ELEKTROFORETICKÉ METODY, DENZITOMETRIE, REFLEXNÍ A VERTIKÁLNÍ FOTOMETRIE
Mgr. Kateřina Černá Pilátová, Ph.D
Mgr. Nikola Kučeráková
1

Elektroforetické metody
●Analytické separační metody
●K dělení látek dochází díky jejich rozdílné pohyblivosti  vlivem vnějšího elektrického pole
(stejnosměrný el. proud)
•Rychlost migrace proteinů závisí na těchto faktorech:
●Elektrický náboj molekuly
●Velikost a tvar molekuly – větší se pohybují pomaleji
●Síla elektrického pole
●Vlastnosti nosného média
●Teplota
2

Elektroforetické metody:
rozdělení
●Typy elektroforézy
•Agarózová elektroforéza – sérové proteiny, hemoglobiny.
•Kapilární elektroforéza – sérové proteiny, HbA1c, hemoglobinopatie, DNA fragmenty.
•Isoelektrická fokusace (IEF) – oligoklonální pásy, izoenzymy.
•Polyakrylamidová elektroforéza (PAGE, SDS-PAGE) – proteinurie, výzkum, proteomika – menší póry,
detailnější analýza
•2D elektroforéza (IEF + SDS-PAGE) – proteomika (separace podle náboje a velikosti).
●
3

Hlavní typy gelové elektroforézy
Gelová nedenaturační elektroforéza
•Nativní gelová elektroforéza
●probíhá bez denaturačních činidel
●migrace proteinů gelem závisí na jejich náboji, velikosti a tvaru
●Rozlišovací schopnost (účinnost) elektroforézy je dána velikostí pórů a složením gelu
Gelová denaturační elektroforéza
•SDS gelová elektroforéza
●proteiny jsou obvykle denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a redukovány β-merkaptoetanolem
●Proteiny jsou separovány podle své molekulové hmotnosti
4

SDS gelová elektroforéza
●SDS je anionaktivní detergent, který nese poměrně vysoký náboj, a proto ve vazbě na bílkovinu
vyrovnává nábojové rozdíly bílkovin, které se potom pohybují v gelu jen podle velikosti.
●Vzorek proteinu se zpracuje s tzv. vzorkovým pufrem - obsahuje SDS a redukční činidlo
β-merkaptoethanol.
●Působením těchto látek dojde k rozrušení kvarterní, terciární a do značné míry i sekundární
struktury.
●Všechny bílkoviny váží SDS v konstantním poměru, asi 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny, a tím
charakteristicky mění svou konformaci.
●Výsledné komplexy SDS-bílkovina:
●mají stejnou hodnotu povrchového náboje
●konformace bílkovin se do jisté míry unifikuje
5

SDS gelová elektroforéza
●Klinické využití: analýza proteinurie (zcela jasně odlišuje bílkoviny tubulární od bílkovin
glomerulárního původu.
6

Elektroforéza bílkovin séra a moče
7


Nativní gelová elektroforéza bílkovin v moči a séru
Technická instrumentace
SAS Vitrési (Helena Biosciences)
Hydrasys (Sebia)
8

HYDRASYS
(Sebia)
9
HYDRAGEL 30 ß1-ß2 kit
●Elektroforetické rozdělení bílkovin lidského séra a moči do šesti hlavních frakcí na alkalicky
pufrovaných agarózových gelech o pH 8,6.
●
●
●
●Separované bílkoviny jsou obarveny roztokem amidočerni
●Vyhodnocení je buď vizuální nebo denzitometrické (relativní kvantifikace jednotlivých zón).
●30 SPE vzorků na gel
●poloautomatizovaný systém
●manuální kroky: Manipulace se vzorky, gely, vkládání reagencií a nastavení přístroje k uvedení do
chodu
●automatické kroky: nanesení vzorků, elektroforetickou migraci, sušení, barvení, odbarvování, a
konečné osušení gelové plotny

HYDRASYS (Sebia)
10
HYDRAGEL 30 ß1-ß2 kit
●gel
●agaróza saturovaná alkalickým roztokem pH 8.6 ± 0.5
●nosné medium pro elektroforézu
●
●pufrované stripy: slouží jako rezervoár pufru a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami
●
●amidočerň + ředící roztok pro amidočerň
●
●odbarvovací roztok (destain)
●odstranění přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny
●vyplachování barvícího prostoru po promývacím kroku
●
●promývací roztok – čištění barvicího modulu

HYDRASYS Sebia (Francie)
11
HYDRAGEL 30 ß1-ß2 kit
●Migrace
●Všechny části migračního rámečku jsou sníženy – stripy s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s
povrchem gelu – probíhá aplikace vzorků do gelu.
●Nosič aplikátorů vzorků se zvedne, části s elektrodami nesoucí stripy s pufrem zůstávají v
kontaktu s povrchem gelu.
●Proběhne migrace při konstantních 20 W, 20 °C, 7 min.
●Zvednutí nosiče elektrod, odpojení elektrod.
●Teplota migrační plochy stoupá až na 65 °C na dobu 10-ti minut, po kterou se gel suší.
●Migrační plocha je ochlazena na 50 °C a slyšitelné pípnutí signalizuje odjištění víka migračního
modulu. Teplota se udržuje na 50 °C až do otevření víka. Potom teplota klesá na 20 °C (v necelých
5-ti minutách).
●Barvení v barvicím modulu amidočerní.
●
●Denzitometrické skenování nabarvených elektroforetických obrazů / jednotlivých proteinových zón
(stanovení procentuálních hodnot) - elektroferogram

HYDRASYS (Sebia)
12


HYDRASYS (Sebia)
13


HYDRASYS (Sebia)
14


Zpracování gelu po separaci
●Po proběhnuté elektroforéze je nutné gel sušit nebo fixovat fixačním roztokem (obsahuje kyselinu,
např. kys. octová) - dojde k denaturaci proteinů a jejich imobilizaci v nosném médiu, aby se
zabránilo difúzi jednotlivých zón.
●Dále je nutné gel obarvit, aby došlo k vizualizaci jednotlivých proteinových frakcí. Po promytí
přebytku barviva, se gel suší. Barvy – amidočerň, kyselá violeť,…
●Množství barviva, které se během barvení váže na proteiny záleží na mnoha faktorech. Je ovlivněno
typem proteinu nebo stupněm denaturace při fixaci.
15

Vyhodnocení:
detekce a kvantifikace
●Po elektroforetické separaci a barvení, je možné kvantifikovat jednotlivé zóny jako procentuální
podíl přímou denzitometrií.
●Denzitometr je přístroj, který slouží k vyhodnocení hustoty zbarvení v plošném uspořádání
(scanner). Jedná se o postup, který je podobný fotometrickému stanovení, zaznamenává měnící se
hodnotu absorbance v závislosti na intenzitě zbarvení.
●Při denzitometrii se měří intenzita záření procházejícího průhlednou plochou, získává se grafický
záznam fotometrovaného úseku.
●Elektroforetický obraz se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené
vlnové délky (400 – 700 nm), v místě frakcí dochází k částečné absorpci záření – to se projeví při
dopadu na detektor.
●Plocha pod křivkou píků připadající jednotlivým frakcím, je úměrná relativnímu zastoupení
jednotlivých frakcí v dělené směsi.
●Po zpracování signálu získáme číselné výsledky jednotlivých frakcí – přepočet z celkové bílkoviny.
16

Gelová elektroforéza v klinické praxi (SPE)
●Při elektroforéze sérových bílkovin dochází k rozdělení na frakci albuminu, α1, α2, β1, β2 a
ɣ-globulinů
●Proteiny migrují v gelu jako pásy (bandy)
●Stanovení zastoupení jednotlivých frakcí může mít orientační význam při hodnocení stadia
zánětlivého procesu (akutní zánět - ↑ α1 a později i α2; chronický zánět - ↓albumin, ↑ gamma
globuliny)
●Vyhodnocování zastoupení jednotlivých zón je dnes z velké části nahrazeno automatizovanými
metodami stanovení specifických proteinů!
●Hlavní význam elektroforézy sérových bílkovin: detekce monoklonálních imunoglobulinů (M-proteinu).
17

Gelová elektroforéza v praxi (SPE):
Frakce
ALBUMIN
●55-65 % z celkových proteinů plasmy
●denně produkce v játrech až 12 g
●elipsoidní tvar – nezvyšuje viskozitu plasmy
●funkce:
●proteinová rezerva (zdroj AMK)
●transport – bilirubin, hem, steroidní látky, kovy, léky
●vazba vody – ztráty albuminů při poruchách ledvin vedou k přestupu vody do tkání → otoky
18

Gelová elektroforéza v praxi (SPE):
Frakce
ɑ1 GLOBULINY
●prakticky jediná bílkovina, která ovlivňuje tvar a intenzitu alfa 1 zóny – alfa-1-antitrypsin
●chrání před enzymy zánětlivých buněk, inhibitor proteáz
●dále kyselý alfa-1 globulin, transkortin, transkobalamin
ɑ2 GLOBULINY
●intenzitu a morfologii bandu ovlivňují stejným dílem alfa-2- makroglobulin a haptoglobin.
•Haptoglobin:
•vazba hemoglobinu z rozpadlých erytrocytů (zabraňuje ztrátám Fe)
•↑ při akutním zánětu a při zátěži
•↓ při rozpadu velkého množství erytrocytů
19

Gelová elektroforéza v praxi (SPE):
Frakce
β GLOBULINY
●β1 = transferin – vazba a transport železa
●β2 =  komplement C3
γ GLOBULINY
●IgG, IgM, IgA, IgD, IgE
●lehké řetězce κƛ
●Produkovány B-lymfocyty (plazmatickými buňkami)
B Cell – Cell Cartoons
20

Protilátky: struktura
Antibody Isotypes: IgG, IgA, IgM, IgE, IgD
21

Detekce paraproteinu
●Imunoelektroforéza je v současné době používána téměř výhradně k průkazu monoklonálního
imunoglobulinu = paraproteinu
●Paraprotein (PP, MIg) je produkován klonem nádorových plasmatických buněk = plazmocytom,
plazmocytární myelom
●Mnohočetný myelom = nádor vycházející z plazmatických buněk
●CRAB symptomy
●Přítomnost MIg = výrazný nefyziologický úzký band obvykle v gama zóně
●Příčinou jasného pruhu je fakt, že se PP pohybuje velmi uniformě, protože každá molekula má stejné
aminokyselinové složení (tudíž stejný náboj a molekulovou hmotnost)
22

CRAB symptomy
What is Multiple Myeloma? Symptoms, Causes, & Prognosis
23

Elektroforéza s následnou imunofixací
Provádí se ve čtyřech krocích:
●Separace proteinů elektroforézou na agarózovém gelu.
●Imunofixace (imunoprecipitace) proteinů rozdělených elektroforézou – příslušné migrační stopy jsou
překryty jednotlivými antiséry (anti-IgG, -IgM, IgA, -kappa a –lambda). Antiséra difundují do gelu
a precipitují přítomné antigeny. Proteiny v referenční stopě jsou jsou fixovány fixačním roztokem.
●Neprecipitované, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny odsátím a promytím. Komplex
antigen-protilátka zůstává v gelové matrix.
●Precipitované proteiny jsou vizualizovány obarvením
24

Imunofixace: zpracování
25


Imunofixace: zpracování
26


Imunofixace: zpracování
27


Imunofixace
●Penta fixace
•Do jedné stopy se nanese směs všech pěti antisér: IgG, IgA, IgM, κ, λ.
•Slouží k rychlé orientaci – ukáže, zda v séru je nějaká monoklonální komponenta.
•Pokud se objeví pozitivní pruh, je nutné provést rozlišení jednotlivými antiséry.
●Plná fixace
•Každé antisérum (IgG, IgA, IgM, κ, λ) se aplikuje do samostatné stopy.
•Umožní přesně určit třídu a typ lehkého řetězce monoklonálního imunoglobulinu.
•Je definitivním potvrzením a typizací M-proteinu.
●Speciální fixace
•Cílená na vzácné nebo atypické monoklonální imunoglobuliny (např. IgD, IgE, heavy-chain disease,
čistě lehké řetězce).
•Detekce terapeutických monoklonálních protilátek
●
28

Hodnocení elektroforézy:
Pentafixace
Imunofoxace
29
Penta fixace
Imunofixace
Imunofixace
Nativní ELFO

Hodnocení elektroforézy:
speciální fixace – terapeutické protilátky
30
●Terapeutická protilátka může mít stejnou elektroforetickou pohyblivost  jako  MIg přítomný v séru
pacienta.
●Může simulovat  přítomnost patologického MIg, který ve skutečnosti není přítomen, a tak falešně
podhodnocovat odpověď na léčbu.
●Imunofixační postup HYDRASHIFT (SEBIA) s použitím antidaratumumabu provedený na gelu HYDRAGEL IF
2/4 je založen na vytvoření komplexu daratumumab/antidaratumumab a jeho posunutí mimo oblast
gamaglobulinů.

Hodnocení elektroforézy / imunofixace
●Hemolýza = 1250 mg/l (norma 0-50)
31
●Fibrinogen (plazma)

Hodnocení elektroforézy
●NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA
Imunoparéza
•izolované zvýšení jednoho typu imunoglobulinu (paraproteinu) se současným snížením ostatních
imunoglobulinů

Hemolýza
•při silné hemolýze se vytváří samostatný band mezi α2 a β1 zónou
32

Hodnocení pentafixace
33

Pozitivní:
PP o nízké koncentraci nejde vidět na Elfu, ale s pentavalentním antisérem ano
PP migrující v beta frakci

Hodnocení imunofixace
34

Negativní – difúzní zabarvení zón je fyziologické

Kapilární elektroforéza
Princip
•Separace proteinů v tenké kapiláře naplněné pufrem při vysokém napětí.
•Detekce pomocí UV absorbance (nejčastěji 200–220 nm).
•Migrace podle náboje, velikosti a interakce s pufrem.
•Výsledek: elektroferogram = křivka absorbance vs. migrační čas.
●
35
Diagram of an electrical field AI-generated content may be incorrect. Capillary electrophoresis
system - CAPILLARYS 3 OCTA - Sebia - for proteins / benchtop
V8 UltraCE, (Helena Biosciences)
Capillarys (Sebia)

Kapilární elektroforéza + imunotypizace
●
36
UltraCE serum protein monoclonal result UltraCE Immunodisplacement in Platinum 6.2
elektroforéza
imunotypizace
Imunotypizace spočívá v přidání specifických antisér, které naváží monoklonální imunoglobulin,
vytvoří nerozpustný komplex a způsobí vymizení jeho píku v elektroferogramu, čímž lze určit typ
paraproteinu.

Gelová vs. kapilární elektroforéza v klinické praxi
37
Vlastnost
Agarózová elektroforéza
Kapilární elektroforéza
Princip
Migrace proteinů v agarózovém gelu, barvení a vizualizace pásů
Migrace proteinů v tenké kapiláře při vysokém napětí, detekce UV absorbancí
Výstup
„Gelový obraz“ – barevné pásy + denzitometrická křivka
Elektroferogram – křivka absorbance vs. migrační čas
Čas analýzy
30–60 minut
< 10 minut
Automatizace
Spíše manuální (nanášení vzorku, barvení, sušení)
Plně automatizovaná, minimální zásah obsluhy
Rozlišení
Nižší, frakce se mohou překrývat
Vysoké, ostré píky, možnost β1/β2
Citlivost
Nižší – malé M-komponenty nemusí být vidět
Vysoká citlivost k detekci M-komponent
Přehlednost
Vizualizace pásů vhodná pro výuku
Jen křivka – méně názorné pro laiky
Cena
Nižší (gel, barviva)
Vyšší (přístroj + reagenční sety)
Použití
Rutinní screening, výuka – hl. monoklonální gamapatie,
Moderní screening, sledování monoklonálních gamapatií, glykovaný hemoglobin

Izoelektrická fokusace (IEF)
38


Izoelektrická fokusace (IEF)
●Elektroforetická separační metoda, při níž dochází k dělení biomolekul v gradientu pH dle jejich
izoelektrického bodu.
●Gradientu se dosahuje pomocí amfolytů obsahujících směsi NH2+ a -COOH-, které se ve stejnosměrném
elektrickém poli seřadí podle svého izoelektrického bodu a vytvoří tak gradient pH (cca 5-10).
●Izoelektrický bod = hodnota pH při níž je pro danou látku vyvážen počet kladných a záporných
nábojů, takže se molekula jeví navenek jako neutrální = izoelektrické pH = pI
●pI je hodnota pH, při které se molekuly vlivem elektrického pole nepohybují.
●Dělené látky v průběhu IF putují do svých izoelektrických bodů, kde fokusují = koncentrují se.
39

Izoelektrická fokusace (IEF)
●Proteiny vykazují značné rozdíly v izoelektrických bodech: většina má pI v pH 4 – 7.
●Obecně by se vzorky neměly aplikovat na místo, kde se očekává jejich fokusace.
●Aby se proteiny chránily před působením extrémních hodnot pH, neměly by se aplikovat blíže než 1
cm od elektrod.
●Proteiny můžeme před extrémy pH chránit také tím, že gradient pH vytvoříme před aplikací vzorku
(pre-migrace)
40

Izoelektrická fokusace: klinické aplikace
●Oligoklonální pásy (OCB) v mozkomíšním moku
•IEF + imunofixace → detekce intratekální syntézy IgG.
•Zásadní vyšetření v diagnostice RS.
●Průkaz β-2-transferinu
•Marker mozkomíšního moku (likvorhea do ucha/nosu).
•IEF oddělí transferrinové isoformy → β-2-transferin je specifický pro CSF.
●
41

Izoelektrická fokusace:
Detekce oligoklonálních pásů (OCB)
●Slouží k průkazu intratekální syntézy IgG v CNS, což je zásadní v diagnostice a diferenciální
diagnostice roztroušené sklerózy a dalších chronických zánětlivých onemocnění CNS.
●Oligoklonální pásy (OCB) nacházíme u více než 95 % pacientů s roztroušenou sklerózou (nejsou
specifické pro roztroušenou sklerózu, ale jsou součástí diagnostických kritérií – diseminace v
čase).
●Dále lze pásy prokázat u chronických zánětů CNS, při neuroborrelióze, neurosyfilis atd.
42

Izoelektrická fokusace:
hodnocení
●Metoda zahrnuje izoelektrofokusaci na agarózovém gelu, následovanou immunofixací s anti-IgG
antisérem značeným enzymem (např. peroxidáza, zvyšuje citlivost).
●Vzorky CSF a séra odebrány současně!!! od téhož pacienta jsou pak vizuálně porovnány.
●Citlivost metody dovoluje analýzu CSF bez předchozího zahušťování.
●K potvrzení intratékální syntézy Ig je nutno analyzovat sérum a mozkomíšní mok paralelně ve
stejných koncentracích, aby byl demonstrován rozdíl v distribuci IgG.
●Fyziologicky mají imunoglobuliny v séru i mozkomíšním moku polyklonální charakter a vyjadřují
heterogenitu individuálních protilátek produkovaných jako odpověď na nejrůznější antigeny, s nimiž
se jedinec setkal.
43

Izoelektrická fokusace:
hodnocení OCB
Typ 1 – v séru i v moku pouze polyklonální IgG – normální nález;
Typ 2 – oligoklonální proužky pouze v likvoru – lokální syntéza IgG (např. u roztroušené sklerózy);
Typ 3 – oligoklonální proužky v likvoru a další oligoklonální proužky v likvoru i v séru – lokální
syntéza IgG a produkce protilátek v organismu (systémové onemocnění)
Typ 4 – identické oligoklonální proužky v séru i moku (tzv. „zrcadlový“ obraz proužků v séru
a v likvoru – dochází k průniku protilátek z krve do likvoru) – systémová imunitní aktivace bez
lokální syntézy IgG v CNS;
Typ 5 – identické monoklonální proužky v séru i moku v krátkém úseku pH gradientu, jde o přítomnost
monoklonálního paraproteinu v likvoru sérového původu (myelom, monoklonální gamapatie) –
paraproteinový obraz.
44

Izoelektrická fokusace:
hodnocení OCB
●Intratékálně produkované protilátky se vyznačují pouze omezenou (oligoklonální) heterogenitou, což
se při izoelektrické fokusaci projeví jako izolované proužky, které nejsou patrné při analýze séra.
●Z toho vyplývá nutnost provádět současně analýzu imunoglobulinů likvoru i séra.
●Srovnává se přítomnost či nepřítomnost identických pruhů IgG v séru a CSF; počet a lokalizace
proužků nemá diferenciálně diagnostický význam.
45

Izoelektrická fokusace:
Průkaz likvorey
●Likvorea = výtok mozkomíšního moku/likvoru, k němuž dochází při poranění lebky
●Někdy je důležité určit, zda u pacienta po úrazu hlavy je sekret vytékající z nosu jen zánětlivý
exsudát z nosní sliznice nebo mozkomíšní mok
●V takovém případě se jedná o závažný stav s komunikací likvorových cest a nosní dutiny, ohrožující
pacienta přestupem bakteriální flóry na mozkové blány (meningy).
●Likvor může odtékat např. z dutiny nosní či ucha.
●Pro průkaz 2 specifické parametry: beta-trace protein, beta-transferrin.
●Srovnání hladin v séru pacienta a v jiné biologické tekutině (sekrety, výtoky z nosu, tekuté, nebo
nasáté do tamponů)
46

Beta-trace protein
●Prostaglandin D syntáza
●V likvoru jsou koncentrace 20-30 x vyšší než v séru.
●U nás stanovení nefelometricky (Atellica, Siemens).
●BTP v sekretu:
●< 0,7 mg/l – přítomnost likvoru nepravděpodobná
●≥ 1,3 mg/l – přítomnost likvoru pravděpodobná
●0,7-1,29 mg/l -> poměry
●BTP sekret/sérum <2 - přítomnost likvoru nepravděpodobná
●BTP sekret/sérum ≥ 2 - přítomnost likvoru nepravděpodobná
47

Beta-2 transferrin
●Detekce pomocí IEF na agarózovém gelu + imunofixace anti-transferrinovými protilátkami
●Zlatý standard pro průkaz likvoru v biologických sekretech
●Beta-2 transferrin je desialylovaná forma transferinu a nachází se pouze v likvoru, perilymfě a
sklivci oka (ani v séru, ani v slzách, ….).
●Přítomnost beta-2 transferrinu lze pokládat za specifický průkaz likvoru nebo jeho příměsi.
●Ze sérového transferrinu se v likvorových prostorech působením neuraminidáz odštěpují zbytky
kyseliny sialové → vzniká asialotransferrin (β₂-transferrin).
●Vyhodnocení:
●Vizuální pozorování elektroforetického záznamu umožňuje detekci desialylované frakce transferinu
(neboli 0-sialo frakce) ve vzorcích sekretu.
●Když je desialylovaná frakce transferinu více vizualizovaná, než frakce disialo transferinu, je
vzorek pozitivní.
48

Beta-2 transferin:
hodnocení
●Vizuální pozorování elektroforetického záznamu umožňuje detekci desialylované frakce transferinu
(nebo-li 0-sialo frakce) ve vzorcích sekretu.
●Když je desialylovaná frakce transferinu více vizualizovaná, než frakce disialo transferinu, je
vzorek pozitivní.
49

ELFO + IEF:
Příklady dalších aplikací
●Iso-ALP (izoenzymy alkalické fosfatázy)
•Metoda: agarózová elektroforéza + inhibice/lektiny
•Princip: rozlišení isoenzymů ALP (kostní, jaterní, placentární, intestinální) podle mobility a
reakce s lektinem
•Klinicky: diferenciální diagnostika zvýšené ALP (hepatopatie vs. osteopatie)
●Frakce hemoglobinu
•Metoda: agarózová elektroforéza
•Princip: separace HbA, HbA₂, HbF a patologických variant (HbS, HbC, HbE) podle náboje/mobility
•Klinicky: diagnostika hemoglobinopatií a talasemií
●CDT (carbohydrate-deficient transferrin)
•Metoda: izoelektrická fokusace + imunofixace / kapilární zónová elektroforéza
•Princip: transferrin se separuje podle počtu sialových kyselin (tetrasialo vs. disialo/asialo
formy)
•Klinicky: marker chronického abúzu alkoholu (zvýšený podíl disialo- a asialo-transferrinu)
50

Denzitometrie, reflexní a vertikální fotometrie
51


●Metody kvantitativního hodnocení elektroforetických a fotometrických výsledků
•Denzitometrie
•Reflexní fotometrie
•Vertikální fotometrie
●
●
52
Metoda
Princip
Typické použití
Poznámka
Denzitometrie
Absorpce barvených pásů
Elektroforézy
Potřeba barvení
Reflexní fotometrie
Odraz světla od povrchu
Testovací proužky, POCT
Nižší přesnost
Vertikální fotometrie
Průchod světla skrz vzorek
Suchá chemie, mikrodestičky
Nutnost přesné optiky

Denzitometrie
53
●Optická metoda, která se zabývá měřením optické hustoty
●Měření intenzity zbarvení pásů po elektroforéze (např. proteinů, lipoproteinů).
●Světelný paprsek prochází barveným gelem/filmem → absorbance je úměrná koncentraci.
●Denzitometr zaznamenává měnící se hodnotu absorbance v závislosti na intenzitě zbarvení.
●Měření intenzity záření procházejícího průhlednou plochou, získává se grafický záznam
fotometrovaného úseku.
●Jednotlivé frakce dělené směsi tvoří na záznamu v ideálním případě souměrné křivky zvonovitého
tvaru. Plocha těchto píků připadající jednotlivým frakcím, je úměrná relativnímu zastoupení
jednotlivých frakcí v dělené směsi.

Denzitometrie
54
●V místě frakcí dochází k částečné absorpci záření – to se projeví při dopadu na detektor
●Po zpracování signálu získáme číselné výsledky jednotlivých frakcí.
●Kvantitativní vyhodnocení jednotlivých frakcí získaných elektroforetickým dělením bílkovin v
biologickém materiálu.
●Vedle grafického výstupu (křivka elektroforeogramu) , vypočítává software denzitogramu
procentuální zastoupení jednotlivých bílkovinných frakcí

Reflexní fotometrie
55
●
●Měření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky.
●Hodnotí se poměr intenzity dopadajícího světla a světla odraženého od barevné plochy
●Použití: suchá chemie, močová analýza, denzitometrické hodnocení tenkovrstevných chromatografů
●Reflexní fotometr: Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné
fázi se suchými činidly po jejich aktivaci vodou obsaženou v měřeném vzorku.

Reflexní fotometrie
56
●Ulbrichtova koule (integrační koule)
•Proč se používá: světelný signál odražený od reagenční plochy je slabý → koule zajišťuje jeho
zachycení a zesílení.
•Princip: dutá koule s vnitřním povrchem potaženým vysoce odrazivým difuzním materiálem (dříve
síran barnatý, dnes spíše teflon/PTFE).
•Jak funguje: světlo ze zdroje se uvnitř mnohonásobně rozptýlí a rovnoměrně dopadá na reagenční
plošku; veškeré odražené světlo je pak směrováno na detektor.
•Výsledek: přesné a stabilní měření odraženého záření, nezávislé na směru odrazu.
•Současnost: princip integrační koule se stále využívá, dnes je zabudován v optických modulech
moderních analyzátorů (suchá chemie, reflexní fotometrie).

Reflexní fotometrie
57
●Močová analýza – Urinalysis Hybrid Diuri FUS-3000Plus
Stanovené parametry: pH, nitrity, bílkovina, glukóza, ketony, bilirubin, urobilinogen, leukocyty,
krev
Postup:
•vzorek moči se nanese na diagnostický proužek,
•jednotlivé zóny proužku obsahují imobilizovaná činidla, která reagují s analyty,
•vzniká barevná reakce úměrná koncentraci analytu.
Detekce:
•intenzita odraženého světla se měří při 4 vlnových délkách (525, 572, 610, 660 nm),
•vyšší koncentrace analytu → více absorbovaného světla → výraznější zbarvení zóny.
Vyhodnocení:
•CCD kamera snímá proužek,
•software vyhodnotí intenzitu barvy a vypočítá koncentraci každého parametru.
Automatic urine analyzer - FUS-3000Plus - DIRUI Industrial - for clinical diagnostic / compact

Vertikální fotometrie
58
●Světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru.
●Využití: pro měření absorbance v jamkách  mikrotitračních destiček (ELISA)
●Speciální vertikální spektrofotometry - ELISA readr
●Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle se změří
absorbance 6 standardních roztoků o známé vzrůstající koncentraci.
●Z kalibrační křivky (naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y, hodnoty koncentrace na ose x)
se odečte hodnota koncentrace neznámého vzorku.

Hlavní části detekčních systémů
59
Metoda
Zdroj světla
Vzorek / ploška
Detektor (optický modul)
Princip měření
Denzitometrie
Halogenová/LED lampa
Gel s obarvenými pásy
Fotodioda
Absorbance – tmavší pás = vyšší koncentrace
Reflexní fotometrie
LED
Reagenční ploška proužku
Ulbrichtova koule + CCD kamera / fotonásobič
Odražené světlo – vyšší koncentrace = menší odraz
Vertikální fotometrie
LED / halogen
Kyveta, jamka, ploška suché chemie
Detektor pod vzorkem
Procházející světlo (Lambert–Beerův zákon)

Děkuji za pozornost
60