Centrum molekulární biologie a genetiky NÁDOROVÁ CYTOGENOMIKA 2020 - slouží k určení získaných chromosomových změn u hemato–onkologických malignit - vyšetření má význam: - přispívá k určení klinické diagnózy nebo jejímu potvrzení - k určení prognózy (dobrá – inv(16), t(18;21); špatná – MLL, del(5q), del(7q), -7, del(17p), komplexní změny karyotypu) - volba léčby - monitorování onemocnění (remise x relaps) - vyšetřuje se kostní dřeň, periferní krev a tkáň solidního tumoru - k určení chromosomových změn jsou používány tyto metody: cytogenetické vyšetření, FISH, mFISH, mBAND, array CGH a SNP array NÁDOROVÁ CYTOGENOMIKA CYTOGENETICKÉ VYŠETŘENÍ zisk dostatečného množství dělících se buněk zástava dělení v metafázi buněčného cyklu vizualizace metafázických chromosomů (G-pruhování) sestavení karyogramuhodnocení dle ISCN Vlastní zpracování – FN Brno Převzato a upraveno z: https://cz.pinterest.com/pin/825636544157492063/ Převzato a upraveno z: https://www.pinterest.at/pin/515873332309357344/ Převzato a upraveno z: https://www.amazon.ca/Iscn-2020-International-Cytogenomic- Nomenclature/dp/3318067067 Vlastní zpracování – FN Brno Vlastní zpracování – FN Brno - 1. ODBĚR MATERIÁLU - 2. KULTIVACE – získání dostatečného množství dělících se buněk - 3. ZPRACOVÁNÍ SUSPENZE - 4. NAKAPÁNÍ SUSPENZE NA PODLOŽNÍ SKLO - 5. PRUHOVÁNÍ / BARVENÍ CHROMOSOMŮ – G – PRUHOVÁNÍ - 6. VYHLEDÁVÁNÍ METAFÁZÍ - 7. HODNOCENÍ PŘÍPRAVA METAFÁZNÍCH PREPARÁTŮ A HODNOCENÍ - kostní dřeň (KD) – heparin + PBS (transportní medium) - periferní krev (PK) – heparin - solidní tumor – D-MEM (transportní medium) 1. ODBĚR MATERIÁLU Vlastní zpracování – FN BrnoVlastní zpracování – FN Brno - nasazení do kultivačního media sterilně v laminárním boxu - kostní dřeň ▪ dospělí – Bone Marrow ▪ děti – Marrow Grow ▪ kultivace 24 hod. při 36 – 37 °C v termostatu s regulovaným přívodem CO2 - periferní krev ▪ RPMI-1640 + IL-2 + DSP30 ▪ kultivace 72 hod. při 36 – 37 °C v termostatu s regulovaným přívodem CO2 2. KULTIVACE Vlastní zpracování – FN Brno - působení kolchicinu – alkaloid z Ocúnu jesenního - zastaví dělení v metafázi buněčného cyklu rozrušením mitotického vřeténka, chromosomy zůstávají dvouchromatidové, vhodné k cytogenetické analýze 3. ZPRACOVÁNÍ SUSPENZE Převzato a upraveno z: https://www.bylinkyprovsechny.cz/byliny-kere-stromy/jedovate-byliny/1085-ocun-jesenni-ucinky-na-lidsky-organismus-priznaky-otravy Vlastní zpracování – FN Brno A) Hypotonizace - roztok KCl - vytvoří hypotonické prostředí – dochází k lýze erytrocytů, leukocyt zvětší svůj objem a chromosomy se rozestoupí 3. ZPRACOVÁNÍ SUSPENZE Vlastní zpracování – FN Brno 3. ZPRACOVÁNÍ SUSPENZE B) Fixace - fixační roztok – metanol + kyselina octová (v poměru 3:1) - zlepší viditelnost struktur, zlepší barvitelnost chromosomů a rozpustí nečistoty - poslední fixací se naředí sediment, tak aby vznikla opaleskující suspenze Vlastní zpracování – FN Brno 4. NAKAPÁNÍ SUSPENZE NA PODLOŽNÍ SKLO - na označená skla se kápne několik kapek suspenze - inkubace 20 min. při cca 80 °C v horkovzdušném sterilizátoru, kdy dochází k dehydrataci vzorku Vlastní zpracování – FN Brno 5. PRUHOVÁNÍ / BARVENÍ CHROMOSOMŮ (G-PRUHOVÁNÍ) - 2% trypsin v Sörensenově fosfátovém pufru - odmytí v Sörensenově fosfátovém pufru - barvení v barvivu Giemsa- Romanowski - oplach ve vodě Vlastní zpracování – FN Brno 6. VYHLEDÁVÁNÍ METAFÁZÍ - vyhledání metafází přístrojem LUCIA Metaphase Finder - snímá cca 6 skel, z každého skla snímá 20 obrazů pod zvětšením 100x Vlastní zpracování – FN Brno 6. VYHLEDÁVÁNÍ METAFÁZÍ Vlastní zpracování – FN BrnoVlastní zpracování – FN Brno 7. HODNOCENÍ - cílem analýzy je sestavení karyotypu a jeho zápis podle mezinárodní cytogenetické nomenklatury ISCN 2020 - hodnotí se celkem 20 metafází - každý pacient je vždy hodnocen minimálně 2 pracovníky - karyotyp se sestavuje a hodnotí pomocí softwaru LUCIA Karyo - výsledek uvolňuje VŠ pracovník s atestací Převzato a upraveno z: https://www.amazon.ca/Iscn-2020-International-Cytogenomic-Nomenclature/dp/3318067067 - nasnímané metafázické chromosomy se v systému Lucia od sebe oddělí, seřadí a hodnotí 7. HODNOCENÍ Vlastní zpracování – FN BrnoVlastní zpracování – FN Brno Vlastní zpracování – FN BrnoVlastní zpracování – FN Brno - sledují se numerické a strukturní aberace ISCN: 46,XX 7. HODNOCENÍ Vlastní zpracování – FN Brno Í: vzor 7. HODNOCENÍ - po zhodnocení se vytvoří závěrečná zpráva cytogenetického vyšetření - výsledek je vydán v papírové a elektronické podobě – AMIS (FN Brno) Vlastní zpracování – FN Brno ONEMOCNĚNÍ FISH panel CLL – Chronická lymfocytární leukemie 13q14, ATM, TP53, CEP12, del(6q), C-myc CML – Chronická myeloidní leukemie t(9;22) – BCR/ABL1 MDS – Myelodysplastický syndrom del(5q), del(7q), -7, TP53, del(20q), CEP8 - CHRONICKÁ LYMFOCYTÁRNÍ LEUKEMIE - CLL - CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKEMIE - CML - MYELODYSPLASTICKÝ SYNDROM - MDS - současně s cytogenetickým vyšetřením se dle diagnózy indikuje FISH vyšetření KAZUISTIKA NEJČASTĚJŠÍCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT U: del(11q) - ATM ISCN: 46,XY,del(11)(q?14q?22) NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CLL (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno del(11q) - ATM ATM TP53 NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CLL (FISH) Vlastní zpracování – FN Brno trisomie chromosomu 12 ISCN: 47,XX,+12 NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CLL (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno trisomie chromosomu 12 CEP12 13q14 13q34 NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CLL (FISH) Vlastní zpracování – FN Brno del(13q) ISCN: 46,XY,del(13)(q?14q?22) NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CLL (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno del(13q14) CEP12 13q14 13q34 NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CLL (FISH) Vlastní zpracování – FN Brno del(17p) - TP53 ISCN: 46,XY,del(17)(p?13) NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CLL (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno del(17p) – TP53 ATM TP53 NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CLL (FISH) Vlastní zpracování – FN Brno 9q34 22q11 t(9;22) - bcr/abl1 ISCN: 46,XY,t(9;22)(q34;q11.2) t(9;22) NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CML (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno t(9;22) - fúze BCR/ABL1 – vzniká Ph chromosom - Philadelphia chromosome 22q11.2 ABL1 9q34.1 BCR NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CML (FISH) Vlastní zpracování – FN Brno t(9;22) – BCR/ABL1 +8 i(17q) ISCN: 47,XX,+8,t(9;22)(q34;q11),i(17)(q?10) t(9;22) NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - CML (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno del(5q) ISCN: 46,XX,del(5)(q13?q?33) NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - MDS (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno del(5q) 5p15 5q31 NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - MDS (FISH) Vlastní zpracování – FN Brno del(7q) ISCN: 46,XX,del(7)(q?11q?36) NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - MDS (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno 7q31 7q22 CEP7 del(7q) NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - MDS (FISH) Vlastní zpracování – FN Brno trisomie chromosomu 8 ISCN: 47,XY,+8 NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - MDS (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno trisomie chromosomu 8 CEP8 NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - MDS (FISH) Vlastní zpracování – FN Brno del(20q) ISCN: 46,XY,del(20)(q?12q?12) NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - MDS (cytogenetiké vyšetření) Vlastní zpracování – FN Brno del(20q12) 20q12 20q13 NEJČASTĚJŠÍ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY - MDS (FISH) Vlastní zpracování – FN Brno ISCN: 46,XY,der(15)t(3;15)(q?;q?26.1) ISCN: 46,XY,der(15)t(3;15)(q?;q26.1)[10]/44,XY,der(9)t(9;13)(p?;q?),der(10)ins(10;?), -15,der(15)t(3;15)(q?;q26.1),+18[2]/46,XY,?der(2)t(2;16)(q?;?),der(15)t(3;15)(q?;q26.1)[1] /46,XY,der(5)t(5;13)(q23.3;q?),der(12)(12pter->12q21.1::15q?->15q?::3?->3?), der(13)t(13;17)(q31;q?21.2),der(15)t(14;15)(?;q24)[1]/46,XY[1] - v případě komplexního karyotypu (3 a více chromosomových aberací, z toho jedna z aberací musí být strukturního charakteru) se může dále indikovat vyšetření - M-FISH - M-band KOMPLEXNÍ KARYOTYP Vlastní zpracování – FN BrnoVlastní zpracování – FN Brno Vlastní zpracování – FN BrnoVlastní zpracování – FN Brno Vlastní zpracování – FN Brno Vlastní zpracování – FN Brno DĚKUJI ZA POZORNOST