KLINICKÁ MIKROBIOLOGIE- SHRNUTÍ Ivana Vítková Masarykova univerzita Katedra laboratorních metod Klinická mikrobiologie • •Zajišťuje diagnostiku infekčních onemocnění vyvolaných baktériemi, viry, parazity a mykotickými agens •Stanovuje citlivost/rezistenci mikrobiálních agens k antimikrobiálním látkám •Ve spolupráci s klinickými lékaři poskytuje konzultace mikrobiologického nálezu a antimikrobiální terapie •Vyšetření biologického materiálu • •Stanovení pravděpodobného původce infekce • •Stanovení citlivosti k antibiotikům • Klinická mikrobiologie • • •Správný výsledek mikrobiologického vyšetření • •začíná správným odběrem biologického materiálu • •a jeho rychlým transportem do mikrobiologické laboratoře Vyšetření biologického materiálu •Zhotovení mikroskopického preparátu •Kultivace •Průkaz antigenů •Průkaz metabolitů (Helicobacter pylorii -ureáza) •Průkaz nukleových kyselin (PCR) •Průkaz protilátek (nepřímý průkaz) Mikroskopie vNativní preparát (např. Trichomonas vaginalis) • vBarvený preparát •Barvení dle Grama •Barvení dle Giemsy •Barvení dle Ziehl- Nielsena •Barvení spor •Barvení pouzder •Fluorescenční barvení (např. Pneumocystis jirovecii) • • Barvení podle Grama •Hans Christian Joachim Gram, 1884 •Dělí bakterie do dvou základních skupin • •Grampozitivní G +, modrofialové •Gramnegativní G -, růžovočervené • Dánský bakteriolog, odlišnost buněčné stěny G+ a G- baktérií C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\P1010227.jpg Barvení podle Grama- význam •Diagnostické barvení – základ klasifikace a taxonomie bakterií •Možnost okamžité a racionální antibiotické terapie (mikroskopie pozitivních hemokultur, sputa) Mikroskopie hemokultur, sputa Fluorescenční barvení •Pomocí fluoreskujícího barviva •Imunofluorescence •Na hledaný antigen se naváže protilátka označená fluoreskujícím barvivem •Pozorování pomocí fluorescenčního mikroskopu Kultivační průkaz •Základní mikrobiologický postup •Cílem je: • üZískat mikroba z klinického materiálu v čisté kultuře üIdentifikovat ho üUrčit citlivost k antibiotikům • Kultivační průkaz •Kultivační půdy (tuhé, tekuté, diagnostické, selektivní, selektivně diagnostické…) • •Očkování biologického materiálu • •Diagnostická antibiotika • •Kalibrované kličky Podmínky kultivace •Dostatečná vlhkost prostředí •Optimální teplota - 37° C (4° C, 40° C) •Optimální pH půdy – 7,2 – 7,4 •Dostatek vhodných živin •Vhodné plynné prostředí (aerobní, anaerobní, mikoraerofilní kultivace) Jmenovat nějaké anaerobní baktérie Anaerostat P1010162 Identifikace bakterií •Podle morfologie •Podle růstových vlastností • •Podle biochemických vlastností •Selektivní půdy •Komerční diagnostické soupravy • •Podle antigenní struktury •Latexová aglutinace • •Hmotnostní spektrometrie (MALDI TOF) • • • http://mikrobiologie.lf3.cuni.cz/rep/graphics/clump1.jpg Identifikace bakterií- morfologie a růst •Typický růst některých baktérií •Morfologie kolonií •Hemolýza PSAE, STAU, STPN MacConkey agar a krevní agar nárůst E.coli ESCO- izolace na KA+McC Identifikace bakterií- MALDI •Výhody hmotnostní spektrometrie (rychlost) •Úskalí dokonalé identifikace Identifikace bakterií- biochemie P1010151 •Většinou nahrazeno metodou MALDI TOF • •V některých případech ale nutné (E.coli x Shigella spp.) Identifikace bakterií- průkaz antigenů • •Latexová aglutinace •Rychlá vyšetřovací metoda • Identifikace - průkaz antigenů •Mykologie- stanovení antigenů hub pomocí ELISA • •Galaktomanan (aspergilový antigen) • •Glukan (panfungální antigen- vysoká negativní prediktivní hodnota) • Kultivace- hodnocení •Nález primárního patogena- většinou jednoznačná situace (Neisseria gonorrhoeae) • •Nález oportunního patogena- nutné informace o pacientovi a komunikace s klinikem! • častější situace Stanovení citlivosti k antibiotikům •Disková difúzní metoda • •Stanovení hodnot MIC antibiotika vůči danému mikroorganismu • •Semikvantitativní metody (mykoplazmata, ureaplazmata) Stanovení citlivosti k antibiotikům •Disková difúzní metoda • •Difuze antibiotik z disků do půdy a potlačení růstu baktérií •Srovnání se standardy •Vyhodnocení a zařazení • do kategorií C/I/R Stanovení citlivosti k antibiotikům •Stanovení MIC: diluční testy • •Stanovení koncentrace antibiotika, která potlačuje růst mikroba (MIC) •Srovnání se standardy •Vyhodnocení a zařazení • do kategorií C/I/R • Stanovení MIC– E-test C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\P1010087.JPG Diagnostika virových infekcí 1.Přímá- , mikroskopie, tkáňové kultury, průkaz antigenu, nebo nukleové kyseliny viru 2. 2.Nepřímá- průkaz protilátek Přímý průkaz viru •Mikroskopický průkaz- elektronový mikroskop • •Izolace viru na tkáňových kulturách- pěstování viru na kulturách buněk (opičí ledviny)- cytopatický efekt Průkaz nukleových kyselin viru •polymerázová řetězová reakce •přímý průkaz NK virů (bakterií, kvasinek, parazitů) •různé modifikace • •výhody: vysoká specificita, rychlost, ATB nejsou kontraindikací vyšetření •nevýhody: vysoká cena, přístrojové vybavení, riziko kontaminace Průkaz protilátek •Průkaz odezvy makroorganismu na infekční agens • •Používané také u obtížně kultivovatelných baktérie (chlamydie, borélie) • • Dotaz- co je ELISA? Přehled serologických metod 1.Precipitace 2.Aglutinace 3.Komplement fixační reakce (KFR) 4.Neutralizace 5.Reakce se značenými složkami: • - imunofluorescence • - enzymová imunoanalýza • - Western blot (imunoblot) • • • •Klinická mikrobiologie- poskytuje servis vyšetření klinickým lékařům v úzké spolupráci s nimi •Stanovuje různými metodami původce daného onemocnění •Konzultace mikrobiologického nálezu •Konzultace antibiotické terapie •Rychlost, kvalita • •Vzájemná komunikace! ‹#› •Kazuistika 2: pacient s hlubokým abscesem • •Muž, řidič kamionu, věk 53 let, po prodělaném erysipelu na bérci dříve •Bydlí doma s otcem, otec bez abscesů •Cestovatelská anamnéza: nyní na cestě z Německa, cesty po Evropě • •12.9.2023 – ošetřen na chirurgické ambulanci FN Brno, před 3 dny se objevilo zarudnutí na bérci, které se zvětšuje. Pod kolenem je kožní defekt, distálně pustulka, okolí indurované s flegmónou, CRP 76, leu 14,3 x 109 g/l. Pacient byl odeslán na ambulanci Kliniky infekčních chorob FN Brno (KICH). Zde aplikován P-PNC. • •13.9.2023 – příjem na KICH – subfebrílie, na bérci prasklý absces, flegmóna v okolí asi 20 cm a táhne se po vnitřní straně stehna ke tříslu. Vstupně nasazen G-PNC 5 MIU/6h. • •14.9.2023 – při převazu evakuace většího množství hnisu, provedena incize fascie, dutina do hloubky 4 cm, zaveden drén. Antibiotická terapie byla upravena na oxacilin 3g/6h. + klindamycin 900mg/8h. • • ‹#› •Kazuistika 2: pacient s hlubokým abscesem • •15.9.2023 – zarudnutí v okolí defektu v rozsahu asi 15 cm, defekt zející, vytéká hustý hnis, výměna drénu, lokální terapie. Kultivačně z rány prokázán S. aureus MRSA, následně PVL+, změna terapie na linezolid 600mg/12h. • •16.9.2023 – ustupující otok a zarudnutí, bez sekrece •18.9.2023 – subjektivně zlepšení, objektivně ještě inflamace 10x4cm, defekt s nekrotickými tkáněmi, drén in situ, nekrektomie •21.9.2023 – výrazné zlepšení lokálního nálezu, pacient propuštěn • •Linezolid podáván celkem 7 dní i.v. za hospitalizace, doporučeno ještě 7 dní p.o. terapie •Pacient hospitalizován 9 dní na KICH a poté propuštěn do péče ambulantního chirurga •Pacient poučen o dekolonizaci a režimových opatřeních • • Děkuji za pozornost