penicillium repens (anamorfa) a Eurotium repens (telemorfa) - zdroj:www.myko.cz meióza (spory) mitóza (konidie) 1. Názvosloví hub •složité, pořád se měnící (genetika + názorové střety systematiků J) • •většina medicínsky významných hub se vyskytuje jako anamorfa (nepohlavní stadium) Candida krusei Issatchenkia orientalis Scedosporium apiospermum Pseudoallescheria boydii Penicillium Eupenicillium, Talaromyces Aspergillus Eurotium, Emericella, Petromyces, Neosartoria anamorfa teleomorfa 1. Názvosloví hub Penicillium Eupenicillium, Talaromyces Aspergillus Eurotium, Emericella, Petromyces, Neosartoria anamorfa teleomorfa …ale – „one fungus – one name“ International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants (Melbourne Code) adopted by the Eighteenth International Botanical Congress Melbourne, Australia, July 2011. a) kvasinky a jim podobné •mikroskopicky kulaté nebo protáhlé buňky, 3-6 x 3-15 µm •obvykle nepohlavní rozmnožování pučením a dělením •na pevných půdách kolonie podobné bakteriálním rody Candida, Trichosporon, Cryptococcus etc. 1. …mezitím v klinické praxi b) vláknité houby (plísně) •složeny ze soustavy hyf (mycelium) jednobuněčné/mnohobuněčné •obvykle nepohlavní rozmnožování rozrůstáním hyf, nebo vegetativní „spory“ •na pevných půdách vláknité povlaky rody Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Alternaria, Trichophyton, Microsporum etc. c) dimorfní houby •růst ve dvou formách (kvasinkové a vláknité) v závislosti na teplotě •importované (endemické) mykózy (Severní i Jižní Amerika, Dálný Východ) • rody Histoplasma, Blastomyces etc. d) ty, co se nikam nevešly •přeřazeny z prvoků díky studiu genomu •nekultivovatelné (nebo obtížně) Pneumocystis jiroveci, Microsporidium spp. etc. 1. …mezitím v klinické praxi D:\Dokumenty\Mykologie\studenti\1_mikroskopie\17_Pneumocystis_3_jpg.jpg Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy 2. Patogeneze mykóz Textové pole: • • • Houby až na výjimky (dermatofyta, endemické mykózy) nejsou primárně patogenní (mohou kolonizovat kůži i GIT…), ale jsou oportunními patogeny ke vzniku onemocnění napomáhá přítomnost nějaké predispozice hostitele, tj. rizikové faktory (např. onkologická onemocnění a jejich léčba, léčba kortikoidy, diabetes, pobyt na JIP, nezralí novorozenci – ale i léčba antibiotiky, vlhká zapářka apod) 2. Dělení mykóz Lokální (povrchové, slizniční) infekce infekce kůže, kožních adnex a sliznic (dermatomykózy a kandidózy) Celkové, neboli invazivní infekce sepse (nejč.kandidové), pneumonie (nejč.aspergilové), diseminované mykózy Mykotoxikózy obvykle alimentární otravy způsobené toxiny hub (Claviceps purpurea, Aspergillus etc.), které kontaminují potravu (ergotismus – oheň sv. Antonína, aflatoxiny..) Alergická onemocnění přecitlivělost na části hub (konidie, části hyf..) Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy 3. Antimykotika dle chem. struktury •alyeny (amfotericin a jeho lipidové formy, nystatin) • •azoly (flukonazol, itrakonazol, vorikonazol, clotrimazol, isavukonazol...) • •echinokandiny/triterpenoidy (caspofungin, micafungin, anidulafungin, ibrexafungerp…) • •antimetabolity (flucytosin) • •alylaminy (terbinafin) • •ostatní (k.undecylová, ciclopiroxolamin) 3. Alyeny Ergosterol Amphotericin B, jeho lipidové formy, nystatin Binding to ergosterol, Intercalation of cell membrane K+ Na+ Ca++ Ca++ Na+ K+ Leakage of intracellular cations and proteins nefrotoxické Princip – změna permeability buněčné membrány Cell membrane Ergosterol Azoly (flukonazol, vorikonazol, posakonazol..) Squalene Ergosterol Synthesis Pathway Toxic sterols Accumulation of toxic sterols in cell membrane Inhibition of 14-alpha-demethylase hepatotoxické, mnoho interakcí 3. Azoly Princip – inhibice syntézy ergosterolu (cytochrom P450) Mannoproteins ß(1,6)-glucan ß(1,3)-glucan Chitin Phospholipid bilayer of cell membrane ß(1,3) glucan synthase glucan synthase inhibitor Inhibition of ß(1,3) glucan synthase takřka bez nežádoucích účinků, drahé 3. Echinokandiny Princip – inhibice syntézy glukanu Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy 4. Vyšetřovací metody - možnosti Textové pole: • • • •mikroskopie • • •kultivační metody • • •imunologické metody (stanovení antigenu nebo protilátek) • • •molekulárně-biologické metody 1. a) nativní preparát •kultury •nespecifická barvení (Lugol), •specifická barvení (MycoInk, Rylux – vážou se na chitin) 4. Mikroskopie 56 •rýžový agar (kultura) Myco Ink b) fixovaný preparát •obecná barvení (Gram) •speciální barvení (imunofluorescence, Groccot, Gram-Weigert …) punktát z jater - Gram • • • CAVE Hodnocení č.1: …netypické pro kryptokokózu, nelze vyloučit blastomykózu, kokcidioidomykózu… Hodnocení č.2: …hluboká mykóza, morfologie netypická pro žádnou jednotku… Zařadit houbu do rodu či druhu dle mikroskopického preparátu vyžaduje velkou zkušenost a mnohdy to ani nelze! T. rubrum; hluboká dermatomykóza u pacienta po transplantaci srdce 4. Kultivační metody kandida_miska č.1: Sabouraudův agar s glukózou (s antibiotiky) další speciální média… •pro dourčení kvasinek (chromogenní agary) •pro testování citlivosti (RPMI 1640, MH s glukózou a metylenovou modří) •rýžový, rajčatový, bramborový agar… Kultivační metody umožňují izolát zařadit do rodu a druhu (pomocí makro a mikromorfologie na různých agarech; kvašení či utilizace cukrů, nebo jiných látek; proteomiky, PCR) a otestovat citlivost k antimykotikům. •standardní metodiky (EUCAST/CLSI) •komerční kity (ETEST, Sensititre) Chybí oficiální breakpointy pro celou řadu rodů a druhů, interpretace minimálních inhibičních koncentrací nebo velikosti zón je z toho důvodu mnohdy jen orientační. A Pragmatic Approach to Susceptibility Classification of Yeasts without EUCAST Clinical Breakpoints (2022) Karen Marie Thyssen Astvad et al 4. Stanovení citlivosti …pro dobrou prognózu pacienta s invazivní mykózou je zcela zásadní časné zahájení účinné léčby à velký důraz je proto kladen na časnou diagnostiku (tj. imunologické a molekulárně-biologické metody) mortalita IA & čas zahájení léčby Von Eiff, Respiration, 1995 •latexová aglutinace, ELISA, limulus test, imunochromatografie… • • •a) antigeny buněčné stěny hub •invazivní aspergilóza (galaktomanan) •invazivní kandidóza (manan) •invazivní kryptokokóza (glukuronoxylomanan) •invazivní mykóza (glukan) • • •b) protilátky •endemické mykózy • (histoplazmóza, kokcidioidomykóza..) •alergické stavy • • • 4. Imunologické metody stěna aspergilus fumigatus ASPERGILÓZA galaktomanan, extracelulární glykoprotein •prospektivní skríning vhodný pro pac. bez antiaspergilové profylaxe •senzitivita je nejvyšší pro hematologické neutropenické pacienty (ostatní skupiny nižší), •cross reaktivita (histoplazmóza, fuzarióza, talaromykóza) MYKÓZA glukan •nezachytí mukormykózy a kryptokokózy •panfungání (nutno dotestovat dalšími metodami) •nevhodné testovat tekutinu z BAL, omezená data pro děti •falešné pozitivity (kontaminace) KRYPTOKÓZA glukuronoxylomanan •pro non-HIV pacienty falešně negativní z krve (až 30%), •cross reaktivita (trichosporonóza) KANDIDÓZA manan •není v kritériích pro dg. IC, různá senzitivita pro různé druhy kandid •v případě tvorby protilátek rychlá eliminace antigenu z oběhu Protilátky •pro dg. IFI nevhodné, vhodné pro dg.chronických a alergických forem Kombinace Ag/Ab/další markery •BG + prokalcitonin; GM + BG + IL-6, IL-8; BG + presepsin •zatím jen výzkum BAL bronchoalveolární laváž IFI invazivní houbová infekce Serology anno 2021 fungal infections: from invasive to chronic (2021) Cornelia Lass-Fl€orl et al Diagnosis and management of Aspergillus diseases: executive summary of the 2017 ESCMID-ECMM-ERS guideline (2018) A.J. Ullmann et al CAVE •rychlé (časná diagnóza) • • •velmi senzitivní • • (mohou detekovat jen několik kopií genu v reakci a dokonce méně než • jeden genom) • •variabilní • • (lze využít jak konzervované, tak variabilní úseky genomu a navrhnout • panfungální nebo specifickou PCR pro určité rody nebo druhy) • • •kvantifikací lze odlišit kolonizaci od aktivní infekce • • 4. Molekulárně - biologické metody • • • metoda pozitiva úskalí mikroskopie •vysoká PPV (pro validní materiál) •čas, cena •v případě histologických preparátů průkaz invaze do tkáně •nelze rod, druh ani viabilitu •senzitivita (pozdní stadia u IFI) kultivace •rod, druh, viabilita, citlivost k antimykotikům •vysoká PPV (pro validní materiál) •prodloužený čas odezvy •obtíže při interpretaci kolonizace vs kontaminace vs infekce imunologie •senzitivita (časná stadia IFI) •vysoká NPV •monitorace léčebné odpovědi (GM) •spolehlivost se liší pro různé skupiny pacientů (hematologické malignity ˃ běžná populace) •falešné pozitivity, senzitivita klesá s terapií •cena molekulární biologie •rod, druh, kvantifikace •senzitivita (časná stadia IFI) •vysoká NPV •nelze viabilitu •cena •obtíže při interpretaci kolonizace vs kontaminace vs infekce IFI – invazivní houbová infekce PPV – pozitivní prediktivní hodnota NPV – negativní prediktivní hodnota validní materiál = materiál odebraný z místa infekce 4. Vyšetřovací metody - shrnutí Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy Stanovení diagnózy je komplexní… ürizikové faktory (onkologická onemocnění a jejich léčba, léčba kortikoidy, diabetes, pobyt na JIP, nezralí novorozenci – ale i léčba antibiotiky, vlhká zapářka apod.) üklinické příznaky (pozitivní HRCT plíce, CNS, horečka, vyrážka, soor apod.) ümikrobiologické výsledky (kultivace a mikroskopie, sérologie, PCR) Pro dg. invazivní infekce platí tzv. EORTC/MSG kritéria (infekce prokázaná, pravděpodobná a možná) 5. Kandidóza Původci: C. albicans (% v závislosti na populaci) ostatní kandidy (C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis – ale i rod Trichosporon, Saccharomyces etc. Infekce: •invazivní – sepse nebo diseminovaná infekce •neinvazivní - onychomykóza, kožní kandidóza, vaginální kandidóza… V malém množství patří kvasinky do běžné flóry kůže či GIT, z čehož plyne, že kandidózy jsou obvykle endogenního původu Mikrobiologická diagnostika: a) kultivace a mikroskopie b) nekultivační •glukan (BG) •PCR 5. Aspergilóza Původci: Aspergillus fumigatus (90%) Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus tereus… Infekce: •invazivní - nejčastěji plicní, možnost diseminace hematogenně • neinvazivní – onychomykózy, otomykózy, alergická broncho-pulmolární… Na rozdíl od kvasinek nejsou aspergily součástí běžné flóry člověka a infekce jsou tedy obvykle exogenního původu (stavební práce!!) Mikrobiologická diagnostika: a) kultivace a mikroskopie •ne biochemie - ale mikromorfologie, MALDI, sekvenace b) nekultivační •galaktomanan, glukan •PCR http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/Aspergillus%20flavus_0.jpg 5. Zygomykóza Původci: Rhizopus spp. (až 50%) Mucor spp., Absidia spp., Rhizomucor spp., Cunninghamella spp. exogenní (stejně jako aspergilózy), méně časté Infekce: •invazivní - rhinocerebrální, plicní, sinusitidy, možnost diseminace hematogenně • neinvazivní – onychomykózy, otomykózy… Mikrobiologická diagnostika: a) kultivace a mikroskopie •ne biochemie - ale mikromorfologie, MALDI, sekvenace b) nekultivační •bez serologických metod!! •PCR 5. Fusarióza Původci: Fusarium solani (až 50%) F. oxysporum, F. verticillioides… Infekce: •invazivní - nejčastěji plicní, u imunokompromitovaných až v 70% diseminace!! •neinvazivní – onychomykózy, otomykózy, keratitidy (čočky) exogenní (stejně jako aspergilózy), méně časté Mikrobiologická diagnostika: a) kultivace a mikroskopie •ne biochemie – ale mikromorfologie, MALDI, sekvenace •u diseminovaných pozitivní hemokultura!! b) nekultivační •glukan (BG) •PCR 10_1198105200 petris 5. Kryptokokóza Původce: C. neoformans, C. gatii Infekce: •invazivní - primárně plicní, při diseminaci má afinitu k CNS (meningitidy), často první příznak rozvíjejícího se AIDS (Afrika!) •neinvazivní - kožní exogenní (rezervoár- holubí trus), raritní Mikrobiologická diagnostika: a) kultivace a mikroskopie •v mikroskopickém preparátu typické polysacharidové pouzdro b) nekultivační •glukuronoxylomanan •PCR cry1_l 5. Pneumocystová pneumonie Původce: P. jiroveci (na počest českého parazitologa prof.Jírovce) – původně prvok, přeřazeno k houbám na základě studia genomu Infekce: •invazivní - plicní, často první příznak rozvíjejícího se AIDS, komplikace u neutropenických pacientů •neinvazivní – nejsou exogenní (ubikvitní), raritní Mikrobiologická diagnostika: a) kultivace a mikroskopie: •jen mikroskopie b) nekultivační •glukan (krev, tekutina z BAL) •PCR (tekutina z BAL) fig85_2 pcpcysta © E.Keiser 5. Dermatomykózy a ostatní •Původce: •Trichophyton spp., Microsporum spp., Epidermophyton floccosum) • •Infekce: •tinea – dle lokalizace capitis, corporis, manus, pedis, unguium - onychomykózy) •(pozn. dermatofyta mohou vzácně způsobit i hlubokou mykózu u imunokompromitovaných pacientů •(mechanické zanesení houby do podkoží), případně diseminovanou mykózu • •keratomykóza - Malassezia furfur KOHtineaversicolor Mikrobiologická diagnostika: a) kultivace a mikroskopie: •mikroskopie (speciální barvení) •kultivace až 6 týdnů b) nekultivační •neprovádí se (případně u diss.infekcí glukan) Nové výzvy v mykologické diagnostice •cca 1,5 mil. úmrtí v souvislosti s houbovými infekcemi/rok • •př. mortalita kryptokokové meningitidy se pohybuje mezi 20-100% v závislosti na správné a rychlé diagnostice a s tím spojené účinné léčbě • •kultivace je oprávněně považována za „zlatý standard“ diagnostiky, ale… •důraz na nekultivační metody: imunochromatografie (LFA/LFD), ELISA, limulus test (ACC a Wako) •molekulárně-biologické metody (zatím s výhradami) SSS revoluce (Speed Simplicity Sensitivity) The SSS revolution in fungal diagnostics: speed, simplicity and sensitivity (2023) J. Baker et al C. auris •umí se chovat jako nozokomiální patogen (perzistence v prostředí i v mikrobiomu kolonizovaných pacientů) • •outbreaky! • •častá rezistence (azoly, echinokandiny, alyeny) • •vysoká schopnost tvořit biofilm • •vysoká mortalita v případě invaze (až 60%) •lékem volby echinokandiny • • •vyhledávací chromagary (CHROMagar Candida Plus, GALI) •MALDI-TOF (Bruker, BioMérieux), RUO databáze, konkrétní verze viz www.cdc.gov •real-time PCR www.cdc.gov • velký selekční tlak (spotřeba) ATM v zemědělství i klinické praxi • limitovaný počet systémových antimykotik (nově ibrexafungerp a rezafungin) •Primární rezistence (příklady) Cryptococcus spp., Magnusiomyces spp. vs echinokandiny C. krusei vs flukonazol, A. terreus vs amfotericin •Získaná rezistence - k amfotericinu velmi vzácná - k azolům kombinace mechanismů (mutace na cytochromu P450, eflux, biofilm) - k echinokandinům (mutace FKS) - MDR (multidrug resistance) – C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata Výzvou je detekce rezistencí nekultivačními metodami (MALDI-TOF a PCR), zatím ale není použitelná pro rutinu (např. stejný fenotyp rezistence může být způsoben různými mutacemi). Rezistence Drug-Resistant Fungi: An Emerging Challenge Threatening Our Limited Antifungal Armamentarium (2020) A.Arastehvar et al •muž, 20 let •autonehoda s následným požárem •popáleniny na 88% tělesného povrchu, mnohočetné zlomeniny, kontuze plic •v anamnéze transplantace jater před 2 lety, pacient na imunosupresivní terapii, která byla po domluvě s hepatologem redukována na minimum • • • Kazuistika III. Obsah obrázku osoba, interiér Popis byl vytvořen automaticky Lipový 2021 in review 2. den •již 3.den hospitalizace se na otiscích z popálených ploch objevuje Trichoderma longibrachiatum, ke které se za dalších pět dní přidává Aspergillus fischeri (celkem bylo pozitivních přes 50 vzorků v období 5 měsíců) •T. longibrachiatum (Hypocreaceae) je saprofytická, ubikvitní houba, nachází se zejména v půdě (diskutují se její fungicidní účinky) •A. fischeri je blízce příbuzný A. fumigatus •oba kmeny byly dourčeny sekvenací, získané sekvence jsou dostupné v databázi GenBank® • • • • • • • • • • Kazuistika III. Foto: I.Kocmanová otisk (směs TL + AF) Lugol 10x40 (TL) vpichové kultury (TL + AF) •stanovena MIC (metodou ETEST) pro • amfotericin B; vorikonazol; posakonazol a isavukonazol: • 0,5; 0,25; 0,25 a 0,5 mg/l (Aspergillus sp.) • 0,5; 0,25; 2 a 2 mg/l (Trichoderma sp.) • • • • • • • • •nález byl potvrzen i histologicky (invaze houby do viabilní tkáně) •po dobu hospitalizace byl 1 x týdně prováděn skríning galaktomananu a glukanu z krve, vždy s negativním výsledkem (imunokopromitovaný pacient) • • • • • • • • • • • • Kazuistika III. •na horní končetiny byla aplikována dermální náhrada Nevelia® (Francie) (dvouvrstvá matrice složená ze silikonu a bovinního kolagenu), která pomáhá minimalizovat poškození svalů •první aplikace skončila bohužel odhojením, kultivačně zachyceny obě houby •na základě toho nasazen vorikonazol ve standardní dávce •po dosažení kultivační negativity (asi 3 týdny) byla aplikována nová dermální náhrada, která se již přihojila úspěšně • • • • • • • • přihojená dermální náhrada •pacient byl po asi pětiměsíční hospitalizaci propuštěn do domácího ošetřování (s funkčními pažemi) • • • • • • • • • • • • Kazuistika III.