Lucie Říhová Průtoková cytometrie Princip a využití ve zdravotnictví Oddělení klinické hematologie, FN Brno - NBP Průtokový cytometr 2  poprvé použit v 60. letech k měření objemu buněk  specializovanější varianta fluorescenčního mikroskopu v kombinaci s krevním analyzátorem, nyní až 50 fluorescencí  analýza fyzikálních, chemických a biologických vlastností až 20x106 buněk v suspenzi  možnost sortování - separace raritních populací buněk ▫ single cell sorting ▫ další analýzy na buněčné/molekulární úrovni ▫ kultivace buněk (aseptický sort) Klinické průtokové cytometry 3 Navios EX (Beckman Coulter) BD FACSCantoII (BD Biosciences) Omnicyt (Cytognos) BD FACSLyric (BD Biosciences) DxFLEX (Beckman Coulter) Bricyte (Mindray) Průtoková cytometrie 4  umožňuje simultánní analýzu mnoha tisíců částic/buněk za sekundu  buňky (částice) procházejí přes paprsek laseru ▫ mění jeho kvalitativní i kvantitativní vlastnosti  rozptýlené či druhotně emitované světlo (fluorescence) pak dopadá na detektory, kde je konvertováno na elektronický signál  zisk mnoha parametrů - velikost, granularita, fluorescence… Měřitelné buněčné parametry 5  Exprese proteinů - povrch, cytoplazma, jádro (imunofenotypizace)  Posttranslačně modifikované proteiny - vč. fosforylovaných proteinů  RNA - IncRNA, miRNA a mRNA transkripty  Buněčný status - živé bb, pozdně apoptotické a neviabilní  Buněčný cyklus - analýza buněk v G0/G1 fázi vs. S fázi, G2, případně stanovení ploidie, včetně detekce proliferace a aktivace  Identifikace a charakterizace různých buněčných subsetů v rámci heterogenního vzorku pomocí imunofenotypizace https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of- fluorescence/flow-cytometry-basics/flow-cytometry-fundamentals.html Složení průtokového cytometru 6 1. Fluidika - směřování vzorku do laserového paprsku a usměrňování jeho toku 2. Zdroj světla - signál z rozptylu na buňkách a aktivace fluorescence navázaných barev 3. Optika - sdružení a rozdělení rozptýlených paprsků dle vln. délky pomocí filtrů a zrcadel na příslušné detektory 4. Elektronika a počítačový systém - převod optického signálu na elektronický a další zpracování Složení průtokového cytometru 7 detektory fluorescencí FS detektor SS detektor optické filtry nosná kapalina buněčná suspenze polopropustná zrcadla http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html Fluidika - usměrňování vzorku 8 Hydrodynamická fokusace https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of- fluorescence/flow-cytometry-basics/flow-cytometry-fundamentals/fluidics-flow-cytometer.html Hydrodynamická + akustická fokusace Zdroj světla 9 LASER = Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation  stálý koherentní zdroj paprsků světla o určité vlnové délce l  přesné zacílení co největšího počtu fotonů do co nejmenšího bodu  dle aktivního média (k pumpování energie) ▫ plynové  objemné, vodou/vzduchem chlazené, stále „on“ ▫ pevnolátkové (polovodičové diody)  ▫ vláknové - flexibilní technologie pro potřebné l ▫ diodové - malé, opt. poměr příkon/výkon, nepotřebují dlouhý zahřívací čas (s), mimo analýzu „off“ Paprsek laseru 10 https://www.edmundoptics.de/knowledge-center/application-notes/optics/why-use-a-flat-top-laser-beam/ https://www.laserfocusworld.com/optics/article/14197298/flattop-laser-beams-their-uses-and-benefits https://expert.cheekyscientist.com/what-is-a-flow-cytometry-laser-how-flow-cytomtery-optics-function/  většina laserových paprsků má profil Gaussovy křivky  snížení symetrie ozáření se vzdáleností od centra paprsku  vysoká rychlost průtoku vzorku = nerovnoměrné ozáření  využití tzv. flat top laserů Světlo vs. buňka 11 Forward Scatter - rozptyl světla v malém úhlu - velikost buňky Side Scatter - rozptyl světla pod úhlem 90° - komplexita buňky Fluorescence - snímána pod úhlem 90° - přítomnost fluorochromu detektor detektor detektor Fluorescence I. 12 Základní stav E=0 Excitovaný stav E>0 E1 E2 teplo fluorochrom emise E2 = fluorescenceabsorbce E1 excitační l emitovaná l ztráta E1-E2 = vnitřní konverze + vibrační relaxace Vlnová délka (barva) fluorescence závisí na - typu laseru - emise l - typu fluorochromu (fční skupinou je fluorofor) Fluorescence II. 13 Fluorescein Ex = 488nm Em = 519 nm  Stokesův posun ▫ l excitace ≠ l emise  Fluorescence Resonance Energy Transfer = FRET ▫ excitovaný donor A předá energii a fluoreskuje B ▫ tandemové konjugáty - citlivé na světlo (PC5, PC7, APC-Cy7…) A B Uspořádání laserů 14 Flow cell = průtoková komůrka  interakce laserů s buňkami  křemíková kyveta vs. jet in air (nozzle) Paralelní uspořádání laserů ▫ časové a prostorové oddělení ▫ časové zpoždění (laser delay) ▫ vyšší počet fluorochromů 633 nm 488 nm 405 nm Optika I. 15 Optické filtry a dichroická zrcadla  propustnost pro dané l a blokace/odraz jiných  znalost vlastního cytometru nezbytná Optika II. 16 Detekční systém/optická lavice Odraz světla = nižší ztráty E Průchod světla = vyšší ztráty E Vznik signálu I. 17 Převod světelného (generovaného vstupem buňky do paprsku laseru) na elektrický signál prostřednictvím fotonásobiče/fotodiody → slabý fotoproud laser laser laser FotonásobičCharakteristiky pulsu Vznik signálu II. 18 Fotonásobič (PMT) - high linear gain and broad dynamic range, but limited sensitivity in the red and near infrared spectral regions Avalanche photodiode (APD) - improved sensitivity and resolution in the red and near infrared spectral regions Lawrence 2008 Vznik signálu III. 19 Fotoproud - zesílení, digitalizace (analog-digital převodník - ADC) a třídění signálu (binning) Rozlišení ADC  dáno počtem „tříd“  18-bitový ADC = 218 tříd = 262.144 tříd Fluorochromy I. 20 https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/antibodies-for-flow- cytometry/flow-cytometry-panel-builder.html.html https://www.miltenyibiotec.com/UN-en/products/macs-antibodies/vio-dye-fluorophores.html  Organická barviva ▫ malé stabilní molekuly ▫ původní = FITC ▫ Pacific dyes ▫ Alexa Fluor Dyes ▫ eFluor  Velké proteiny ▫ původní = PE, APC, PerCP  Polymery ▫ Super Brights ▫ Brilliant violet/ultraviolet  Speciální barviva ▫ NovaFluor Fluorochromy II. 21 MFI 71.027 MFI 5.004 MFI 13.371 MFI 50.790 MFI 2.173 MFI 18.543 MFI 8.059 MFI 12.359 Stain index  svítivost jednotlivých fluorochromů  SI = D/W D = difference between positive and negative peak medians W = the spread of the background peak (= 2X rSDnegative) Analýza a zobrazení 22 leukocytární gate monocytární gate lymfocytární gate debris FS lin SS lin A B C FS - forward scatter - velikost buněk SS - side scatter - granularita/komplexita 1-parametrová analýza 23 Histogram  osa x - intenzita fluorescence, osa y – počet buněk  hodnocení - odečet % pozitivních buněk ▫ neg. peak = autofluorescence, izotypová kontrola ▫ poz. peak - low (+/-) < dim (+) < high, bright (++) < very high (+++) ▫ porovnávání intenzity exprese - medián intenzity fluorescence (MFI) Intenzita fluorescence (lineární nb logaritmická stupnice) početbuněk 2-parametrová analýza 24 Dot plot  dva parametry proti sobě - FLx vs. FLy, FLx vs. FS či SS  procentuální hodnocení - nejčastěji kvadrantová analýza I. kvadrant – FITC-PE+ II. kvadrant – FITC+PE+ III. kvadrant – FITC-PEIV. kvadrant – FITC+PE- FITC PE I. II. III. IV. Multiparametrová analýza I. 25 Principal Component Analysis (PCA)  transformace sloužící k dekorelaci dat  snížení dimenze dat s co nejmenší ztrátou infomace ▫ APS - automatic population separator (Infinicyt) CD19+ leuko Multiparametrová analýza II. 26 t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) - an unsupervised, non-linear technique for data exploration and visualizing high-dimensional data - minimizes the divergence between two distributions Kompenzace I. 27 V důsledku spektrálního překryvu emisních spekter dochází k tomu, že signál jedné fluorescence je zachycen i na fotonásobiči následující fluorescence  falešná fluorescence FITC zasahující do PE – falešný přídavný signál! FITC - filtry - PE úprava – zvýšení % odstranění FITC z PE, resp. PE z FITC fotonásobiče FITC PE Kompenzace II. 28  negativní a jednobarevné kontroly  buňky (homogenní populace - lymfocyty) nebo kuličky „CompBeads“ (u slabých/nepřítomných Ag)  automaticky pomocí SW (MFI negat. populace = MFI pozit. populace)  dataspread = pravidlo silného Ag a slabého fluorochromu a naopak Titrace MoAb 29 Lugli 2017 Výrobcem doporučený objem x detekovaná fluorescence Raritní populace 30 Thermo Fisher Scientific Počet získaných událostí 100.000 500.000 1.000.000 4.010.000 10.000.000 20.000.000 Cílová populace (0,01%) 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 Počet pozitivních událostí 10 50 100 401 1000 2000 Standardní odchylka 3,16 7,07 10.00 20.02 31.62 44,72 Koef. variace 31,62 14,14 10,00 4,99 3,16 2,24 Sortování subpopulací 31  Přesné časování buněk - znalost jednoznačné polohy buněk od průchodu laserem  bezprostředně po analýze dochází piezoelektricky k „trhání“ proudu vzorku na kapky - obsahující jednu buňku  požadovaným buňkám = kapkám je udílen el. náboj  vychylování nabitých kapek v el. poli a separace  vhodné pro raritní populace buněk (alternativa imunomagnetické separace)  časově náročné  možný aseptický sort Kontroly kvality (QC) I. 32 Interní (IKK) - závislé na přístroji  Kontrola optického nastavení a fluidiky přístroje I ▫ firemní fluoreskující částice pro kalibraci přístroje tak, aby byl každodenně stejně nastaven (cílové hodnoty MFI)  Kontrola optického nastavení II ▫ komerční fluorescenční částice pro mezipřístrojové nastavení  Vnitřní kontrola správnosti (buněčná) ▫ stabilizovaná krev s přesným počtem (relativním i absolutním) základních subpopulací lymfocytů  nástroj pro verifikaci metody  akreditace Externí (EKK) - nezávislé na přístroji a reagenciích  MLP, SEKK - buněčné Kontroly kvality (QC) II. 33 Kontrola optického nastavení přístroje - CST, PTB… Absolutní počty buněk 34  využití firemního roztoku s přesně definovaným počtem fluoreskujících částic na ul (2 chyby pipetování)  využití speciálních zkumavek s definovaným počtem fluorescenčních partikulí (1 chyba pipetování)  peristaltická pumpa přístroje přesně odměřuje objem analyzovaného vzorku (nutno dopočítat ředění) Princip imunofenotypizace (IFT) 35 monoklonální protilátka (MoAb) konjugovaná s fluorochromem (fluorescenční molekulou) suspenze buněk s určitými povrchovými či intracelulárními antigeny (Ag) vizualizace specifické vazby MoAb-Ag možnost kombinace několika MoAb  vizualizace mnoha znaků najednou Vazba MoAb - Ag 36 Anti CD3-FITC Anti CD19-PE + plná krev kostní dřeň bb suspenze vybrané protilátky konjugované s fluorochromem + = = T T B B označení buněk vazbou protilátek na odpovídající Ag Základní populace lymfocytů 37 Kontrolní materiál + TC + CD3/CD16+56/CD45/CD19/CD4/CD8 33 % Ly 8 % Mo 56 % Neu 1,0 % Ba 1,4 % Eos TC 74 % Tly 50 % Th 21 % Tc 13 % NK 13 % Bly Klinické využití FC 38 Rutinní vyšetření a výzkumné analýzy  imunologie  alergologie  hemato-onkologie  transplantologie  transfuziologie  neonkologická hematologie Hmotnostní Cytometrie I. 39 Nový přístup využívající stabilní izotopy kovů jako „značky“ spolu s jejich detekcí pomocí atomové hmostnostní spektrometrie  značky jsou spojeny s MoAb kompatibilními s povrchovými i či intracelulárními znaky  buňky jsou vaporizovány, atomizovány a ionizovány, poté je měřena základní kompozice  simultánní detekce až 30 parametrů jedné buňky bez nutnosti kompenzace Hmotnostní Cytometrie II. 40 Hmotnostní Cytometrie III. 41  nevhodná pro minoritní populace  existence komerčních panelů protilátek pro vyšetření zejm. imunitního systému  vizualizace dat ve speciálních SW SPADE Zobrazovací cytometrie 42 Flow cytometr se zobrazovacími a funkčními vlastnostmi mikroskopu  přímé zobrazení buněk s 60 násobným rozlišením  simultánní fenotypové a funkční analýzy s využitím 5 laserů a 12 zobrazení na buňku Spektrální cytometrie I. 43  progresivní technologie pronikající do rutinní diagnostiky  znalost spekter negativní/nebarvené kontroly a jednotlivých pozitivních kontrol dle použitých konjugátů  definice spektrálního „fingerprintu“ referenčních fluorescencí i auto-fluorescence  mnohobarevný vzorek je porovnáván s jednotlivými kontrolami  matematické rozložení na jednotlivé spektrální komponenty  grafické znázornění ve formě dot plotu  není potřeba kompenzace! Spektrální cytometrie II. 44 Spektrální cytometrie III. 45 Výhody a nevýhody FC 46 parametr průtoková cytometrie konvenční mikroskopie stupeň jednoduchosti vysoký střední rychlost vysoká nízká počet analyzovaných buněk vysoký nízký absolutní počet buněk přesná nepřesná senzitivita vysoká střední/nízká specificita vysoká vysoká počet parametrů >10 <3 antigenní exprese kvantitativní kvalitativní antigenní lokalizace omezená detailní morfologické parametry 2 >10