Bílkoviny Funkce bílkovin • Enzymy • Strukturální – kolagen, keratin • Kontraktilní – aktin, myosin • Protilátky – imunoglobuliny • Transportní – albumin, transferin,… • Proteohormony – inzulín Bílkoviny Analyzovaný materiál: sérum, plasma, moč, likvor • Mezi základní biochemická vyšetření patří stanovení celkové bílkoviny. • Hlavní skupiny bílkovin tvoří albumin (asi 50%) a globuliny • Kromě albuminu a CRP jsou to glykoproteiny (10-25% obsah sacharidů) – Albumin • tvořen převážně v játrech • udržuje stabilní onkotický tlak (podílí se na něm ze 75%) • významné transportní funkce – Globuliny • různé typy proteinů • dělí se na alfa, beta a gamaglobuliny • syntetizovány také v játrech, nebo jsou tvořeny imunitním systémem Celková bílkovina • Speciální preanalytické požadavky: nejsou • Referenční rozmezí: S/P 64-83 g/l moč 0-0,15 g/l likvor 0,15-0,45 g/l Celková bílkovina • poloha při odběru: vstoje -> přesun tekutiny z intravazálního prostoru do intersticia -> zakoncentrování proteinů v krvi – konc. se zvyšuje o 10 – 15 % =>pacient by měl 15 min. před odběrem sedět. U ležících pacientů hodnoty o cca 10 % nižší • zvýšená svalová aktivita -> zvýšení koncentrace až o 12 % • expozice vysoké teplotě ->zvětšení plazmatického objemu a snížení glomerulární filtrace -> celkové proteiny mohou poklesnout až o 10 % • dehydratace vede ke zvýšeným koncentracím • není nutný odběr nalačno • delší stažení paže (nad 3 min) při odběru -> falešné zvýšení až o 10 % • nižší hodnoty - děti, v graviditě (vlivem hemodiluce) • v séru jsou hodnoty CB nižší, v plazmě jsou koncentrace vyšší - odpovídá koncentraci fibrinogenu: o 2,5 g/l - 4,6 g/l Celková bílkovina - stanovení • Sérum: – Reakce s biuretovým činidlem – Kjeldahlova metoda • Likvor, moč: – Fotometrické metody – Turbidimetrické metody – Další metody: • Metoda s kyselinou sulfosalicylovou • Metody založené na schopnosti proteinů vázat barvivo Celková bílkovina Metody stanovení: • Referenční i rutinní metoda (pro CB v séru): reakce s biuretovým činidlem • Certifikovaný referenční materiál: NIST/SRM 927a (pro CB v séru) Fotometrické metody Metoda s biuretovým činidlem (sérum): alkalické protein + Cu 2+ ---------- Cu- protein complex prostředí • Komplex vhodný k fotometrickému stanovení při 540 – 550 nm • Detekční limit: kolem 2 g/l • Biuretová reagencie dále obsahuje: - tartarát sodno-draselný - ke komplexaci měďnatých iontů a zabránění vysrážení hydroxidu měďnatého - jodid draselný - antioxidant - zabraňuje autoredukci mědi • Aminokyseliny a dipeptidy nereagují - malé peptidy dávají růžové zbarvení, ale vzhledem k jejich nízké koncentraci v séru je jejich příspěvek nevýznamný • Interference: Hemolýza (hemoglobin reaguje jako protein), lipémie vadí až při vysokých koncentracích Fotometrické metody Metody využívající vazbu proteinu na barvivo: - Coomassie blue, Pyrogallová červeň - stanovení v moči a likvoru Nevýhody: • nedostatečná stabilita činidla • nerovnoměrná schopnost vazby na barvivo pro různé typy bílkovin • falešné snížení koncentrace globulinů Turbidimetrické metody Stanovení s benzethonium chloridem (moč, likvor): • Koncentrace celkové bílkoviny o dva řády nižší • Využívají se citlivější metody Doporučená metoda • Celková bílkovina reaguje s benzethonium chloridem za vzniku zákalu, který se měří turbidimetricky při 505 nm • Reakce probíhá v alkalickém prostředí v přítomnosti EDTA, který denaturuje bílkovinu a eliminuje interferenci hořečnatých iontů • Výhoda metody - podobná reaktivita činidla s albuminem a gama globuliny - peptidy s krátkým řetězcem neinterferují Interference: CSF – vadí hemolýza, U – přítomnost solí Mez detekce: 0,04 g/l Turbidimetrické metody Metoda využívající precipitace bílkovin s kyselinou trichloroctovou nebo sulfosalicylovou: • vykazuje nestabilitu nebo flokulaci precipitátu a také rozdíly v chování činidla k jednotlivým bílkovinám ve směsi • je nezbytně nutné nepoužívat kalibrátor na bázi albuminu, ale zahrnující spektrum bílkovin tak, jak se vyskytují v moči Další metody Metoda s kyselinou sulfosalicylovou: jako doplňující zkumavkový test pro semikvantitativní stanovení bílkoviny při chemické analýze moče pomocí diagnostických proužků, které zachycují pouze albumin a nikoliv lehké řetězce Metody založeny na schopnosti proteinů vázat barvivo: např. amidočerň, kyselou violeť Využívají se zejména k barvení po elektroforetickém rozdělení Další metody Kjeldahlova metoda: • Historicky nejstarší metoda ke stanovení celkové bílkoviny • Po mineralizaci vzorku varem s kyselinou sírovou se dusík ze vzorku převede na amoniak, který zůstane vázán ve formě síranu amonného • Alkalizací účinkem hydroxidu se ze síranu amoniak uvolní a stanoví se titračně • V krvi jsou přítomny i dusíkaté látky nebílkovinného původu – je proto za potřebí po stanovení celkového dusíku vysrážet bílkoviny např. kys. trichloroctovou a v supernatantu stanovit také dusík • Dusík bílkovin pak bude rozdílem mezi dusíkem celkovým a nebílkovinným • Nedá se automatizovat, tudíž se v laboratořích klinické biochemie nepoužívá • Má význam při definování referenčních materiálů pro biuretovu metodu Albumin • Analyzovaný materiál: sérum, plasma, moč, likvor • Speciální preanalytické požadavky: nejsou • Referenční metoda: není • CRM: ERM DA 470 • Referenční rozmezí: S/P 34-48 g/l moč 0-0,03 g/l likvor 0,12-0,3 g/l Albumin v likvoru = vždy z krve, v CNS se netvoří (syntéza v játrech, do mozku se dostává přes hematolikvorovou bariéru => slouží k hodnocení funkčního stavu hematolikvorové bariéry) Albumin - stanovení • Sérum: – Stanovení s bromkresolovou zelení (BCG) – Stanovení s bromkresolovým purpurem (BCP) • Moč: – Imunoturbidimetrie – Imunonefelometrie • Likvor: – Imunonefelometrie Albumin v séru • Ve slabě kyselém prostředí se albumin chová jako kation • Stanovení založeno na reakci s aniontovým barvivem většinou se skupinou – SO3H • Mez detekce: 2 g/l • Využívají se barviva, která se specificky vážou na albumin v přítomnosti ostatních sérových bílkovin • Značný posun absorpčního maxima komplexu albumin-barvivo proti absorpčnímu maximu samotného barviva Stanovení albuminu s bromkresolovou zelení (BCG) v séru a plasmě • Žlutozelený roztok bromkrezolové zeleně tvoří při pH 4,2 s albuminem zelenomodrý komplex s maximem 630 nm • Vazba albuminu na barvivo není zcela specifická barvivo částečně reaguje také s a1- a a2-globuliny, ale pomaleji než s albuminem • Nespecifickou vazbu je možno minimalizovat odečítáním absorbance krátce (30s) po smíchání séra s barvivem • Jedná se o nejčastěji používanou metodu Stanovení albuminu s bromkresolovým purpurem (BCP) v séru a plasmě • Žlutý roztok bromkrezolového purpuru tvoří při pH 5,2 za přítomnosti povrchově aktivních látek s albuminem zelený komplex s maximem 600 nm • Metoda je vysoce specifická Albumin v moči • Podobně jako při stanovení CB se jedná o mnohem nižší koncentrace než v séru Imunoturbidimetrie nebo imunonefelometrie • Se specifickou protilátkou proti lidskému albuminu tvoří albumin precipitát imunokomplexu • Vzniklý zákal se měří imunoturbidimetricky nebo imunonefelometricky • Reakčním prostředím je pufr s obsahem polyethylenglykolu (PEG; podporuje tvorbu suspenze) Mez detekce: 2-10 mg/l Albumin v moči Mikroalbuminurie • Albumin v moči – důležitý marker poukazující na generalizovanou cévní hyperpermeabilitu • Fyziologická albuminurie je < 20 µg/min • Denně – až 30 mg albuminu vylučováno močí • Běžné proužky na stanovení proteinurie – až od 150 mg/l • 30-150 mg/l = mikroalbuminurie • Vyšetřování buď v jednorázové ranní moči, pak výsledek vyjádřen v přepočtu na kreatinin • Nebo ve sbírané moči za časovou jednotku (doporučený odběr přes noc, nemocný v klidu, délka sběrného období min. 6 hod, s přesností na minuty) Stanovení dalších proteinů • Další proteiny přítomné v séru v nízkých koncentracích se převážně stanovují imunoturbidimetricky nebo imunonefelometricky (mg/l) • Pro stanovení v séru a moči postačuje imunoturbidimetrie, pro stanovení v likvoru je pro svou citlivost vhodná imunonefelometrie • Chemiluminiscence (µg/l = ng/ml) • ELISA (výzkumné parametry) CRP v séru a plasmě • C-reaktivní protein - nejčastěji stanovovaný velmi citlivý protein akutní fáze • Jeho koncentrace se prudce zvedá při zánětu • Není specifický • Imunoturbidimetrické stanovení zesílené na částicích (particle-enhanced) – antigen (CRP) reaguje a protilátkou proti CRP, která je navázaná na latexových mikročásticích. Vzniklý komplex – precipitát se stanoví turbidimetricky • Mez stanovitelnosti kolem 1 mg/l Imunoglobuliny v séru (plazmě) a likvoru Imunoglobuliny G, A a M v séru či plasmě - stanovují se imunoturbidimetricky (imunonefelometricky) v likvoru pouze imunonefelometricky (dostatečná citlivost, hodnoty v mg/l) IgG – 7 - 16 g/l IgA – 0,7 - 4,0 g/l (Referenční meze v S/P pro dospělé) IgM – 0,4 - 2,3 g/l • Imunoturbidimetrické i turbidimetrické metody jsou založeny na měření zákalu vytvořeného interakcí měřeného analytu (Ag) se specifickou protilátkou (Ab) • Vznik precipitátu se projevuje vzrůstem zákalu reakční směsi • U imunoturbidimetrických metod reakce často probíhá v přítomnosti PEG, který zvyšuje rychlost reakce, citlivost a výrazně omezuje možnost rozpouštění precipitátu v přítomnosti nadbytku antigenu • Hlavní vlnová délka pro měření absorbance - 340 nm Imunoglobuliny • Analýza jednotlivých polyklonálních imunoglobinů zahrnuje stanovení koncentrace směsi proteinů různé velikosti s podobnou konstantní částí a různou variabilní částí • Protilátky a referenční kalibrátory jsou postaveny proti normálním lidským sérům složeným ze směsi imunoglobulinových podtříd • Stanovení jednotlivých polyklonálních imunoglobinů - spolehlivé Imunoglobuliny D a E Imunoglobuliny D a E v séru • Vyžadují ke stanovení ještě citlivější analytické metody • Obvykle se využívají imunoanalyzátory na principu chemiluminiscence Imunoglobuliny • Zjišťování nadměrné tvorby antigenně strukturálně i funkčně homogenního Ig nebo jeho fragmentu -> monoklonální imunoglobulin (mIg; produkován jedním klonem proliferujících plazmatických buněk) • Stanovení monoklonálních imunoglobulinů – problematické • Monoklonální imunoglobiny mají pouze některé z determinant, s kterými protilátky v antiséru reagují • Dochází k rychlé tvorbě precipitátu, pro vysoké koncentrace monoklonálních imunoglobinů (paraproteinů) jsou výsledky získané zejména po naředění nadhodnoceny • Pro absolutní koncentraci paraproteinů - elektroforéza a denzitometrie • Pro rozlišení jednotlivých tříd mIg (IgG, IgA, IgM, IgD a IgE, λ a κ) - imunofixace Volné lehké řetězce k a l • Imunoglobulinové molekuly: - dva těžké řetězce (a,d,e,g,m, které určují Ig třídu) - dva identické lehké řetězce - každý lehký řetězec je kovalentně navázán na těžký řetězec - těžké řetězce jsou kovalentně spojeny v stěžejní část Stanovení volných lehkých řetězců (FLC, free light chains): - používají se protilátky namířené proti antigenním strukturám dostupným jen na lehkých řetězcích (nikoli na lehkých řetězcích navázaných na těžké řetězce, tj. kompletní molekuly Ig) • U zdravých jedinců je koncentrace volných lehkých řetězců minimální • Absolutní hodnota FLC souvisí s glomerulární filtrací, vychýlení z normálního poměru koncentrace volných lehkých řetězců signalizuje patologickou klonální tvorbu jednoho typu • V séru je poměr volných kappa ku lambda 0,625 zatímco poměr vázaných volných lehkých řetězců je 2 (volné kappa převážně monomery, volné lambda jako dimery) • Ke stanovení se používá imunonefelometrická případně imunoturbidimetrická metoda Heavylite, Binding Site • použití specifických HLC polyklonálních protilátek, obsahujících unikátní junkční epitopy mezi konstantními doménami těžkých řetězců (HC) a lehkých řetězců (LC) molekuly imunoglobulinu. • tyto HLC protilátky umožní separativní rozpoznání a kvantifikaci κ a λ lehkých řetězců v rámci jednotlivých tříd MIg: IgG κ, IgG λ, IgA κ, IgA λ, IgM κ a IgM λ. • Stanovení poměru molekul IgG κ / IgG λ IgM κ / IgM λ IgA κ / IgA λ • Prediktivní marker při posuzování vývoje monoklonální gamapatie nejasného významu (benigní) Další proteiny - sérum transferin 2,0 - 3,6 g/l imunoturbidimetrie ↑= nedostatek železa v organismu ( ↓= přebytek železa v organismu porucha proteosyntézy v játrech, akutní zátěž organismu prealbumin 0,2 - 0,4 g/l imunoturbidimetrie ↓ porucha proteosyntézy v játrech u těžkých hepatopatií nebo proteinové malnutrice haptoglobin 2,0 - 3,6 g/l imunoturbidimetrie ↑= akutní stavy ↓ = poruchy proteosyntézy v játrech, intravaskulární hemolýza orosomukoid 0,25 - 4,0 g/l imunoturbidimetrie ↑ = akutní stavy ↓ = porucha proteosyntézy v játrech Alfa2- makroglobulin 2 – 3,5 g/l imunoturbidimetrie ↑= nefrotický syndrom, chronické hepatopatie, v dětském věku ↓ = akutní pankreatitida alfa 1- antitrypsin 0,9 - 2,0 g/l imunoturbidimetrie ↑= akutní záněty a akutní závažné stavy, těhotenství ↓= těžké hepatopatie, dědičný defekt tvorby API ceruloplasmin 0,22 - 0,6 g/l imunonefelometrie ↑= postupný nárůst v těhotenství ↓= genetická porucha způsobující nedostatečnou tvorbu ceruloplasminu, (Wilsonova choroba) C3 0,9 - 1,8 g/l imunoturbidimetrie ↑ = akutní zátěž ↓= tvorba imunokomplexů (např. autoimunitní choroby) C4 0,1 - 0,4 g/l imunoturbidimetrie Cystatin C 0,63–1,44 mg/l imunoturbidimetrie ↑fce ledvin CRP 0,0 – 5,0 mg/l imunoturbidimetrie ↑= akutní zánět, akutní stavy prokalcitonin 0,0 – 0,5 ug/l chemiluminiscence ↑ sepse transferin 0,2 – 1,2 mg/l imunonefelometrie pro hodnocení proteinurie Alfa2- makroglobulin < 7 mg/g kreatininu imunonefelometrie Alfa 1 - mikroglobulon 2 – 12 mg/l imunonefelometrie kvalitativní analýza elektroforéza Další proteiny - moč transferin 7-22 mg/l imunonefelometrie Zánětlivý marker prealbumin 12- 27 mg/l imunonefelometrie t -protein ELISA diagnostika demence x Alzheimerovi chorobyBeta -amyloid ELISA S-100 chemiluminiscence Tumormarker CEA chemiluminiscence B2- mikroglobulin imunoturbidimetrie Volné lehké řetězce kappa imunoturbidimetrie, imunonefelometrie RS ↑ Další proteiny - CSF Elektroforéza bílkovin krevního séra Gelová elektroforéza – SPE • Každá zóna obsahuje jeden a více sérových proteinů. • Nejvíce anodicky putuje albumin, následují α1-globuliny α2-globuliny, β1-globuliny, β2-globuliny a gamaglobuliny. • Šířka proteinového bandu frakce závisí na počtu proteinů, které jsou ve frakci přítomny. Gelová elektroforéza – SPE + imunofixace • Elektroforetické dělení vzorku probíhá simultánně v šesti stopách. Po elektroforéze – první stopa (ELP) slouží jako referenční. Zbývajících 5 stop je použito k nanesení specifických antisér – proti těžkým řetězcům (G, A, M) a anti-kappa a antilambda volným a vázaným lehkým řetězcům. • Imunofixační proužky jsou porovnány s odpovídajícími frakcemi referenčního vzorku – odpovídající proužek by měl mít stejnou migrační pozici. Provádí se ve čtyřech krocích: 1. Separace proteinů elektroforézou na agarózovém gelu. 2. Imunofixace (imunoprecipitace) proteinů rozdělených elektroforézou – příslušné migrační stopy jsou překryty jednotlivými antiséry. Antiséra difundují do gelu a precipitují přítomné antigeny. Proteiny v referenční stopě jsou jsou fixovány fixačním roztokem. 3. Neprecipitované, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny odsátím a promytím. Komplex antigen-protilátka zůstává v gelové matrix. 4. Precipitované proteiny jsou vizualizovány obarvením. • Elektrofoforeogram bílkovin moče je podobný rozdělení bílkovin v séru - intenzita frakcí závisí na filtrační schopnosti ledvin. • K analýze používáme zahuštěné nebo nezahuštěné vzorky moče. • Poskytuje kvalitativní pohled na proteinurii, užitečné informace při diagnostikování selhání ledvin, identifikace hlavních bílkovin v moči pomáhá přesně určit typ poškození ledvin (tubulární, glomerulární nebo smíšený) • Dále pomáhá při identifikaci monoklonálních gamapatií (Bence Jonesovy bílkoviny) Elektroforéza/izoelektrofokuzace mozkomíšního moku Izoelektrická fokuzace: metoda zahrnuje izoelektrofokusaci na agarózovém gelu, následovanou immunofixací s anti-Ig G antisérem. Vzorky CSF a séra od téhož pacienta jsou pak vizuálně porovnány. Citlivost metody dovoluje analýzu CSF bez předchozího zahušťování Test se provádí ve dvou stupních: 1. Izoelektrofokusace na agarózovém gelu k rozdělení proteinů ve vzorcích CSF a séra. 2. Imunofixace s anti-IgG antisérem značeným enzymem (peroxidázou) určeným k detekci IgG oligoklonálních proužků 3. Srovnává se přítomnost či nepřítomnost identických pruhů IgG v séru a moku; počet a lokalizace proužků nemá diferenciálně diagnostický význam. K potvrzení intratékální syntézy Ig je nutno analyzovat sérum a mozkomíšní mok paralelně ve stejných koncentracích, aby byl demonstrován rozdíl v distribuci IgG. • Fyziologicky mají imunoglobuliny v séru i mozkomíšním moku polyklonální charakter a vyjadřují heterogenitu individuálních protilátek produkovaných jako odpověď na nejrůznější antigeny, s nimiž se jedinec setkal. •Intratékálně produkované protilátky se vyznačují pouze omezenou (oligoklonální) heterogenitou, což se při izoelektrické fokusaci projeví jako izolované proužky, které nejsou patrné při analýze séra. Základní typy : • Typ 1 – v séru i v moku pouze polyklonální IgG – normální nález; • Typ 2 – oligoklonální proužky pouze v likvoru – lokální syntéza IgG (např. u roztroušené sklerózy); • Typ 3 – oligoklonální proužky v likvoru a další oligoklonální proužky v likvoru i v séru – lokální syntéza IgG a produkce protilátek v organismu (např. chronická infekce CNS); • Typ 4 – identické oligoklonální proužky v séru i moku (tzv. „zrcadlový“ obraz proužků v séru a v likvoru – dochází k průniku protilátek z krve do likvoru) – systémová imunitní aktivace bez lokální syntézy IgG v CNS; • Typ 5 – identické monoklonální proužky v séru i moku v krátkém úseku pH gradientu, jde o přítomnost monoklonálního paraproteinu v likvoru sérového původu (myelom, monoklonální gamapatie) Děkuji za pozornost.