Cvičení z biochemie ÚLOHA o Důkaz prítomnosti solaninu v hlízách bramboru MM Teoretická příprava V odborné literatuře vyhledejte základní údaje o solaninu, jeho chemickém složení,konstitučním vzorci,zařazení do sy-stému organických sloučenin a fyziologickém puso - bení . Uveďte některé látky chemicky příbuzné solaninu. © Chemikálie a činidla koncentrovaná kyselina sírová, koncentrovaná kyselina octová, 1 % vodný roztok formaldehydu, 0,5 % roztok peroxidu vodíku, Pomůcky a materiál bramborové hlízy ( zelené,nezelené, s očky, bez oček a s klíčky),Petriho miska - dno, 4 krátke kapiláry nebo rai-kropipety, nerezový nůž, pinzeta, filtrační papír, podložní sklíčko, mikroskop Pracovní postup Z bramborové hlízy zelené i nezelené se slupkou nakrájejte dvakrát čtyři co nejtenší řezy a položze je do řady za sebou na dno Petriho misky nebo pro případ,že budete reakce sledovat mikroskopicky na podložní mikroskopické sklíčko . Potom na jednotlivé řezy postupně kápněte na první řez 1 -3 kapky konc.kyseliny sírové, na druhynkapku koncentrované kyseliny octové, na další kapku vodného roztoku formaldehydu a na poslední kapku 0,5 % vodného roztoku peroxidu vodíku. Přítomnost solaninu se projeví po chvilce vznikem trvá. lého načervenalého až třešňově červeného zbarvení. Hodnocení a závěry Uveďte, kterou reakcí vzniklo jaké zbarvení a jeho intenzitu. Co je to Albertiho reakce ? Cvičení z biochemie č. 4 Úloha č. 1 Chemické reakce sacharidu II Úloha č. 1 Důkaz škrobu v rostlinném materiálu Úloha č. 2 Hydrolýza bramborového škrobu Chemikálie a činidla 1 %vofoý škrobový ~ffi disodného, Lugolův roztok, Fehlingovo reagens I a II, vodný nebo ethanolocký roztok jodu, Schweitzerovo činidlo, koncentrovaná HCl, koncentrovaná kyselina sírová, vodný roztok fenolu, pevný floroglucin, ethanol Pomůcky, materiál a zařízení bramborová hlíza,semena hrachu, fazole, obilky pšenice, ovsa nebo ječmene, mikroskop, podložní a krycí mikroskopické sklo, stojan na zkumavky, 20 zkumavek, nedělená pipeta 5 ml, 2 kádinky 250 ml, kovový stojan, varný kruh, železná síťka sasbestovou vložkou, zápalky, plynový kahan, destilovaná voda, nůž, filtrační nálevka, plátěný hadřík, ruční odstředivka se dvěma zkumavkami, třecí miska s pistilem, porcelánová miska, kapátko, pipeta Pracovní postup Úloha č. 1 Důkaz přítomnosti škrobu v bramborové hlíze a semenech luštěnin a obilkách Bramborovou hlízu dobře operte, aby na ní nelpěly žádné stopy zeminy, potom ji oloupejte a z oloupané hlízy ukrojte několik kousků, které ve třecí misce dokonale rozetřete.Přidejte destilované vody a směs přefiltrujete přes kousek plátěného hadříku. Potřebujete oddělit drť tvořenou stěnami buněk od škrobových zra.Filtrát dejte i s trochou vody do centrifugační zkumavky, do druhé zkumavky dejte stejný objem vody. Potom odstřeďte škrobová zrna od vody, vodu slejte a usazená škrobová zrna dejte na porcelánovou misku. Kapátkem odeberte minimální množství vody se škrobovými zrny a dejte je na podložní mikroskopické sklíčko na pracovním stole mikroskopu. Jiným kapátkem opatrně přikápněte alkoholického roztoku jodu nebo Lugolova roztoku. Počkejte asi 2 - 3 minuty a potom pozorujte mikroskopem při středně velkém zvětšení. Zakreslete několik škrobových zrn včetně jejich barvy. Jaký mají škrobová zrna tvar a velikost ? Obdobný experiment proveďte se semeny obilovin nebo luštěnin. Porovnejte jak velikost, tak také tvar škrobových zrn z různého materiálu. Bylo by možné této skutečnosti v praxi využít? Úloha č. 2 U Jrolýza bramborového škrobu Kysf.iou hydrolýzou působením kyseliny chlorovodíkové o pH = asi 2,0 - 2,5 se škrob postupně štěpí na dextriny ( což jsou vyšší maltosacharidy), maltosu až glukosu. Dextriny^ o různé velikosti molekul lze rozlišit pomocí barevných reakcí s jodem. Maltosu a glukosu. jejictó obsah v „vdro.yzitu postupní vzrůstá, je možné dokázat m základě jejid] ^^ Pracovní postup a PoJÄ^Ä^S! S^te * 5 8ramŮ Škrob-destilovanou vodu -musíte mazem míchat skieněnOU tyčkou atvse'mľ ^ľ f ^ ^ Během vaře-uvaření mazu odeberte do ddľkSv obÍmľ^O ľ*?,?1 f ^° * neb° "V*^ ?° asi 25 ml vody ( destilované) a nakľne2Z Ko/l ^ "í.f^0^0 mazu> bdejte zahřívejte. ' naiconec 2 ml 10 % kyseliny chlorovodíkové a směs dále Každých 5 minut odebírejte zkádinkv vzorek 1 mun J 7 destilované vody a postupně tolik roTtnkľSľ Í ? zkumavky, přidejte asi 5 ml Potom přikápněíe ÄmÄÄ"^ ^ * UVOlÔUJe °Xld "»*** Hydrolýza je ukončena zTasi 3540^,*% ^T** hvdroly** přestane barvit modře, kyseliny chlorovodíkováľprovedtSSľ^ V0^ ^^ P° neUtraJizaci Hned při začátJexľermient^^^^r^^^^výmrcag^. zkumavky přiLe 5 nľde^ v^ľľodfa 0t Äľu"^ P°t ť Že d° Č1Sté zkumavek s hydrolyzátem. P LuSoIova rozt°ku, kolik dáváte do Experiment vyhodnoťte časově však ztrácí značná část jodu pro reakcľľdSrlnv „ -íf V^' teré JS0U ^barvé.Tím se Pokud budete pratvSpäS zSľ* \ ťf areVných Změn J'e P1* zkr«1^-barvou az do ^S^ ktltSľíľ ^ " «*« ™*°» 5 minut. ---------azda zkumavka predstavuje časový interval 19 ^kcecelulózv 8.4.1. REAKCE CELULÓZY SE SCHWEfTZEROVÝM ČINIDLEM Schweitzerovo činidlo je jedno z mála rozpouštědel, v němž se celulóza rozpouští aniž se chemicky mění. Pracovní postup: Do čisté zkumavky nastříhejte několik proužků čistého filtračního papíru potom pndejte 2 ml Schweitzerova činidla a jednu až dvě minuty důkladně protřepávějte. Celu.óza se začne rozpouštět. 8.4.2. VZNIK HYDROLYZÁTU CELULÓZY Pracovní postup: K roztoku ^tmé-^^iS^^Tmer^^^^^o^^ kapkácn pndavejte koncentrovanou kyselinu chlorovodíkovou. Roztok se zpočátku nemění, ale postupně začína zelenat vzniklým chloridem meďnatým a z roztoku se vyloučí celulóza ve formě hydrátové celulózy cožje rosolovitá hmota. 8.4.3. VZNIK AMYLOIDU REAKCÍ CELULÓZY S KYSELINOU SÍROVOU Pracovní postup: Ve třecí misce opatrně roztírejte tloučkem kousky čistého filtračního papíru s koncentrovanou kyselinou sírovou. Celulóza se rozpouští na nažloutlý roztok, který opatrně vlijte do ká-d.nky objemu 250 ml, v níž je 200 ml destilované studené vody. Voda se zakalí vyloučeným amyloi-dem. Odeberte vzorek a přesvědčete se, zda reaguje na jódovou zkoušku. Výsledek pozorování za-znamenejte do pracovního protokolu. 8.4.4. HYDROLÝZA CELULÓZY NA GLUKÓZU Pracovní postup: Ve zkumavce rozpusťte za neustálého protřepávání několik proužků čistého filtrač-n.ho pap.ru v koncentrované kyselině sírové a roztok opatrně vlijte do kádinky se 100 ml destilované studené vody. Vařte potom na sífce 20 minut a po 5 minutách odebírejte do zkumavek vzorky na aů-kaz glukózy Feh.ingovým nebo To.lensovým činidlem. Tyto reakce probíhají pouze v neutrá.ním nebo alkal.ckem prostředí, proto vždy před přidáním Fehlingova nebo Tollensova činidla roztok zalkalizujte roztokem hydroxidu sodného. Jakmile bude, reakce na glukózu pozitivní, přestaňte zahřívat Vysvětlete, jaká reakce proběhla a zapište její chemickou rovnici. 8.5. Důkaz faktózy v mlé! Pracovní postup: Do čisté kádinkyl^eSO m. čerstvého syrového mléka, přidejte pár kapek kyseliny octové a zvolna protřepejte. Vysráží se klW který odfiltrujte. Filtrát zneutralizujte přidáním uh.ičrtanu vápenatého a pH roztoku změřte univerzální>^dikátorovýrn papírkem. Upravte na neutrální prostře-d.. Odeberte 2 ml roztoku a proveďte zkoušku s F^^ovým činidlem a Tollensovým činidlem K ' /f / % fiEZ^~ ■víceří z biochemie ÜLOMA 3 T Důkaz přítomnosti sacharidů v přírodních _0,,,.)_1 i ovoce, zelenina, kravské mléko ) Teoretická příprava ^pracujte schema rozdělení sacharidů. napište konštituční vzorce f ^«rw k -iscnerovy projekcp T0npn sovy a Ha wort ho vy) --,-oj.ien- - ,D-_a L- a 1 dpp^atp.-sy, . C. Jľibosa ),.._._ľ ... - D-.a L- deoxiribosy ' Napište konštituční vzorce C v^^u - D p t' i, u ^dierový projekce)všech -u- a x,- aldohexo-s - D- a L- ketohexos U všech uveďte jejich názvy. PJ 5£akjfcická_část -g^gE^l^ginldla^a odměrné roztokv íehlingovo reagens' I a II m of Tr -, - ■ * to J"L» 1U ^ voany roztok A.^FO voany roztok amoniaku o c= 0, ŕ mol/dn3 vn„ \' 3 ' "' ná Hron at-' V - »^ moi/dra , iconcentrova- na HHO Sesalerovo činidlo, 30 % ^ nzto^_paítn_ - lu v e nanolu, foncentrovaná kyselina sírová, 3. * etoa-»!,«*, roztok tWu, PBvný ^01, octan .anlli™, íť-A/lnyara211Wve činidlo, koncentrovaný vodný ro l £o* -n 30*, 1 zvodný ^tokc^/et^o!^ J"-pisek, močovina, i-esorclnol, ' 4 J •?2!iig£Vj_gaterlál_a zařízení noavf :re":!e: r^ ^^ miék°- *~^ -—m - ■ Zlllt \t:OUCk^' ""»■** Papír, filtrační ná -ka ^ Aem3 ™- SÍ0Ían' nÚŽky- ^»^««™ baí- vak v^:ľ£ °m, ' tre?Sdlta' st°ían "> ^--ky, 12 «h,,. ■ i'J£&ilaC ns zkumavky ?P'nfli>v „t-.,, . ', v Pipeta C 10 en3 n« - '3^pa^' P^^v kahan, delená . ' " P° ' Clfl }> rUČní odstředivka Se zkumavkou, g£g£ovní postup 1 Příprava vJdnvch '<=-r+~»ov-»-,« j^onycn extrakou z přírodních produktů - ovo- ' .. ce) zelenina. Z čistě'opraného kořene'mrkve ukrojie několik men-^ r; ich řezů, dejte je do tree: mi.-jky, ;; ' i:'. c j t o trochu ci:;tc'io mořského nebo kře:;;-;- ::é:'io y.::."•-:u a :r;>:_ teriál Jobře roze třete. Po rozetření je^ -Krte do Erlenmey-erovy baňky a umístěte co třepačky. ^rníc potom ne chtějte 10 minut třepat. Po uplynutí 1C minut extrakt přefiltrujte a u-ebovejte ve zkumavce pro odebírání vzorků na jednotlivé důkazy sacharidů. Stejným způsobem si připravíte extrakt z jablka nebo pomeranče. Při práci se snažte používat co nejmenšího objemu vody,aby extrakt byl co nejkoncentrovanější . 2 Příprava syrovátky z kravského mléka pro důkazy cukrů. Do kád^áky (' 150 - 250 cm3) dejte kolem 100 cm3 mlé-' ka ( ne kondenzovaného nebo sušeného), přidejte několik kapek kyseliny octové a mírně zahřejte.Potom směs důkladně protřepejte,aby se vysrážel veškerý kasein . Suspensi dejte do xetriíugační zkumavky a odstřeďte ns ruční ,odstředivce..Proces odstreďovaní opakujte 2x, abyste'získali větší objem syrovátky pro další použití. Kasein pro další práci nebudete potřebovat. 3 Důkaz- přítomnosti sacharidů V získaných extraktech a syrovátce dokažte přítomnost sacharidů \ ..-■ ' - - reakcí Selivanovovou -„.reakcí Tollensovou - reakcí Thymolovou / reakcí Molischovou ŕ reakcí s močovinou •• Vždy uvedte výsledek důkazu a zdůvodněte jej. t ím,ÍĚ^m AW 'rce založené na redukčních reakcích ( rediJ-rčních vlsst-te-ch sacharide ) ľ.:oncsacharidy, aldosy, ketosy a ty oligosacliaridy,které mají volnou alespoň jednu poloacetálovou hydroxylovou -0E skupinu "iía jí redukční učiň]-:;/, proto se působením oxi -dacních činidel oxidují na aldonové kyseliny.Při těchto reakcích se oxiduje karbonylová aldehydická skupina na karboxylovou a vzniká aldonová/ky.s.elina: .' • H - C '■= O CH20H a Ido salí HO - C~ = 0 - C - OH H , « - • '" * * CH20H. a1do nová ky s e1ina Ketosy by takto reagovat neměly,protože nemají volnou poloacetálovou hydroxyskupinu,ale v závislosti na reakčních počkr.ínkách prav-d^c?dobne isornerují na aldosy, ,: a proto podle reakčních podmínek reagují stejně jako e.láo.sy: -\ CHo0H bio CH20H ketosa ii C CHgOH &■ enolizace i _______________________________> • ÍH - C = 0 ! 1 :Xi — \s — \j ~ H - C ':= O HO' - C - H epimerace CH20H | aldosa ■■% CHo0H p n r. u 1 d. H-C = 0 J C = 0 H-C - OH -1\J—\j — is. 1 strukturní HO-C - H <--------------------_ ! F-C~— Ot:? i : K-C - OK '" H-C - OH isornerace i K-C - OH ■CK^OH - - ■■------ - - CH2-OH D-fruktosa D-glukosa er>imerace H - C = 0 HO - C - H HO'- \J — AJ. K - C - OH. C - OH CH2OH-; H - D-mannosa '*-, : ^j. U r. *.--!. j_ _.. x rí-'íicci využívaných ■: joji::- ř.j:-:czu i ;: iT.r.ovení .ľ:es>ce - c- lycejné u/vkutečnují v xx'.'.a! ické" pro:;;;ředí :-ozty;;y ^olí ttž- ,kých kovu,napr.: ' mědi C-reakce Fehlingova) bizľnutu ( reakce Kylanderova ) železa. ( reakce Hagendornova - Jens e nova s feny 1ky-' drazinern) • ', stříbra ( reakce Tollensova ) Obecně: sa různých reakčních poosínek vznikají různé o- jsou ty, které se odvozují cd aldos: s) kyseliny aldonové jsou kyseliny polyhydroxynionokarbovyicvé b) kyseliny alderová jsou kyseliny polyhydrorydikarboxylové c) kyseliny uronové jsou kyseliny aldopolyhydroxykarboxylcvé r • "'- H-C=0 '(H-C-OH) ch2oh a ± ao sa n (K-C-OH). CH,OH H -C=0 (H -C-OH), CH^-OH •s.JJLDOIÍOVA KO-C=0 , - -» (H-C-OH) ''" I n HO-C=0 kys. ALDAE07A ky s. URCIIOYA'. .Reakce sacharidu s Fehl Ingo výr: realen ÚLOHA 4-1 -!l£§l;g.§_j!eh_l ingo va ^o 1 cm zahřátého vzorku sacharidu dáme reagens ( připraví se £ töku II). cm Jľehlingova cháníni 0,5 c^-3 roztoku I a 0,5 cm3roz- / .--';i reekci se ^redukuje drvený oxid Ilěďný Cuo0, v orí-a-dš použití koncentrovaných roztoku sacharidu se na stěně sku" -na viry nuže vytvořit červené něděné zrcátko ( D0 experimentu je ods-craníte konc.kyseiinou dusic-nou)/. - ÚLOHA 4-2 *?<= = !, -lssxce_Tpll en s o ve Se T čiň srucenehc nebo zahřátého vzorku sanh.^-inn -,-~-,-^,,-.- r stejný objem amoniakálního ..obtoku oxidu ľ :.říkrného ( To 11-2 :>-řovo f: inidlo ).Počle typu '--.t z ■■ arid.; ve v;;civ:u a teploty vznikne šedý koloidní roztok stříbra, nrsx-enina nebo si stříbrné zrcátko na stěnsn zkumavky. Poznámka:--íollensovo Mnidlo nikdy nepřipravujte do zásoby, protože stáním v něm vznikají explozivní clcullniny stříbra ! ! ULOIhA 4-3 Reakce Baríoedova "O—"-------------~—- Octan .Ti ě dna t ý se v prostředí octové kyseliny redukuje na oxid mědnatý.Jeho přítomnost se projeví červeným zbarvením re -akční směsi. Pro zvýšení citlivosti reakce lze použít Kelsonova činidla ( je to kyselina arsenomolycdenová), jehož reakcí s oxidem módným vzniká molybdenová modř. B Další■reakce sacharidů UL0H7 A _ / Reakce•Selivanova-WEEHUIZBNOVA V Do.zkumavky dejte 1-2 cm 30 % HCl a d o tom 1 cm "ozto!-:u vzorku cukru,dále jeden krystalek resorcinolu a směs důkladně promíchejte třepáním.Po promíchání dejte zkumavky, (podle počtu vzorků ) do zahřáté vodní lázně ■'.(-■'kádinka s teplou.vodou) a 10 minut zahřívejte. ,. . : ;i Ketosy dávají třešňové zbarvení (a Ido sy ■ takto nereagují, proto je tato reakce specifická pro ketosy )« Podstatou reakce je reakce 5-h£7°kcoxymethylíuralu ( ten se tvoří dehydratací sacharidů nspř. minerálními kj-sel inam i) s re-"sorcinolem. ■ . Zkoušek udělejte tolik, kolik máte vzorků sacharidů. ¥: JLOKA 4-5 Reakce sacharidů s močovinou yý Deriváty iuralu vzniká jící dehydratací sacharidů napr.mi-nerálními kyselinami, reaguj í -s močovinou za vzniku barevných x. duktů:./ s - ' ''''," . oro- 6 Or:C;l'e,,ny,,.ere hehe. reakcí vzniká jí.Pro*; reakce není aoecWŕ ■^ -Qcfioriay,ale nevznikne-i i m-ío^-ágt: ,^-h„ - . iJX ^ .sM-iižŕ&e zabarveni, není v — pvx 151 sacnerio. priôomen. i/lÔHA 4-7 ^g^ce thymoloví V Kekteré sacharidy reagují v silně kyselé, prostředí - ar-o *e,1Myn! roztoke, thy.olu za vzniku telového"- zbarvení. oroužÍ: "Xľ —6k<:-POdle POätU ""** CUtoŮ) ^^ P-tunně :i„3 ^l1^0^.^«..! ^ »ztoku sacharosy-a nskonec- -o..oku EalMsy.i;e?Skrohu přidejte lcra3 destilované .vcdy. / f p'ot-om cic v ;ého roztoku t. *tr £nJí^p £ několik minut pcmalu, ko:,-.HCl a Le důklad'-: ;.". -"t:'.r; .'.O i 1C- lěkclik kry-talkú KaOl. třeoejte,2by ne ~ro - ;epání ponořte zkumavky do horké voc- ô ir.es: míchala.Po 3-4 minutách t: ní lázně a za třepáni vařte minimálne 5 minut.Výsledky reakce ;lní proveďte tentýž experiment zapište do tabulky.Jano j-ioruro. s f ruleto sou. ULOHif 4-8 Reakce gachar'füu s fenyÍhadrazinem " Positivní reakci s fenyihydrasinem ( a jinými hydrasiny) dávají aldcsy i ketosy.Reakce probígá tak, že nejprve reaguje sIdosa-'TTTeSncü molekulou "f enylhy drasíHú™ža7vzniku íenýlhydra- sonu: H-C=0 (K-C-OH) i n H2Iv-^-C6H_ H-C=K-KH-C6H5 entos e hexos .3 •/e zkumavce zannvejte 1-2 cit. roztoku pentosy se stejným obje-ísni konc.HCl.Jakmile začne roztok vřít,priložte k ústí zkumavky;" proUsex'ľírírFČ linu.Vznikne červené zbarvení, typické pro .pentosy» Provedte tutéž zkaušku s glukosou. Jaký je výsledek reakce & » 8.5. Důkaz íaktózy v mléce Pracovní postup: Do čisté kádinky dejte 50 ml čerstvého syrového mléka, přidejte pár kapek kyseliny °?oVrf'h±0]na Protřepejte. Vysrážíse kasein. který odfiltrujte.' Filtrát zneutralizujte přidáním uhličitanu v^perratérrcra pH roztoku změřte univerzálním indikátorovým papírkem. Upravte na neutrální prostředí. Odeberte 2 mi roztoku a proveďte zkoušku s Fehlingovým činidlem a Tollensovým činidlem. / Úloha č. 2 / Důkaz přítomnosti sacharidů ve vzorcích ovocných šťáv Chemikálie a činidla Pro důkazy sacharidu použijeme stejné Chemikálie a činidla jako ve cvičení č. 3 Pomůcky, materiál a zařízení V práci použijeme stejné pomůcky a zařízení jako ve cvičení č. 3 Pracovní postup Důkaz sacharidů ve vzorcích ovocných šťáv provedeme mimmálně dvěma způsoby a výsledky zaznamenáme do pracovního protokolu. T üc CVIČENÍ Z BIOCHEMIE Úloha 3 & JQj^Orrrcly __/, Chemické reakce sacharidů I "Chemikálie a činidla: 3 % vodné roztoky dostupných mono sacharidů a ďisacharidů, škrob,celulosa, zásobní roztok Fehlingova reagens ( I a II), 10 % vodný roztok AgNO^, vodný roztok amoniaku o c= 2 mol/dm3, vodný roztok NaOH ( c = 2 mol/dm3, kyselina dusičná , Nelsonovo činidlo, 30 % kyselina chlorovodíková, roztok 1-naftolu v ethanolu,kyselina sírová koncentrovaná,3 % ethano -lioký-roztok thymolu, ..pevný NaCl, oetan^- • anilinu, fenylhadrazinové činidlo, kon -centrovaný vodný roztok NaOH (min. 30 %), 1 % vodný roztok CuS04, suspense Ca(0H)2 ve vodě, ethanolí Lifi*tf>fÍfdfr**<» «**'**> Pomůcky a materiál:stojan na zkumavky, minimálne 20 ks zkuma - vek, kádinky objemu min. 250 cm ,kovová trojnožka nebo kovový stojan s varným kru-* hem, železná sítka s asbestovou vložkou , lžíce na chemikálie, filtrační papír, nůžky,- plynový kahan, zápalky, pipeta 10 cm dělená, podložní mikroskopické sklíčko a mikroskop, kartáč na čištění zkumavek,mi-kropipety zhotovené z tenkostenné skleněné trubice na dávkování vzorků sacharidů, nůž na sklo ; Poznámky: při práci pracujte mimořádně pečlivě, aby nedošlo ke " z ne čišíování roztoků jednotlivých sacharidů jinými , protože by to rušilo správný průběh reakcí. Po ukončení práce veškeré sklo důkladně vymyjte a zkumavky dejte sušit do stojanu dnem vzhůru. Úloha 3.1 FEHLINGOVA REAKCE Mono sacharidy, a 1 do sy a ketosy ( ale tak* tv ni ,• -n,-^ v+ ' ty oligosacha- ndy,které mají volnou alespoň Jednu poloacetálovou -OH skup^), mají redukční účinky,proto se účinkem oxidačních činidel oxidují na aldonové kyseliny.Při reakci se oxiduj aldehydická skupina na skupinu karboxylovou,kov, *tery ,e S0Ucastí oxidačního činidla se redukuje, někdy a^na elementární formu.Redukované kovy se snadno poznávají, coz Je základem mnohých reakcí cukrů.Ketosy by se oxidovat neměly, ale protože pravděpodobně izomerují na pnslu-sne aldosy, tyto reakce rovněž poskytují c"° H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH CH20H aldosa H H-C-OH H-C-OH CH20H aldosa CH20H kyselina glukonová CHo0H I c. C=0 H-C-OH CH2OH ketosa Pracovní postup: «,„♦ ľ° "ľ* ZkmaVek dedte POStUpnl P° 1 <""3 ™dn&o rokoku Sluk0sy)fPUlctoSy>saoharoSy)maltoSy,galaktosy a laktosy a všechny zkumavky dejte zahřát do kádinky s vroucí vodou.Po dvou až třech minutách přidejte do každé zkumavky po 1 cm^ Pehlingova činidla ( 0,5 cm^ roz .. toku i a 0,5 cm? roztoku II) .Pozorujte změny ve zkumavkách a zaznamenejte je do pracovních protokolú.Doložte Q e chemickými rovnicemi. > v Při reakcích se vyfukuje červený Cu20,v případě použito, koncentrovaných roztoků dokonce elementární Cu. Úloha 3.2 TOLLENSOVA REAKCE:, Tato reakce je rovněž založena na redukčních vlastnostech sacharidu.V tomto prípade se však ( na rozdíl od úlohy 3.1) vyredukovává kovové stříbro,někdy ve formě stříbrného zrcátka. Pracovní postup: Do sady zkumavek dejte vzorky vodních roztoků sacharidů jako v úloze 3.1 a zkumavky postavte do stojanu.V samostatné zkumavce si připravte z příslušných roztoků maximálně 5 cm3 Tollensova činidla.Potom do každé zkumavky dejte asi 0,5 cm3 tohoto činidla a pozorujte , zda dochází ve zkumavkách k barevným změnám.Tu zkumavku, m........^±jd^^aei^áaM^?mx^..J^P^A^^ě.^^ž.ýP.. Jíll*1^. s horkou vodou a sledujte,za jakou dobu se barevná změna projeví. Pokud po 5 minutách zahřívaná směs nereaguje,pokus ukončete.Pří slušný sacharid je neredukující. Po ukončení pokusu ty zkumavky,kde se vyredukovalo kovové stříbro vymyjte několika kapkami koncentrované kyseliny dusičné, potom vodou. Úloha 3.3 BARFO EDOVA REAKCE V prostředí koyseliny octové se redukuje octan meďnatý na oxid měďný ( ten je Červený).Tuto reakci dávají před-■/-, nostně mono sacharidy, re dukující disacharidy až po delším ""zahřívání.Citlivost reakce lze zvýšit přidáním několika kapek Nelsonova činidla. Pracovní postup: Podle postupu v předchozích úlohách si připravte sadu zkumavek se vzorky sacharidů,přidejte po 1 cm Barfoe-dova činidla a zkumavky postavte do kádinky s vroucí vo -dou.Zahřívejte 30 minut.Potom zkumavky ochlaďte vnějším chlazením studenou vodou buď pod tekoucí vodou a nebo ponořením do kádinky se studenou vodou. Zapište si výsledky pozorování a potom do každé zkumavky přidejte 0,5-1 cm3 Nelsonova činidla.Pozorujte změny a zapište si je do protokolu. Monosacharidy dávají modré zbarvení,disacharidy žlutozelené. T Úloha 3.4 SELIVANOVA A WEEHUIZENOVA REAKCE -' Reakce je založena na vzniku červeného zbarvení, které dává 5-hydroxymethylfural s resorcinolem a kyselinou HCl. Deriváty furalu vznikají dehydratací sacharidů např.působením minerálních kyselin. Pracovní postup: Připravte si vodní lázeň se zahřátou vodou pro ohřev sady zkumavek.Do sady zkumavek ( podle počtu vzorků sacharidů) si dejte 1-2 cm3 30 % HCl,potom přidejte vždy 1 cm^ vzorku vodného roztoku sacharidu a zkumavky dejte ohřívat do vodní lázně.Zahřívejte 10 minut.Potom přidejte do každé zkumavky někol-ik krystalků resorcinolu ( lépe je přidat resorcinol před začátkem zahřívání).Ketonické sacharidy dávají třešňově červené zbarvení.Proto je tato reakce specifická pro ketosy. Úloha 3.5 REAKCE S MOČOVINOU Působením minerálních kyselin na sacharidy vznikají deriváty furalu, které reagují s močovinou za vzniku barevných produktů; fruktosa dává zelenomodré zbarvení aldohexosy červené nebo purpurové aldopentosy žluté ketohexosy modré; po přidání ethanolu a mírném zalkalizování přechází na červené. Pracovní postum: Připravte si podobně jako v předchozích úlohách vodní lázeň a zahřejte ji do varu.Do zkumavek (počet závisí na počtu vzorků sacharidů) dejte vždy 0,3 - 0,5 g močo -viny, přidejte 5-6 kapek koncentrované kyseliny chloro -vodíkové a 2 - 3 kapky vodného roztoku vzorku sacharidu. Směsí ve zkumavkách vždy důkladně,ale opatrně třepejte a potom vložte do horké vodní lázně.Reakce by se měly projevit po 15 - 20 minutách. Úloha 3.6 MOLISCHOVA REAKCE Sacharidy ( mono-,di- a polysacharidy) dávají s koncentrovanou kyselinou sírovou a 1-naftolem intenzivní fialové zbarvení.Jeho ;vznik není ještě přesně vysvětlen,ale ? "7 . 1 ^ŕj^jW'* •" zdá se, že při reakci vznikají pravdepodobne di-1-nafto-hydroxyfurylmethany, které se zrejme oxidují na príslušné trifenylmethanové barvivo. Pracovní postup: Do sady zkumavek ( podle předchozích úloh) dejte po 2 cm vodných roztoků sacharidů,zkumavky postavte do stojanu a přidejte do nich po 5 kapkách roztoku 1-naftolu v ethanolu a směsí vždy dobře promíchejte,Potom obsah každé 3 zkumavky opatrně podvrstvěte 1 cm koncentrované kyseliny sírové ( pracujte velice opatrně a pomalu),Za přítomnosti sacharidu se na rozhraní kapalin objeví modrofialový nebo červenofialový prstenec.( U monosacharidů a disacharidů ihned, u polysacharidu po chvíli). Poznámka: Tuto reakci dává fural a jeho deriváty a tedy i ty látky, z nichž za podmínek reakce fural vzniká,Proto re - akce není specifická pro sacharidy.Negativní výsledek ale svědčí o nepřítomnosti sacharidu. Úloha 3.7 THYMOLOVÁ REAKCE Některé sacharidy reagují v silně kyselém prostředí s alkoholickým roztokem thymolu za vzniku karmínového zbarvení. PracovnJĹ postup: Do sady zkumavek dejte postupně:proužek filtračního ^3 3 papíru, 0,1g škrobu a 1 cm destilované vody, 1 cm vod- 3 ného roztoku glukosy, 1 cm vodného roztoku sacharosy a 3 1 cm vodného roztoku vzorku maltosy.Potom do všech zkumavek dejte po 3 kapkách 3 % ethanolického roztoku thy - 3 molu,3 cm koncentrované HCl a několik krystalků chloridu sodného.Směsí vždy velmi opatrně ale důkladně protře-pejte a potom za třepáni 2-5 minut vařte.Po ukončení experimentu proveďte tuto reakci s fruktosou. X Úloha 3.8 ROZLIŠENÍ PENTOS A HEXOS Pracovní postup: 3 Ve zkumavce zahřívejte 1-2 cm roztoku pentosy se stejným objemem koncentrované HCl.Jakmile začne roztok vřít, přiložte k ústí zkumavky proužek filtračního papíru smočeného v roztoku octanu anilinu. Pentosy dávají touto reakcí červené zbarvení.Provedte tutéž reakci s glukosou.Dávají hexosy stejné zbarvení? Úloha 3.9 NITROCHROMOVÁ REAKCE ( Je to skupinová reakce mono- a oligosacharidů) Roztok chromanu v kyselém prostředí oxiduje všechny sacharidy ( s výjimkou nehydrplyžujícich polysacharidu) . Redukční produkty chromanu jsou zbarveny modře. Pracovní postup: Do zkumavky dejte asi 2 cnr vzorku roztoku sacha -ridu, přidejte asi 3 cnr koncentrované kyseliny dusičné (tu něpipétujte, '"äTe odměřujte odměrným válečkem) a 5 kapek roztoku chromanu didraselného.Směs dobře, ale velice opatrně protřepejte a pozorujte průběh reakce.Po -dobné úlohy proveäte s různými sacharidy; zvolte ty,které máte k disposici. Úloha 3.10 TVORBA OSAZÓNU Mono-případně disacharidy lze charakterizovat na základě jejich kondenzačních reakcí s fenylhydrazinem případně 2,4-dinitrofenylhydrazinera.Produkty; těchto reakcí se málo rozpouštějí ve vodě ale dobře krystalizují a tvoří krystaly, s typickým tvarem a ostrou teplotou tání.Nutno je pozorovat mikroskopicky. ^>JZ Pracovní postup: Roztok cukru o objemu 1 cm3 zahřívejte ve zkumavce se 3 cnr3 fenylhydrazinového činidla na vodní lázni asi 20 minut. Po této době začne vzorek se sacharidem pomalu žloutnout a po jeho ochlazení pod tekoucí vodou se vyloučí žluté krystalky osazonu.V případě pomalého chlad -nutí při teplotě místnosti se vytvoří dobře vyvinuté a dobře pozorovatelné krystalky.Pozorujte při mírnén zaclo-nenl rožného pole. Reakci proveáte se všemi sacharidy, které máte k disposici. Úloha 3.11 REAKCE GLUKOSY a) Reakce Mooreova Ve zkumavce zahřívejte 1 cnr roztoku glukosy se 3-4 kapkami koncentrovaného roztoku hydroxidu sodného . 't č 4^^ Glukosa se zacně rozkládat na a léčnou a roztok začne žloutl ľ ** ^ mr8VeGČÍ ramelem. žloutnout az hbědnout a voní ka- Tuto reakci nedává sacharosa ňnv ^ experimentem. * " dokazte to přísmg^ <® b) Reakce Trommerova Do čisté' zkumavky deite 1 ™3 , , zkumavky přidejte 1 kanku *«„;* Vellce Pon>alu po stěně »^ho.VzniL telí ;0;?zt^V0^h0 ".»**» =^™ . modrofialový), MeTy se p^l ^T r°2tok ( nik* a- «3*7 -hi^te do varu.Sloučil S^8^08 ^s— mednou.Podla koncentrace pouíí!^ , ." Zreduiu^ - o) Eeakce Tollensova Tuto reakci glukosy proveďte podle „* vodu. poale Jlz ärive uvedeného ná- Pracovní postup: Do větší zkumavky deite i k o 3 °H»»V a po malých ááYkálh !^- ^ho roztoku sa-vapenatého ( vápenné mléko) J0 ^1*^ ^^ "«asi důkladně protřepeite n»l <ľ * váPeaaého mléka *• -ápenné mléko tak To^ ľ* ^^ »^t.PřlMveJ-"* roztok přelet do d^n ľ " "^ »»<*■".*>*» «* «.« a proveďte a nLfMT^ " r°2dělte ™ - a) Obaah první „v,, v. "ledující reakce: , p5?Tni zi"-™vky zvolna zahříveite « V. které při Mhřívání proMha^;ejte a Po«»«íte změ- b) B° druhé zk<™"ky dejte k roztokmi 0 s 3 a pozorujte změny; '5 cm ethanoiu o) Do třetí zkumavky'foukeite „,• * —ty a «vně, pozortíe zle;"011 "*"* Z ^ ^ ye všech zkumavkách byl r02tnt ,. . "^ Je za studena dobře rozl Í "°Wu VáPe^° . * « tepla.proto se obsah Zfľf " ™'-a1' ~««P™t-**alí vyloučený™ Ca f OH) ľ ,ZÍ£un,av^ P** zahřívání -zpustný v etha^ol a ro2;nSě^rát **"*** » «"»« -- « «- uhličitý vy\Ué:ní°cTzZeSLtr1f'ÍVe "^ **" se rovněž vysráží. sacharatu a vzniklý CaCO^ í Úkol 1 Vypracujte podrobné schema rozdělení sacharidu. 2 Ne příkladu liboIné aldohexosy a ketohexosy uveďte všechny užívané vzorce sacharidu( vzorce molekulové soúhrnné,Fischerovy,Tollensovy s poloacetálovou vazbou, vzorce Haworthovy,vzorce konforme ční) a potom u-dejte příklady D- a L-konfigurací,epimerii, anomerii, furanosu,pyranosu, židličkové uspořádání C. (dříve C1) a 1C4 '{ dříve 1C). 3 Na příkladu glukosy nebo jiné hexosy vysvětlete oxidaci sacharidů na kyselinu glukuronovou, glukonovou a cukrovou a vznik glukuronidů. Ä i C V ÍČEK í V, BIOCHEMIE ' úloho 9 Chr-nác'-ié vlastnosti a reakce bílkovin A Chemikálie a činidla: sírsn amonný - pevný, destilovaná voda ředěný roztok CuSO. (0,5$), ředěný roztok BaCl0 ( 0,5%),ředěný roztok Fb(N0.)2 (0,-^J), vodný roztok formaldehydu,octová kyselina, 10^ vodný roztok hydroxidu sodného, chlornan alkalického kov; /WfcAyXp 1--n-aftol, kyselina dusičná konc., sulfanilová ky #*ld»4. selina, dusitaiWřodný, NapCO.,}glyoxalová ley sel i.' kyselina sírová konc.,ninhydrin,octan olovnatý, Pomůcky a materiál: plynový kahan,zápalky,syrové vejce,stojar na zkumavky, 15 zkumavek, kádinka 250 cm-3, ty cink na míchání, stojan, filtrační nálevka, vata,kádin 3 100 cm , filtrační kruh, špachtilčka a nebo malé lžíce na chemikálie, rynl^z^ vodného roztoku formaldehydu (formalinu) a do druhé zkumavky stejné množství kyseliny octové.Obsahy zkumavek protřepejte,pozorujte a výsledky pozorování zapište.Po zápisu výsledku pozorování zřeďte obsahy zkumavek 2 cm3 destilované vody, protřepejte, znovu pozorujte a výsledky pozorování opět zaznamenejte do protokolu. Jaký typ srážení se ve zkumavkách uskutečnil ? # 6. Biuretová reakce bílkovin %.' Do zkumavky dejte 1,5 cm3 vodného roztoku bílku nebo jiné bílkoviny a roztok zalkalizujte přidáním 0,5 cm3 10% vodného roztoku NaOH. Směsí důkladně protřepejte a potom do roztoku přidejte kapku silně zředěného vodného roztoku CuSO, a znovu obsahem zkumavky důkladně protřepejte. Pozorujte změny ve zkumavce a zaznamenejte výsledky pozorování. Reakce se nazývá biuretová od biuretu,kondenzačního produktu dvou molekul močoviny: Tuto reakci dávají i jiné sloučeniny,které mají aspoň dvě peptidické skupiny -NH-CO- .K těm patří peptidy od tripeptidú výše a samozřejmě i bílkoviny.Pozitivní reakci dává i seskupe- 2 4 T m -CS-NH- a =CH-NH- , histidin a arginin. 7. Reakce Sakaguchiho Bílkoviny poskytují s bromnanem, prípadné s chlornanem a alfa naftolem v alkalickém prostředí červené zbarvení.Reakce je podmíněna přítomností guanidinové složky argininu. Reakci provedeme tak, že ke zalkalizovanému vzorku bílkoviny nebo argininu přidáme 0,5 cm3 alkoholického roztoku alfa naf-tolu a nakonec několik kapek roztoku bromnanu. Vznikne malinově červené zbarvení. 8. Reakce xanthoproteinová Aromatické aminokyseliny (tyrozin,tryptofan) dávají výraznou reakci s HN03 "Jejich benzenová jádra se nitruj í a dávají žlutě zbarvené nitrosloučeniny.Rovněž většina bílkovin se při zahřátí s kyselinou dusičnou barví žlutě ( řecky xanthos žlutý). Při působení koncentrované kyseliny dusičné na kůži, nehty,vlnu a pod. se rovněž objevuje žluté zbarvení.Působením -alkalií vzniká oranžově zbarvená sul aci-formy nitrosloučeni-ny. 3 f &'/*^*^ £ K 1,5 cm3 vodného roztoku bílkoviny ve zkumavce přidáme opatrně asi 0,5 cm3 konc.HN03. Vzniká žluté zbarvení až sraženina. Po ochlazení a zalkalizování 10% roztokem NaOH se barva změní ze žluté na oranžovou. 9. Pauliho reakce Tyrosin spolu s heterocyklickým histidinem je reagující složkou při. Pauliho reakci!Tyto aminokyseliny at volné nebo jejich zbytky vázané v bílkovinách, poskytují s diazotovanou kyselinou súlfanilovou v alkalickém prostředí oranžově červené kopulační produkty. Ve zkumavce si připravíme Pauliho reagens tak,že smísíme o 3 2 cm roztoku kyseliny sulf anilové s 0,5 ( případně 0,2) cm roztoku dusitanu a smísíme protřepáním.Do zkumavky dáme 1-2 cm roztoku vzorku bílkoviny a přidáme asi 0,5 cm Pauliho činidla a tolik roztoku Na2C03 o koncentraci 3 mol/dm ,aby reakce byla zřetelně alkalická. V případě přítomnosti uvedených aminokyselin nebo jejich zbytku se objeví oranžově červené zbarvení. 4 4 $ů^¥f^j X* 10. Adamkiewiczova reakce 3 Do zkumavky nalijeme vzorek bílkoviny,t.j. asi 1 cm a přidáme téměř stejný objem kyseliny glyoxalové (Adamkiewicz- ovo činidlo) nebo kyseliny octové, která téméž vždy obsahuje kyselinu glyoxalovou, velmi opatné v silně nakloněné zkumavce podvrstvíme asi 1 cm3 kyseliny sírové koncentrované. Po chvíli se na rozhraní kapalin objeví červenofialový prstenec. 11. Reakce ninhydrinová Reakci s ninhydrinem poskytují všechny volné aminokyseliny a peptidyr*"z"aminokyselinových zbytků vázaných v bílkovinách reaguje ovšem-pouze lysin. Zkoušku provedeme tak,že ke vzorku 1-2 cm3 bílkoviny přidáme asi 0,3 cm3 roztoku ninhydrinu a důkladně povaríme.V pozitivním případě vzniká fialově modré zbarvení. 12. Reakce Hellerova Do zkumavky dáme asi 1 era3 kone.kyseliny dusičné a potom pomalu po stěně zkumavky,kterou držíme šikmo opatrně přidáváme vodhý roztok bílku .tak,aby se kapaliny nesmísily.Na jejich rozbíraní se vytvoří bílý prstenec sražené bílkoviny. 13. Reakce na síru v bílkovinách Zkoušku na přítomnost síry provedeme následujícím způsobem. Do zkumavky nalejeme asi lem3 0,5% octanu olovnatého a 10% roztoku NaOH.Vytvoří-li se bílá sraženina, přidáme právě tolik roztoku hydroxidu, aby se sraženina rozpustila.K tomuto roztoku přilejeme několik kapek bílkovinného roztoku a směs opatrné chvíli povaríme. Roztok zhnědne nebo zčerná. 5 .yjr—^pjj. * í:, /y/o kasem + vápenatá sůl vápenatý . :. s kyseliny '\... Kasein je nerozpustný, ve vodě,ale rozpouští se roztocích al-kalických hydroxidů. V nadbytku kyseliny se rovněž rozpouští, protože obsahuje bazické skupiny....... "— ........■'. řfi kysání mléka-vzniká vlivem enzymů způsobujících kva- • šenálaktosy mléčná kyselina, která způsobí vy srážení kasienu. Tak jako většina bílkovin i kasein má nejmenší rozpustnost v okolí svého izoelektrického bodu,který je pH = 4,8.Samotné mléko má pH 6,6 - 6,9. Bílkoviny jednoduché,prosté,proteiny,holoproteiny Jsou to látky složené z mnoha zbytků a mino karboxylových kyselin ( molekulová hmotnost do 10.000 přísluší peptidům,nad lOoOOO pak bílkovinám).Patří k nim např. albuminy a globulíny. AIBUMINY obsahují vázané diaminokarboxylové kyseliny .Ve vodě jsou rozpustné.Ze svých neutrálních roztoků se- nésrážejí '^nasyceným srážejí "se síranem amonným a varem. Jt^ f*#/^#f^ TP Albuminy se srážejí rovněž minevílnímí kyselinami. V mléce je v pialéro mntfž.stv/' přítomen albumin irtléčný, v jcrevníw seru ajfeumifly SeroV<á ( ::•:. :-un;'0 burniny), v oční čočce jsou přítomny krvíľtoľ! iny, rcučúct í hc.oglobinu je albumin ^lobin, ve vaječném žloutku je a I V.ur.-.": r. vaječný , semenech hra-; h u legumelin, v obilí leuk.es in a pod. GLOBULUS jsou ve'vodě nřorozpústné,ale rozpouštějí se už v ředěných roztocích solí, zředěných kyselinách a louzích. Z neutrálních roztoků se srážejí na oř. síranem amonným,horečnatým a dalšími solemi nebo varem.;.'ezi globulin,, patří např. ™~"~gIoMnľny"serove^mlečne T'"lkM^'iľ6S^i^J^val^^"r'^osío -buliny),fibrinogen, globulíny vaječné ( ovoglobuliny), v bramborách je tuberiň a pod. F Praktická část - Chemikálie a činidla ředěný- roztok síranu meďnatého, 5-10 % vodný roztok hydroxidu sodného,- octová kyselina,kyseliny chlorovodíková, dusičná, sírová, destilovaná voda, pevný síran amonný,vodný roztok formaldehydu, octan olovnatý, ethanol,Millonovo činidlo, nekondenzované syrové kravské mléko,nabotnalá semena hrachu, . Pomůcky a materiál plátěný hadřík,filtrační nálevka,filtrační kruh,stojan na zkumavky, sada zkumavek,lžíce na chemikálie, mikropipeta, plynový kahan,zápalky, odsávací.nálevka, Buchnerova baňka, filtrační, papír, nůžky, kádinka 250 cm3-, tyčinka (-skleněná), ze O lezná sítka s azbestovou vložkou ; J-čj/p/t,,("h f *'// ňyrfjrk* OKOL 10.1 . Isolace kaseinu z mléka Pracovní postup Do kádinky dejte asi 100 cm. ' syrového mléka,zahřejte je na teplotu kolem 40°C a za míchání pomalu přidávejte octovou kyselinu nebo kyselinu minerální) .Během přidávání sledujte pH roztoku,které by nemělo klesno.ut pod pK=5.Jakmile se vysrážíkasein,přestaňte přidávat kyselinu a vy -srážený kasein odfiltrujte buď na odsávací baňce a-nebo P?es pláten:; n^evr.v ?Jaílf-fc. ( Pm,^„, " - * .lanu probíhá ?on:ň]i; n —-tnč) Pil t rát usc:-:ov^te •••-v, r»~ —,-nebo z haoríku nc cJyoi_ ...-. t _ , , ilJt- f" , i * """' i-°»i- •'-Oo:::.:r.i premytí de^ilninnon vodou preneste do čisté zku^vky -^d-t* „ * . "3^lovanou vane vody a protWt- " " °S1 ° °m äeßUi°- V další-fází mH-ľ-i-^^ j- 1 i. .- " i'0-tu1,uj,e .okto: ze zkumavky s dob*e ,ro- 3 „ ~ k'"'lnL> '" destilované vodě odebe-te --i 1 o*J do další zku*avVv,po kapkách přidávejte 5 10-1/ tok NaCH a vždy dobře ^ot*=—tP '- ľ ^ r°Z" síranu »SäJtího.R 0f se "noto ^V11"* '"^ «***„ «kaz pHtom„osti Mikovy —„ofislově «»»rvi - ' tože ve zkumavce bude Dr0Mh- np , ^ POSt* °Pat™.P^ teplo-a obsah tav^ ---Ixzace.bude se uvolňovat bude opět vytvářet. ^t«*nout do očí ISraženina se &CCL 10.2 " ,- Další úkoly prováděite s fiit^t™ nu. filtrátem získaným po oddělení kasei- ie 2lT' mľátU býVá bezba^-kdy az nazelenalý - to 1e Oe závisle na tom, jaký. krmivem se krmí dobvtek Oh l ■ íadou Lakcl 'ZeJmena *"* alta-.«-ý lze dokázat. Ze zkumavky s filtrátem odebíreitp «<,,• -, 3 vždy do nové zktmpvw „ í 3 S-3S1 po 1 cm roztoku a) j!J* y Provedte následující zkoušky - reakce aj srazem vodným roztok™ ^™t^w„ ' * reai.ee. -d) reakci biuretövou > ^f^ /a^*; " -' e) reakci xantoproteinovou • ' .. f) srážení roztokem soli těžkého Jcovu -^ •; ./.Všechna pozorování podrobně 2apište do protokolu. ů&9H. ÖKOL 10.3 Reakce lec-sninr. zo same n hrochu setého Několik se-ei: hrochu ( nebo čočky) nechejte ve* vle^n;' vod< dokonale nabotnat .^ctom několik semen de - ••' - - j a s asi 3 cm do: tilov-r;c vody dobře rozet"ete .Potom homo-genát dejte do "rlenmayerovy banky kterou uzavřete o nechej-na třepačce asi 10 minut třepat,aby se maximálně vyluhovaly rozpustné bílkoviny. Po protřepání proveďte filtraci přes plátěný hadřík; tuhé zbytky vyhoďte do odpadu a s filtrátem,který obsahuje bílkovdnu legurnin proveďte reakce na bílkoviny - viz úkol T0.2 .........——^~ - ■■■-......-■•-•■.....=■■•■ -^.........- -,.^-,....... ..."..:.. ..,. Výsledky srovnej et s výsledky reakcí ks se inu. ..^-"- KZI. í. í. Pŕrsa CVIČENÍ ;■ BIOCHEMIE / ^ T% £ého kov PěJJtfAo 1-r.aftol, kyselina dusičná kone ., sul fsnrlová kv hfUti zelina, dusitan-Bodný, Na2C03 ,glyoxa3 ová kyselí: kyselina sírová kone , .ninhydrin, octan olovnatý, Pomůcky a materiál: plynový kahan,zápalky,syrově vejce,stojar na zkumavky, 15 zkumavek, kádinka oz ^ +,r^-na míchání, stojan, filtrační nálevka, vata , káčirí 100 cm , filtrační kruh, špachtilčka a nebo rzal-lžíce na chemikálie, -J■■■ ~r>> ■- ,, ^ , ;^ Poznámky: všechny úkoly v tomto laboratorním cvičení patrí mezi srážecí nebo barevné reakce bílkovin.Jsou t to reakce citlivé,proto je třeba používat čisté?: skla,čerstvých roztoků činidel a používat takž : d ěných roztoků činidel,protože při zeužizí lotrovaných roztoků jsou zbarvení produktů špatně : nebo vůbec nepozorovatelná. Po každé reakci nutno zkumavky vymýt za soužití kartáče na zkumavky a ne pouze vypláchnout. Během všech experimentů používejte destilované v.:. 4- 1. Připrava roztoku bílkoviny vaječného .bílku ,Nad kádinkou objemu 250 cm3 se" 150 cm3 destilované vody opatrně rozbijeme syrové vejce tak/abychom oddělili bílek od žloutku. Žloutek přeneseme do čisté kádinky, stačí objem 150 cm a použijeme jej k dalším zkouškám: "'Bílek rozpustíme v kádince za míchání tyčinkou. Po dokonalém''rozpuštění bílku roztok přefiltrujeme přes chomáček čisté vaty nebo čistý plátěný hadřík do čisté Erlenmeyerovy baňky objemu kolem 250 cm3. Filtrát budeme používat ke zkouškám a ďalším experimentům. 2.. Nevratné srážení bílkoviny teplem— Do zkumavky dáme 1-2 cm3 roztoku bílku a za protřepávání zahříváme nad plynovým kahanem. Bílkovina se vysráří. Pozorujte,zds zůstane sraženina zachována i po ochlazení roztoku. Zůstane-li zachována vysvětlete o jaký typ srážení jde. 3. Působení neutrálních solí na roztoky bílkovin Do zkumavky s 1,5 cm3 roztoku vaječného bílku přidejte špachtličkou po malých dávkách asi 0,5 g' pevného síranu amonného. Po každé dávce síranu obsahem zkumavky zvolna, ale důkladně protřepejt^Sůl přidávejte tak dlouho, dokud se nezačne bílkovina šrám. Potom přidejte ještě jednu dávku soli, protŕepejte, nechte chvíli ustát, pozorujte a výsledek pozorování zapište do protokolu. Po zápisu výsledku pozorování přidejte do zkumavky asi 1 cm destilované vody,obsahem opět protřepejte a znovu pozorujte.Výsledek pozorování opět zapište do protokolu.O jaký proces šlo ? 4. Reakce bílkovin s roztoky solí těžkých kovu Do tří zkumavek dejte po 1,5 cm3 vodného roztoku bílku a potom do 1 první zkumavky přidejte několik kapek 0,5% roztoku CuS04 druhé zkumavky přidejte několik kapek 0,5% roztoku BaCl2 třetí zkumavky přidejte několik kapek 0,5% roztoku Pb(N03)2 . Obsahy zkumavek protřepejte a pozorujte. Výsledky pozoro-Viani zapište. Potom do všech zkumavek přidejte po dvou cmJ destilované vody a opět protřepejte.Rozpustila se sraženina ? Jak typ srážení proběhl ? Äy 5. Reakce bílkovin s aldehydy a karboxylovými kyselinami Do dvou zkumavek dejte po 1,5 cm vodného roztoku bílku a potom do první' zkumavky dejte několik kapek vodného roztoku formaldehydu (formalinu) a do druhé zkumavky stejné množství kyseliny octové.Obsahy zkumavek protřepejte,pozorujte a výsledky pozorování zapište.Po zápisu výsledku pozorování zřeďte obsahy zkumavek 2 cmJ destilované vody, protřepejte, znovu pozorujte a výsledky pozorování opět zaznamenejte do protokolu. Jaký typ srážení se ve zkumavkách uskutečnil ? 6. Biuretová reakce bílkovin i-' Do zkumavky dejte 1,5 cm vodného roztoku bílku nebo jiné bílkoviny a roztok zalkalizujte přidáním 0,5 cm3 10% vodného roztoku NaOH. Směsí důkladně protřepejte a potom do roztoku přidejte kapku silně zředěného vodného roztoku CuS04 a znovu obsahem zkumavky důkladně protřepejte. Pozorujte změny ve zkumavce a zaznamenejte výsledky pozorování. Reakce se nazývá biuretová od biuretu,kondenzačního produktu dvou molekul močoviny: Tuto reakci dávají i jiné sloučeniny,které mají aspoň dvě peptidické skupiny -NH-CO- .K těm patří peptidy od tripeptidů výše a samozřejmě i bílkoviny.Pozitivní reakci dává i seskupe- 2 ní -CS-NH- a =CH-NH- , histidin a arginin. 7. Reakce Sakaguchiho Bílkoviny poskytují s broronanem, případně s chlornanem a alfa naftolem v alkalickém prostředí červené zbarvení.Reakce je podmíněna přítomností guanidinové složky argininu. Reakci provedeme tak, že ke zalkalizovanému vzorku bílkoviny nebo argininu přidáme 0,5 cm3 alkoholického roztoku alfa naf-tolu a nakonec několik kapek roztoku bromnanu. Vznikne malinově červené zbarvení. £| 8. Reakce xanthoproteinová t> Aromatické aminokyseliny (tyrozin,tryptofan) dávají výraznou reakci s HN03 Jejich benzenová jádra se nitruj í a dávají žlutě zbarvené nitrosloučeniny.Rovněž většina bílkovin se při zahřátí s kyselinou dusičnou barví žlutě ( řecky xanthos - žlutý). Při působení koncentrované kyseliny dusičné na kůži, nehty,vlnu a pod. se rovněž objevuje žluté zbarvení.Působením alkalií vzniká oranžově zbarvená sul aci-formy nitrosloučeniny. 3 K 1,5 cm3 vodného roztoku bílkoviny ve zkumavce přidáme opatrně asi 0,5 cm3 konc.HN03. Vzniká žluté zbarvení až sraženina. Po ochlazení a zalkalizování 10% roztokem NaOH se barva změní ze žluté na oranžovou. 9. Pauliho reakce — Tyrosin spolu s heterocyklickým histidinem je reagující složkou při Pauliho reakci.Tyto aminokyseliny ai volné nebo jejich zby-cky vázané v bílkovinách, poskytují s diazotovanou kyselinou sulfanilovou v alkalickém prostředí oranžově červené kopulační produkty. Ve zkumavce si připravíme Pauliho reagens tak,že smísíme 2 cm3 roztoku kyseliny sulfanilové s 0,5 ( případně 0,2) cm roztoku dusitanu a smísíme protřepáním.Do zkumavky dáme 1-2 cm3 roztoku vzorku bílkoviny a přidáme asi 0,5 cm3 Pauliho činidla a tolik roztoku Na2C03 o koncentraci 3 mol/dm3,aby reakce byla zřetelně alkalická. V případě přítomnosti uvedených aminokyselin nebo jejich zbytku se objeví oranžově červené zbarvení. 4 10. Adamkiewiczova reakce Do zkumavky nalijeme vzorek bílkoviny,t.j• asi 1 cm3a přidáme téměř stejný objem kyseliny glyoxalové (Adamkiewicz-ovo činidlo) nebo kyseliny octové, která téměž vždy obsahuje kyselinu glyoxalovou, velmi opatně v silně nakloněné zkumavce podvrstvíme asi 1 cm3 kyseliny sírové koncentrované. Po chvíli se na rozhraní kapalin objeví červenofialový prstenec. 11. Reakce ninhydrinová Reakci s ninhydrinem poskytují všechny volné aminokyseliny a peptidy. Z aminokyselinových zbytků vázaných v bílkovinách reaguje ovšem pouze lysin. Zkoušku provedeme tak,že ke vzorku 1-2 cm bílkoviny přidáme asi 0,3 cm3 roztoku ninhydrinu a důkladně povaríme.V pozitivním případě vzniká fialově modré zbarvení. £Jl2. Reakce Hellerova 9 Do zkumavky dáme asi 1 cm3 konc.kyseliny dusičné a potom pomalu po stěně zkumavky,kterou držíme šikmo opatrně přidáváme vodný roztok bílku tak,aby se kapaliny nesmísily.Na jejich rozhraní se vytvoří bílý prstenec sražené bílkoviny. 13. Reakce na síru v bílkovinách Zkoušku na přítomnost síry provedeme následujícím způsobem. Do zkumavky nalejeme asi 1 cm3 0,5% octanu olovnatého a 10% roztoku NaOH.Vytvoří-li se bílá sraženina, přidáme právě tolik roztoku hydroxidu, aby se sraženina rozpustila.K tomuto roztoku přilejeme několik kapek bílkovinného roztoku a směs opatrně chvíli povaríme. Roztok zhnedne nebo zčerná. 5