Chromatografické metody
RNDr. Alena Mikušková
FN Brno – Dětská nemocnice, ODHB
CHROMATOGRAFIE
 Separační (dělící) metoda a současně
 Analytická metoda - poskytuje kvalitativní a kvantitativní informaci o vzorku
 Využívá distribuce látek mezi dvě fáze
• Stacionární (nepohyblivou) – pevná látka nebo na povrchu pevné látky fixovaná
kapalina
• Mobilní (pohyblivou) – kapalina nebo plyn
Fáze = homogenní část heterogenního
systému oddělená od okolí fázovým
rozhraním
 Objevitel - ruský botanik Cvět
– přelom 19. a 20. století
– dělení rostlinných pigmentů
První chromatograf
CHROMATOGRAFIE
Metoda založená na rozdílné afinitě dělených látek ke stacionární
(nepohyblivé) a mobilní (pohyblivé) fázi (SF, MF)
Princip:
 Mobilní fáze proudí přes nosič nebo kolonu, obsahující stacionární fázi
 Během pohybu mobilní fáze dochází k distribuci komponent směsi mezi
obě fáze - jednotlivé složky směsi procházejí systémem různou
rychlostí:
• látky s vyšší afinitou ke stacionární fázi migrují pomaleji
• látky s nižší afinitou ke stacionární fázi migrují rychleji (zůstávají přednostně
v mobilní fázi)
Klasifikace chromatografických metod
- Podle uspořádání systému
Chromatografie plošná (planární)
– Papírová chromatografie
SF (H2O nebo polární
rozpouštědlo) zakotvena na
vláknech papíru
– Chromatografie na tenké vrstvě, TLC
• SF (silikagel, alumina, celulóza,
aj.) rozprostřená na inertní
podložce (sklo, Alu-fólie, plast)
Chromatografie kolonová (sloupcová)
- SF (silikagel, polymer,…) tvoří náplň
kolony
- nebo nanesena nebo chemicky
navázána na nosné částice
- nebo nanesena přímo na vnitřní
povrch kolony
- dle mobilní fáze - LC, GC
Klasifikace chromatografických metod
- Podle skupenství mobilní fáze
– plynová (gas chromatography, GC) – plynná MF
– kapalinová (liquid chromatography, LC) – kapalná MF
- Podle složení mobilní fáze
– izokratické dělení - mobilní fáze má po celou dobu dělení konstantní
složení
– dělení s proměnlivým složením mobilní fáze
• stupňovitá eluce
• gradientová eluce
- Chromatografie podle účelu
– Preparativní chromatografie - pro přípravu většího množství čistých
látek
– Analytická chromatografie - pro určení identity a koncentrace látek ve
směsi
Klasifikace chromatografických metod
- Podle separačního mechanismu
■ Iontoměničová chromatografie (ionexová, ion-exchange, IEC)
 výměna iontů elektrostaticky vázaných na nabitém povrchu SF a iontů v roztoku
 SF - iontoměnič (ionex): částice gelu (syntetické pryskyřice) s navázanými nabitými
funkčními skupinami (kyselými nebo bazickými):
• Katexy (umožňují výměnu kationtů)
• na nosné částici navázány silně nebo slabě kyselé funkční skupiny
• Anexy (umožňující výměnu aniontů)
• silně nebo slabě bazické funkční skupiny
 Na těchto skupinách vázán opačně nabitý ion (zachování elektroneutrality)
 Tento ion je na začátku analýzy vyměněn za ionty analytů ze vzorku
 Složky dělené směsi jsou z kolony eluovány
 postupnou změnou pH mobilní fáze
 a/nebo změnou iontové síly MF
 IEC umožňuje dělit ionty
• nízkomolekulární - aminokyseliny, nukleotidy,…
• vysokomolekulární - peptidy, proteiny, nukleové
kyseliny, oligonukleotidy,…
Klasifikace chromatografických metod
- Podle separačního mechanismu
Rozdělovací chromatografie
Založena na distribuci látek mezi dvě nemísitelné tekutiny (tj. rozpustnosti v SF, MF)
Stacionární fáze = kapalina, která může být
– naadsorbována nebo chemicky navázána na pevném nosiči
 např. na vláknech papíru u papírové chromatografie, na nosných částicích u HPLC
 nanesena na vnitřním povrchu kapilární kolony (GLC)
Mobilní fáze = kapalina nebo plyn
– plynová chromatografie (gas-liquid, GLC, zjednodušeně GC)
– kapalinová (liquid-liquid, LLC, zjednodušeně LC) ve dvou provedeních:
• LLC s normální fází - SF polární, MF méně polární
• LLC s obrácenou fází - SF nepolární, MF polární (častěji používané provedení)
Klasifikace chromatografických metod
- Podle separačního mechanismu
Adsorpční chromatografie
Dělení založeno na rozdílech v adsorpci a desorpci látek
na pevný povrch sorbentu
– (elektrostatickými silami, vodíkovými můstky nebo
disperzními silami)
Klasifikace chromatografických metod
- Podle separačního mechanismu
Gelová permeační chromatografie
 umožňuje dělit molekuly podle jejich velikosti a tvaru
 SF = gelové částice kulovitého tvaru (na bázi polysacharidů nebo polyakrylamidu) s
póry definovaných rozměrů
 Molekuly, jejichž průměr je menší než průměr pórů, difusním pohybem vnikají do
vnitřních prostor gelových částic, čímž jsou na koloně zadržovány
 velké molekuly, které se nedostanou do pórů, jsou unášeny proudem MF a vytékají
z kolony dříve
Klasifikace chromatografických metod
- Podle separačního mechanismu
Afinitní chromatografie
využívá specifické interakce molekul:
 interakce biologické povahy
• enzym - substrát
• enzym - inhibitor
• antigen - protilátka
• receptor - hormon apod.
 biologickou interakci napodobující
• bílkovina - triazinové barvivo
• bílkovina - kovové ionty apod.
Jeden z partnerů (tzv. ligand) - pevně navázán na nosič, kterým je naplněna
chromatografická kolona
V dělené směsi (mobilní fázi) je přítomna řada molekul, z nichž jen některé mají
afinitu k ligandu → navážou se na něj a ostatní složky směsi se z kolony vymyjí
změna složení mobilní fáze tak, aby se oslabila interakce ligand – navázaná
molekula, ta se z kolony uvolní a získá se v relativně čisté podobě
bioafinitní chromatografii lze použít k separaci, izolaci a k čistění složek vzorku
Přehled chromatografických technik
Chromatografie
■ planární
 papírová rozdělovací
 tenkovrstvá TLC (thin layer chromatography)
• tenkovrstvá rozdělovací (SF kapalina)
• tenkovrstvá adsorpční (SF pevná látka)
■ kolonová
 plynová GC (gas chromatography)
• plynová rozdělovací GLC (SF kapalina)
• plynová adsorpční GSC (SF pevná látka)
 kapalinová LC (liquid chromatography)
• kapalinová rozdělovací LLC (SF kapalina)
• kapalinová adsorpční LSC (SF pevná látka)
 gelová permeační GPC
 iontově výměnná IEC
 afinitní (a další)
SF…stac.fáze
Planární
chromatografie
 Nanesení chromatogramu - vzorky na startovní pozici blízko okraje plošného nosiče
(papíru, tenké vrstvy) ve formě malých kapek nebo tenkých čar
 Vyvíjení chromatogramu – v chromatografické vaně:
 spodní konec nosiče ponořen do MF pod úrovní startovací linie
 MF v důsledku kapilárních sil migruje přes SF, unáší s sebou složky směsi
v závislosti na jejich afinitě ke SF
 Vizualizace skvrn - usušený chromatogram lze vizualizovat
• barvotvorným činidlem
• osvícením UV světlem
• fluorescenčně
 Charakteristikou látky je retenční faktor Rf
 hodnota Rf je pro dané uspořádání experimentu stálá
Rf = A / B
A…vzdálenost start – střed skvrny
B…vzdálenost start – čelo rozpouštědla
Planární chromatografie
 Dvourozměrná TLC
• Vyvíjení chromatogramu první
mobilní fází
• otočení usušené destičky o 90 st.
• vyvíjení druhou mobilní fází
• dokonalejší separace
 HPTLC (high perfomance thin layer
chromatography) - tenká vrstva sestává z částic
o malém průměru (4,5 μm)
 Planární techniky - metody kvalitativní nebo
semikvantitativní s vizuálním hodnocením srovnáním
se skvrnami standardů
chromatografovaných na témže nosiči
Kolonová chromatografie
Chromatogram
 grafický záznam odezvy detektoru jako funkce
času, případně objemu:
• Při postupu vzorku kolonou se jednotlivé
složky vzorku separují, tj. dospějí do
detektoru v různých retenčních časech
• eluované analyty graficky znázorněny jako
série vrcholů (píků)
 data reprezentovaná chromatogramem slouží
k identifikaci a kvantifikaci analytů:
- retenční čas tR – kvalitativní charakteristika analytu
- plocha chromatografického vrcholu – kvantitativní
charakteristika
- koncentrace analytu vypočítána na základě porovnání
plochy píku analytu s plochou píku standardu
- plochu píku lze vypočítat jako: výška x poloviční šířka
(h x w1/2)
Kolonová chromatografie
Základní pojmy – popis chromatografického píku:
• tR (min)…retenční čas analytu (doba od nástřiku vzorku na kolonu do průchodu
izolovaného analytu detektorem)
• tM (min)…mrtvý čas kolony (retenční čas analytu, který není v koloně zadržován, tj.
pohybuje se stejnou rychlostí jako MF)
• W1/2 …šířka píku analytu v polovině výšky
• W …šířka píku analytu u základny
• t’R (min)…redukovaný retenční čas analytu (čas, který příslušný analyt stráví ve
stacionární fázi)
t’R = tR – tM
• Obdobně:
- retenční objem VR
- mrtvý objem VM
- redukovaný retenční objem V‘R
V’R = VR – VM
Kolonová chromatografie
 Pro dobré rozdělení dvou sousedních analytů je nutné, aby analyty měly:
 dostatečně rozdílné retenční časy
→ Vhodná volba SF a MF
 dostatečně úzké zóny analytů
→ Dostatečná účinnost kolony
 Účinnost kolony – charakterizuje, jak moc se zóny
separovaných látek rozšiřují vlivem difůze
- Mírou účinnosti kolony je počet
teoretických pater kolony (hypotetický pojem !)
- Teoretické patro – taková část kolony, na které
proběhne jedno ustavení rovnováhy MF – SF
- čím větší počet pater, tím užší zóny látek
- počet pater dané kolony závisí na rychlosti
průtoku MF
Plynová chromatografie, GC
 Mobilní fáze - nosný plyn (nejčastěji inertní plyn - dusík, helium, argon)
 Separace u GC je založena
 na rozdílech tlaku par analytů
 interakcích se stacionární fází
- těkavější analyty se tedy pohybují kolonou rychleji než analyty méně těkavé a navíc analyty
interagující se stacionární fází procházejí kolonou pomaleji než analyty se slabší interakcí
 GSC - separace na základě adsorpce analytů na pevný povrch náplně kolony
 GLC - separace na základě rozdělení mezi plynnou MF a kapalnou SF (netěkavá
kapalina zakotvená na částicích náplně nebo přímo na vnitřním povrchu
kapilární kolony)
 Plynový chromatograf
• zdroj mobilní fáze a zařízení pro kontrolu průtoku
nosného plynu systémem
• dávkovač pro nanesení analytu na kolonu
• chromatografická kolona pro separaci analytů
• termostat (pec) pro regulaci teploty kolony
• on-line detektor pro detekci separovaných analytů
vycházejících z kolony
• PC pro kontrolu systému a vyhodnocení dat
Plynová chromatografie, GC - kolony
Náplňové kolony - starší typ, již málo používané
– trubice (vnitřní průměr řádově mm, délka 1 m a více, sklo
nebo nerez ocel) naplněné nosnými částicemi
– částice náplně jsou samy o sobě stacionární fází (GSC –
sorbenty: modifikovaný silikagel, aktivní uhlí, alumina,
molekulové síto,…)
– částice jsou stacionární fází potaženy (GLC)
 užší kolony
• vyšší účinnost x menší kapacita pro vzorek
 delší kolony
• vyšší účinnost x nutné zvýšené tlaky MF
Kapilární kolony - WCOT (wall-coated open tubular column)
– kapiláry z křemenného skla (vnitřní průměr 0,1 - 0,5 mm,
délka 10 - 150 m)
– na povrchu potaženy polyimidem (pevnost a pružnost)
– vnitřní povrch potažen tenkým filmem SF
– velmi účinné
– malá kapacita pro vzorek
Plynová chromatografie, GC - kolony
Stacionární fáze pro GLC
 netěkavé chemicky inertní kapaliny: methylsilikonové polymery, substituované
silikonové polymery, polyethylenglykoly apod.
 naneseny nebo chemicky navázány přímo na vnitřním povrchu kapilární kolony
 Dostupné i GC mikrokolony na bázi silikonového čipu
Plynový chromatograf
Zdroj nosného plynu a systém kontroly průtoku
 nosný plyn - např. He, Ar, N2, H2 (dle typu kolony a
detektoru)
 nosný plyn musí být velmi čistý a suchý
• trubice s molekulovým sítem odstraňují H2O, uhlovodíky, O2
 nutná řízená rychlost průtoku nosného plynu (pro získání
reprodukovatelných retenčních časů)
• programovatelné elektronické regulační systémy
– náplňové kolony: průtok 10 - 60 ml/min
– kapilární kolony: 1 - 2 ml/min, velké nároky na stabilitu
Dávkovač
 vnáší alikvot vzorku (µl) do kolony
 vzorky rozpuštěné v organickém rozpouštědle dávkovány injekční jehlou přes tzv.
septum do vyhřívaného prostoru
– analyty i rozpouštědlo ihned převedeny do plynné fáze a vneseny do kolony nosným plynem
 split - splitless technika dávkování vzorku na kolonu:
– split mód - do kolony vstupuje pouze malá část zplyněného vzorku
• nedochází k zahlcení kapilární kolony
– splitless mód - do kolony vstupuje většina vzorku
Plynový chromatograf - detektory
 Univerzální detektory - detegují většinu analytů
 Selektivní detektory
Plamenově ionizační detektor (flame ionization detector, FID)
– univerzální detektore pro GC
– efluent z kolony smísen s H2 a vzduchem → analyty spáleny v plameni
– v plameni dochází k ionizaci a vzniklé ionty zvyšují vodivost plamene
NPD (nitrogen – phosphorus detector) modifikace FID
– nad plamen umístěna vyhřívaná kulička soli alkalického kovu (Rb, Cs)
– přítomnost iontů alkalického kovu v plameni zvyšuje signál pro analyty
obsahující dusík a fosfor
Fotoionizační detektor (photoionization detector, PID)
– ionizace intenzivním UV zářením
– selektivní pro UV absorbující látky
Termovodivostní detektor
(thermal conductivity, TCD)
– v přítomnosti analytu v nosném plynu
se zvyšuje tepelná vodivost plynu
– univerzální, jednoduchý, horší citlivost
Detektor elektronového záchytu (electron capture, ECD)
– nosný plyn ionizován radioaktivním β-zářičem
– analyty s elekronegativními skupinami vychytávají
elektrony z β-zářiče → snížení ionizace
Hmotnostní detektor (mass spectrometry detector, MSD)
Plynová chromatografie
Příprava vzorků pro GC analýzu:
 extrakce sledovaných analytů ze vzorku biologického materiálu do organického
rozpouštědla (+ odpaření rozpouštědla z extraktu)
 chemická derivatizace - zvýšení těkavosti a termostability látek pro GC analýzu
(mnoho klinicky významných látek je netěkavých)
– silylace – substituce atomu vodíku funkčních skupin látek silyl-skupinou (R3Si–)
– oximace, acylace, esterifikace
Analýza těkavých látek v kapalných nebo
pevných vzorcích:
 GC v uspořádání head-space
• „head space“ – prostor nad vzorkem (plynná
fáze)
např. stanovení alkoholu v krvi,
analýza zbytků rozpouštědel ve farmaceutických
výrobcích atd.
Kapalinová chromatografie - LC
 Separace založena na rozdělení látek mezi kapalnou mobilní fázi a fázi stacionární
 High perfomance liquid chromatography (HPLC) - jako nosič použity částice malého
průměru (5 µm),
 HPLC - v klinické laboratoři nejrozšířenější forma LC (všechny principy dělení)
Kapalinový chromatograf
• kolona pro separaci analytů
• zásobníky rozpouštědel (mobilní fáze)
• čerpadla pro zajištění průtoku mobilní fáze systémem
• dávkovač pro nanesení vzorku na kolonu
• on-line detektor pro detekci separovaných analytů
• PC pro kontrolu systému, sběr a vyhodnocení dat
HPLC kolona
Náplňové kolony
 běžné kolony - vnitřní průměr 0,1 - 5 mm, délka 50 - 250 mm
 tzv. nanobore kolony - vnitřní průměr 25 - 100 µm
 open-tubular kolony - průměr pod 25 µm
 SF chemicky navázána na povrch částic silikagelu nebo na povrchu polymerních částic
– SF: polární funkční skupiny – HPLC s normální fází (silněji vázané polární látky)
– C18, C8, C4 uhlovodíkové řetězce – HPLC s reverzní fází (silněji vázané nepolární látky)
 částice náplně různé velikosti - průměr 1,8 - 10 µm
Obecně platí:
– kolony s malým vnitřním průměrem a malým vnitřním objemem - vyšší účinnost, nižší limit
detekce, malé objemy MF
– čím menší částice náplně, tím větší je účinnost kolony (ale tím větší je odpor vrstvy náplně
proti pohybu MF)
Monolitické kolony
– vysoká účinnost a nízké zpětné tlaky
– kolona zcela vyplněna pórovitým polymerem
Kapilární kolony pro LC (0,1 - 1 mm vnitřní průměr, 10 - 50 cm délky), SF nanesena na vnitřním
povrchu skleněné kapiláry
Předkolona
– ochrana kolony před ireverzibilní adsorpcí proteinů ze vzorku
– naplněna stejnou nebo podobnou SF jako analytická kolona
Kapalinový chromatograf
Zásobníky s mobilními fázemi
 v nejjednodušší formě skleněné lahve s přívodními hadičkami k čerpadlům
 MF připraveny z čistých rozpouštědel určených pro chromatografii (HPLC grade)
 MF přefiltrovány přes membránový filtr pro odstranění případných pevných částic
 MF zbaveny rozpuštěných plynů – sonikace, vakuové degassery (odplyňovače)
Čerpadla
• čerpadla zajišťují reprodukovatelný, konstantní a bezpulzní průtok MF systémem
• v systému je nutné vyvinout vysoké tlaky (až 250 bar)
(1 bar = 105 Pa = 1,02 atm = 14,5 psi)
 bezpulzní tzv. lineární dávkovač - pro malé průtoky MF
- pracuje na principu injekční stříkačky
 pulzní pístová dvojúčinná (reciproká) čerpadla
- činnost je fázově posunutá pro minimalizaci pulzů
– Vyhlazení pulzů
• tlumič pulzů na principu svinuté odporové kapiláry
• nebo redukce pulzů změnou rychlosti pohybu pístů
 izokratický mód práce čerpadla
- složení MF zůstává konstantní během celé analýzy
 gradientový mód
- změna složení MF s časem - až čtyři složky MF programovatelně směšovány gradientovým
ventilem
Kapalinový chromatograf
Dávkovací zařízení
– šesticestný ventil s vyměnitelnou smyčkou
• objem od desítek nanolitrů po mililitry
• plnící pozice (poloha A) - vzorek se nasaje ze vzorkové nádobky (tzv.
vialky) dávkovací injekční stříkačkou do smyčky
• otočením ventilu do polohy B je obsah smyčky vnesen do proudu mobilní
fáze
• dávkovací ventil je přesný, programovatelný
 Další možnosti
– dávkovače s děličem (obdoba
splitovacího zařízení v GC)
– dávkovače s možností smísení
vzorku s derivatizačním činidlem
před nadávkováním na kolonu
(předkolonová derivatizace)
Kapalinový chromatograf - detektory
 Detektor (s výjimkou MSD) obsahuje průtokovou celu - zde detegovány separované analyty
 generovaný elektronický signál zaznamenán ve formě chromatogramu
 Fotometry a spektrofotometry - měření absorbance UV a VIS záření
– Detektory s fixní nebo variabilní vlnovou délkou
– Detektory diodového pole (PDA) - schopné měřit v celé oblasti λ
- průtokovou kyvetou prochází polychromatické světlo
- prošlé světlo je za kyvetou rozděleno difrakční mřížkou
- světlo dopadá na diodové pole
 Fluorometry - pro detekci fluorescenčních látek
- často nutná před- nebo postkolonová derivatizace analytů
 Elektrochemické detektory
– amperometrické el.-chem. detektory
– elektroaktivní analyt v průtokové cele oxidován nebo redukován na povrchu elektrody
s konstantním potenciálem
– zaznamenám vzniklý elektrický proud
– př. analýza katecholaminů v moči
– coulometrické detektory
- oxidace nebo redukce analytu
- měření elektrického náboje
- př. stanovení metanefrinů, vanilmandlové kyseliny, homovanilové kyseliny nebo 5hydroxy-indoloctové
kyseliny v moči
 Refraktometrický detektor měří změny indexu lomu eluátu v závislosti na koncentraci analytu
 Hmotnostní
HPLC, UPLC
Výrobci HPLC systémů
• např. Waters, Agilent Technologies, Thermo, PerkinElmer, Shimadzu, Varian,
Amersham Pharmacia, Dionex, Jasco, Gilson, Hitachi, BioRad a další…
UPLC, UHPLC
 Ultra high-perfomance liquid chromatography
 vyšší separační účinnost než klasická HPLC
 UHPLC využívá chromatografické kolony s
částicemi < 2µm
 přístroje schopné pracovat s ultravysokými tlaky
(100 MPa)
 práce s širokým rozsahem průtoků
 významné zkrácení doby analýzy
 Výrobci UPLC - např. Waters
 UPLC Waters Acquity (s MS
detektorem)
Příprava vzorků pro HPLC analýzu
Čištění vzorku a zakoncentrování analytů
Ultrafiltrační techniky - úprava roztoků pomocí polopropustných
membrán
– hustota membrány limituje velikost molekul, které jsou separovány
– technika je vhodná pro deproteinaci vzorků
Extrakční techniky
 Kapalinová extrakce analytů do organického rozpouštědla
– organický extrakt se odpařuje v proudu inertního plynu (dusíku)
– odparek se rozpustí v nezbytném objemu mobilní fáze
Extrakce pevnou látkou (solid phase extraction, SPE)
 využití SPE kolonek naplněných médiem dle charakteru látky sorbent,
iontoměnič, gel atd.
 vzorek v roztoku se kolonkou prolévá podtlakem
 zachycené složky se po promytí uvolní vhodným rozpouštědlem
 SPE je automatizovatelná
Derivatizace analytů
– umožnění nebo usnadnění detekce analytů
– předkolonová derivatizace - např. derivatizace aminokyselin a jiných primárních aminů za
vzniku fluorescenčních sloučenin a následná detekce fluorometrem
– postkolonová derivatizace - např. u analyzátorů aminokyselin eluované aminokyseliny za
kolonou derivatizovány ninhydrinem, fotometrická detekce
Chromatografie - kvantitativní analýza
Kalibrační techniky:
Externí kalibrace (kalibrace s vnějším standardem):
– provedení analýz referenčních vzorků se známým
obsahem analytu
– sestavení kalibrační křivky - velikost ploch píků analytu
v závislosti na jeho koncentraci
– použití kalibrační závislosti pro vyhodnocení koncentrací
analytu v reálných vzorcích
Interní kalibrace (kalibrace s vnitřním standardem):
– provedení analýzy referenčních vzorků se známým obsahem
analytů s přídavkem konstantního množství vnitřního standardu
vnitřní (interní) standard – sloučenina s podobnými vlastnostmi
jako stanovované analyty, ale nevyskytující se v reálných
vzorcích
– do kalibrační křivky se vynáší poměr plochy píku analytu a plochy
píku vnitřního standardu v závislosti na koncentraci analytu
– do reálných vzorků se přidává interní standard ve stejném množství
jako do referenčních roztoků
– koncentrace analytu se vyhodnocuje na základě poměru plochy
(výšky) odpovídajícího píku a píku vnitřního standardu
Kalibrace
0
40000
80000
0 10 20 30 40 50
koncentrace (nmol/l)
plochapíku
Kalibrace
0
1
2
0 10 20 30 40 50
koncentrace umol/l
plochaanalytu/plochaIST
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
Tenkovrstvá chromatografie (TLC, HPTLC)
 kvalitativní, příp. semikvantitativní analýza
 flexibilní levná matoda
 umožňuje souběžně analyzovat více vzorků
 nevyžaduje přístroje a náročnou přípravu
 velmi časté využití v toxikologii průkaz THC
– cílené průkazy nejrůznějších nox (jedů, škodlivin)
– orientační screening léků a drog
– pozitivní výsledky z toxikologického screeningu musí být konfirmovány pomocí dalších
chromatografických metod (př. HPLC, často ve spojení s hmotnostní spektrometrií)
HPTLC – sacharidy HPTLC – lipidy dvojrozměrná TLC – složené lipidy
Praktické aplikace chromatografických
technik v klinické biochemii - příklady
Papírová chromatografie
 jednoduchá, již málo používaná technika př. screening aminokyselin v moči
Ionexová chromatografie (IEC)
 Analýza aminokyselin
– vzorek - deproteinovaná plazma resp. sérum, moč, CSF - směs volných aminokyselin (AMK)
– AMK vneseny na kolonu s katexem ve formě kationtů (při nízkém pH)
– AMK postupně eluovány z kolony pufry o zvyšující se eluční síle (rostoucí pH a iontová síla)
– postkolonová derivatizace ninhydrinem
– kvalitativní vyhodnocení chromatogramu - na základě retenčních časů
– kvantitativní vyhodnocení pomocí vnitřního standardu (AMK norleucin)
Analyzátor AMK (Perkin – Elmer)
 Další využití IEC
• nukleotidy, peptidy, proteiny, oligonukleotidy, nukleové kyseliny
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
HPLC - rozdělovací
 z chromatografických metod nachází nejširší uplatnění v klinické biochemii
 většina aplikací využívá HPLC s reverzní fází
 lze ji aplikovat na široké spektrum analytů v závislosti na způsobu detekce
– sacharidy - karboxylové kys. - aminokyseliny
– lipidy - steroidy - katecholaminy
– léky - drogy - homocystein
– pteriny - CDT - glykovaný hemoglobin atd.
 HPLC se uplatňuje jako standardní metoda v toxikologii, hlavně v kombinaci
s hmotnostní spektrometrií
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
Záznam HPLC analýzy katecholaminů v moči z HPLC Agilent série 1200,
elektrochemický detektor Coulochem
Katecholaminy – adrenalin, noradrenalin, dopamin
Metanefriny – metanefrin, normetanefrin (metabolity katecholaminů)
Kys. vanilmandlová (metabolit katecholaminů)
- markery feocytochromu (nádor sympatoadrenálního systému, nejčastěji dřeně nadledvin)
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
Plynová chromatografie
 standardní technika v kvalitativních i kvantitativních analýzách v toxikologii
– plynové chromatografy v toxikologických laboratořích vybaveny různými detektory
k různým typům analýz, např.
GC s plamenovým ionizačním detektorem - stanovení alkoholu a těkavých látek v krvi
NPD detektor - screening většiny léčiv či drog
detektor elektronového záchytu - analýze benzodiazepinů nebo halogenovaných látek
hmotnostní spektrometr - cílené průkazy a stanovení nox
 diagnostika dědičných metabolických poruch (GC / MS)
GC analýza alkoholu Organické kyseliny v moči – diagnostika dědičných metab. poruch
Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry)
 Fyzikálně-chemická metoda
• využívá separace urychlených ionizovaných částic ve vakuu
podle jejich hmotnosti při jejich průchodu elektrickými (příp.
magnetickými) poli
 MS vyvinuta počátkem 20.století,
• v klinické biochemii - již několik desetiletí
∙ identifikace a stanovení nízkomolekulárních látek na základě měření
hmotnosti jejich molekul (detekce látek ve spojení s plynovou
chromatografií)
• První polovina 90. let 20.století - nové techniky
∙ umožnily využívat metodu i pro látky vysokomolekulární
• MS - nejdynamičtěji se rozvíjející metodika současné biochemie
∙ vedle metod molekulové genetiky
Hmotnostní spektrum
Výstup MS - hmotnostní spektrum
- čarový diagram
- vodorovná osa - hodnota m/z (hmotnost / náboj iontu)
- svislá osa - odezva detektoru nebo relativní zastoupení daného iontu
Hmotnostní spektrometr
- tři funkční celky:
• Iontový zdroj - ionizace neutrálních molekul měřené směsi:
– molekula analytu je převedena do plynné fáze (do vysokého vakua)
– získává charakteristický náboj
• Iontový separátor
– rozdělení iontů různých
hmotností
– ion je urychlen
– z charakteru jeho pohybu
vakuovaným prostorem lze
vypočítat jeho m/z
• Detektor
– detekce iontů po jejich
separaci podle hodnoty m/z
– určení relativní intenzity
(četnosti) jednotlivých iontů
Iontový zdroj - Ionizační techniky
Existuje celá řada ionizačních technik
Cíl: vytvoření nabité částice, která je následně analyzována
Použitá technika záleží na - charakteru analyzovaných látek
- separační metodě, na kterou je MS napojen
(GC/MS, LC/MS, bez napojení na separaci)
GC/MS: LC/MS, CE/MS,
- Elektronová ionizace EI MS s přímým nástřikem
- Elektrospray ESI MALDI
Elektronová ionizace, EI
Iontový zdroj - ionizace molekul analytu
v plynném stavu pomocí proudu elektronů
- Z molekuly při srážce s paprskem
elektronů odtržen elektron
- molekula získává kladný náboj
- Následná fragmentace (rozpad)
molekuly přebytkem energie
EI - tvrdá ionizační technika (fragmentace)
• fragmenty rozděleny v další části
analyzátoru dle hodnoty m/z a detegovány
- separace magnetickým analyzátorem,
kvadrupólem
• Pouze pro teplotně stálé nízkomolekulární
látky (50 – 800 Da)
- Dalton – jednotka molekulové hmotnosti
Elektronová ionizace (fragmentace)
- Hmotnostní spektrum
metanolu
Chemická ionizace CI
„Měkčí“ varianta elektronové ionizace
• Do iontového zdroje přiváděn ionizační plyn (př.metan)
– proud elektronů ionizuje nejdříve molekuly tohoto plynu
– tyto teprve předávají energii molekule analytu
– šetrnější, nedochází k tak rozsáhlé fragmentaci
Srovnání hmotnostního
spektra s elektronovou
ionizací a chemickou
ionizací
Elektrospray ionizace, ESI
 Eluát prochází kapilárou, na ni vloženo
vysoké napětí
 vzniká sprej vysoce nabitých kapiček
 následný postupný odpar rozpouštědla
 vznikají ionty (i vícenásobně nabité)
 jsou dále separovány (např. kvadrupól)
 Měkká ionizační technika (bez
fragmentace)
 Vhodné pro nízko- i vysokomolekulární látky
(peptidy, sacharidy, proteiny, nukleové
kyseliny,...)
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - MALDI
Vzorek v roztoku smíchán s matricí
– matrice - deriváty nízkomolekulárních aromatických kyselin
• absorbují energii laserového záření ve VIS nebo blízké UV oblasti
Roztok nakápnut a vysušen (vykrystalizován) na MALDI destičce
Pulzní ozáření směsných krystalů zábleskem laseru
– prudké odpaření látek do vakua
– ionizovaná matrice strhává sebou molekulu analytu a ionizuje ji
– ionty urychleny stejnosměrným elektrickým polem do TOF analyzátoru
MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
 Velmi měkká, šetrná technika
– i pro vysokomolekulární látky
(proteiny, peptidy, oligosacharidy,
nukleotidy)
 Ionty dále separovány
analyzátorem TOF
Matrice
Spotovací destička Spotovací destička na monitoru
MS – separace iontů
• Iontový separátor: rozdělení iontů různých hmotností
– ion je urychlen
– z charakteru jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměr
jeho hmotnosti a náboje m/z
Magnetický sektorový analyzátor Kvadrupól
Iontová past
TOF
Magnetický sektorový analyzátor
 Nejdéle používaný a nejlépe prozkoumaný, stále se vyvíjí
 Klasický typ detektoru, využívá skutečnosti, že dráha nabité částice se v
magnetickém poli zakřivuje tím více, čím má vyšší náboj a nižší hmotnost
 Malé molekuly – pouze GC/MS (EI)
 Velmi přesný, ve své moderní verzi velmi nákladný (v klin. biochemii není
používaný)
Kvadrupol
 Konstrukce - 4 kovové tyče, na ně vloženo stejnosměrné a střídavé napětí
 Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, začnou oscilovat
 Při vhodné kombinaci obou složek napětí prochází kvadrupolem pouze
ionty o určitém poměru m/z
 změnou vkládaných napětí je možné nechat projít kvadrupolem postupně
ionty v celém rozsahu m/z
 Lze použít pro GC/MS i LC/MS (v kombinaci s EI, ESI),
– pouze pro částice s menší hodnotou m/z
Iontové pasti
stejné fyzikální principy jako kvadrupól
– regulace pohybu iontu v určitém prostoru elektrickými poli
 ionty se pohybují po určitou dobu v prostoru iontové pasti
 vypuzovány z pasti selektivně podle hodnoty m/z
Lineární iontová past sférická
Orbitrap
TOF – analyzátor „Time of Flight“ (průletový)
 Deteguje hmotnosti ionizovaných molekul na základě doby jejich letu
evakuovanou trubicí
 rychlosti letu závisí na hodnotách efektivní hmotnosti m/z
- lehčí molekula letí rychleji
 V kombinaci s MALDI ionizací
Detektor
- detekce iontů po jejich separaci podle hodnoty m/z
- určení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontů
 Fotonásobič
- před vlastním fotonásobičem umístěna
fosforová destička
- na ni dopadají částice z konverzní dynody
- emise fotonů
- fotony dopadají na fotokatodu
- fotoelektrický jev - emise elektronů
- elektrony zmnoženy stejně jako v elektronovém
násobiči
 Elektronový násobič - série dynod se vzrůstajícím
potenciálem
- ion narazí na povrch první dynody - emise elektronu
- po jeho dopadu na další dynodu - vícenásobná emise
- kaskádový efekt - velké množství elektronů
- detekce
Detekce - hmotnostní spektrum
 Skenovací mód = zobrazí
všechny fragmenty
zvoleného rozmezí m/z
 SIM mód (Selection Ion
Monitoring) – způsob, kdy
přístroj registruje pouze
několik zvolených fragmentů
(zvýšení citlivosti)
Tandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MS
 MS/MS - ionty podrobeny dvěma hmotnostním analýzám (zapojení dvou či více
iontových separátorů v tandemu)
 MS/MS umožňuje rychlou analýzu bez použití separačních metod (GC, LC)
ve složité matrici, velice citlivá metoda
Standardně např. trojitý kvadrupól QqQ:
• První kvadrupól vybírá prekursorový ion
• Ve druhé části - kolizní cele - probíhá fragmentace prekursorového iontu
(srážkou iontu s atomy inertního plynu)
• Poslední kvadrupól analyzuje fragmenty
Pozn.: QqQ v kombinaci s ESI
(přímý nástřik) se používá pro
novorozenecký screening
- Obdobně TOF-TOF analyzátor
- Hybridní Q-TOF analyzátor
(kvadrupól – TOF)
Kvantita v hmotnostní spektrometrii
Kvantifikace látek - metoda vnitřního (interního) standardu (IST)
IST pro stanovení určité látky - analogická sloučenina nebo homolog
– co nejpodobnější chemicko-fyzikální vlastnosti jako stanovovaná látka
– látka, která se v původním zkoumaném vzorku nevyskytuje
IST se přidává do vzorku již na začátku zpracování
– pro potlačení vlivu matrice či kontaminace na účinnost ionizace analytu
IST se přidává do všech vzorků ve stejné koncentraci
Z MS spektra se po analýze vyhodnocuje poměr intenzit fragmentů typických pro
stanovovanou látku a IST
Pozn.: Pro kvantifikaci je vhodné použití selektivního záznamu iontů (SIM – Selection
Ion Monitoring) – způsob, kdy přístroj registruje pouze několik zvolených fragmentů
(zvýšení citlivosti)
nejpřesnější postup: ID-MS
metoda izotopického zřeďování
IST - izotopicky značený standard
stanovované látky
- identické chemicko-fyzikální vlastnosti
- nejčastěji deuterovaný
Příklady použití – GC/MS
 Analýza neznámých složek směsi
- hmotnostní spektrum pro každou
složku směsi
- porovnání s databází spekter
v počítači - identifikace
 Potvrzení či vyloučení metabolitů,
které svědčí pro určité metabolické
onemocnění
 Kvantifikace určitých metabolitů
 Toxikologie – léky, drogy, alkohol
Ukázka – organické kyseliny v moči
Příklady použití - LC/MS, LC/MS/MS
 Toxikologie – standardní metoda
• screening neznámých nox
• konfirmace a kvantifikace speciálních nox
 Farmakokinetické studie, stanovení léků
 Proteomika / metabolomika
Stanovení léků LC/MS (LC/MS/MS)
Pozn.: Záznam v SIM módu
Příklady použití – MS/MS
- MS/MS analýza bez použití separační metody (GC, LC)
- uspořádání ESI – trojitý kvadrupol:
Novorozenecký screening dědičných poruch metabolismu
- Stanovení markerů dědičných poruch metabolismu aminokyselin
a mastných kyselin ze suché krevní
kapky (18 různých metabolických poruch,
např. fenylketonurie)
Surface Enhanced Laser Desorption Ionization
Analýza proteinů pomocí vazby na předpřipravený povrch pevné fáze
proteinového čipu
 Povrch čipu - tvořený protilátkou, receptorem, ligandem, chemickou úpravou
 Po nanesení vzorku - navázání proteinů k povrchu adsorpcí, elektrostatickou
interakcí, na afinitním principu,…
 Promytí mikročipu - odstranění nenavázané složky
 Analýza – viz MALDI - TOF
 Vzorek komplexní
směsi proteinů lze
analyzovat současně
na několika různých
sorbentech, aby byly
navázány veškeré
proteiny ze vzorku
 Čipy mohou být
vyrobeny dle
požadavku zákazníka
Příklady použití - MALDI-TOF
Analýza biomolekul
– proteiny
– peptidy
– oligosacharidy
– nukleotidy…
 Identifikace mikroorganismů
po extrakci proteinů z bakterií nebo i
metodou celých buněk
 MALDI - IMS (imaging mass spectrometry) zobrazení rozložení proteinů i
nízkomolekulárních látek ve tkáních přímou „in-situ“ analýzou
Děkuji za pozornost…
…ale i těm,
kteří se
nudili !
…těm, které
problematika
zajímala…