Mikroby a lidské tělo Mikrobiologie a imunologie – RV2BP_MIKR Ondřej Zahradníček zahradnicek@fnusa.cz Kostka Abych se představil lMUDr. Ondřej Zahradníček lpovolání: klinický mikrobiolog, asistent na LF MU; učíme u nás bakalářské obory, mediky, zubaře i studenty PřF a od předloňska i PedF lbudou se střídat přednášky a cvičení lzájemci se u mne mohou přihlásit a mohou se přijít podívat přímo k nám Učební materiály lOdpřednášené prezentace budou vyvěšeny ve Studijních materiálech předmětu lTamtéž také visí skripta lV případě zájmu mohu dodat různé další materiály Náš ústav Provoz (analýza klinických vzorků) Výuka Výzkum Obrázek1 Foto: Archiv MU V naší praktikárně PC210117 Foto: Archiv MU Mikroby a lidské tělo lSoučasné děti vědí často velmi mnoho o zvířatech v ZOO, o rostlinách v zahradě i v lese, díky naučným seriálům vědí i něco o evoluci, o buňce, i o orgánových systémech lidského těla lVědí ale málo o organismech, které žijí v nich samých; pokud už se dozvědí něco o mikrobech, jsou to spíše organismy z potoka či z lesní hrabanky než ty, které osidlují je samé Mikroby v lidském těle lKaždý z nás si s sebou neustále nosí přibližně kilo mikroorganismů. Nejvíc je jich ve střevě. Proto taky je těch mikroorganismů, co s sebou máme, o něco víc, když jdeme „na velkou“, ne když se odtamtud vracíme J lKromě toho neustále potkáváme různé mikroby, které nás přechodně osidlují a mohou být na povrchu našeho těla nebo uvnitř něj nalezeny lA konečně jsou tu i mikroby, které nám škodí a způsobují infekční nemoci či různé záněty Jsou vlastně hodné, nebo zlé? lMach a Šebestová se ocitli v krku svého spolužáka Kropáčka, aby zabíjeli zlé bakterie. Obecně představa mnoha laiků je, že bakterie jsou něco zlého, škodlivého, způsobujícího nemoc lVe skutečnosti z tzv. „klinicky významných mikrobů“ jsou mnohé buď neškodné, anebo školí jen za určitých okolností: například když se přemnoží a dostanou se tam, kam nemají Kdo zkoumá mikroby lMikroby se zabývají mikrobiologové. Mikrobiologie spadá pod biologické vědy a jako taková se studuje na přírodovědeckých fakultách lMikroby lidského těla se zabývají kliničtí mikrobiologové. Klinická mikrobiologie je přechodný obor mezi biologickými a lékařskými vědami. Kliničtí mikrobiologové jsou proto dílem lékaři a dílem přírodovědci, případně jiní odborníci Co zkoumají kliničtí mikrobiologové lKliničtí mikrobiologové ani tak nezkoumají mikroby, od toho jsou mikrobiologové „classic“, ti, kteří dělají analýzy DNA a hledají vzájemné příbuzenské vztahy mezi mikroby, jejich vlastnosti a složení lKliničtí mikrobiologové spíše zkoumají (někdy velmi křehké J) vztahy mezi mikrobem a jeho hostitelem. Klinického mikrobiologa většinou nezajímá izolovaná Escherichia coli, ale spíše třeba Escherichia coli adherovaná na stěnu močového měchýře. Escherichia coli v močovém měchýři 19 Bladder epit cell with e coli http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Escherichia 69 virus-HIV-01 Virus HIV http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm 74 virus-ebola-Filoviridae Ebola http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm Co je to mikrob lMusí to být živé. Zrníčko prachu není mikrob, i když je mikroskopické lMusí to být mikroskopické. Žirafa není mikrob, i když je živá lZ druhé podmínky se připouštějí výjimky. Třeba tasemnice patří do mikrobiologie přesto, že mohou mít deset metrů. Ale jejich vajíčka jsou mikroskopická. 35 10 Bakterie Helicobacter a kolem ní schematicky její genom http://biology.plosjournals.org/archive/1545-7885/3/1/figure/10.1371_journal.pbio.0030040.g001-M.jp g Co jsou všechno mikroby lMikroby jsou tedy například mikroskopické řasy a sinice, archea (dříve archeobaktérie), různé organismy schopné vydržet hluboko pod mořem nebo v extrémních podmínkách horkých pramenů lJako klinického mikrobiologa mne tyto mikroby neživí, přesto musím uvést, že jsou zajímavé a úžasné Co tyhle mikroby umí lPřežívají v moři v hloubce 10 km lPřežijí i teploty kolem 110 stupňů Celsia lVydrží značnou radioaktivitu lJsou schopny místo kyslíku „dýchat“ síru či dusík (zkrátka, mají jiný akceptor elektronů než atom kyslíku) lMnoho věcí ovšem umějí i mikroby lékařsky významné, jak si povíme dále 18 meningokokken_250 Neisserie www.meningitis.de/erreger/meningokokken.html. Klinicky významné mikroby lKlinicky významné mikroby jsou takové, které jsou významné pro lidské tělo (ne tedy pro člověka = tvůrce, ale pro člověka = objekt) l„Významné pro tělo“ ani zdaleka není totéž jako „tělu škodlivé“. Naopak, mnohé jsou neškodné, nebo dokonce pomáhají lKaždý organismus má své klinicky významné mikroby: člověk, každý druh zvířete či rostliny. Dokonce i mikroby (třeba bakterie) mají své mikroby (bakteriofágy). 20 10 Neisseria gonorrhoeae http://medicine.plosjournals.org/archive/1549-1676/2/1/figure/10.1371_journal.pmed.0020024.g001-M.j pg Hlavní klinicky významné mikroby lViry (a priony) lBakterie (třeba streptokok nebo Escherichia) lHouby (kvasinky a plísně) lParaziti – přesahují pojem mikrob: –Vnitřní paraziti lPrvoci (třeba původce malárie) lMotolice (třeba motolice jaterní) lHlístice (třeba roup nebo škrkavka) lTasemnice (třeba tasemnice dlouhočlenná) –Vnější paraziti (vši, blechy, štěnice) 09 Listeria Listeria monocytogenes http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Listeria 28 rhinovirus-icosaedre01 Virus běžné rýmy http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm Tvary a uspořádání bakterií lKoky ve dvojicích (diplokoky), v řetízcích a ve shlucích (neříkejme raději „streptokoky“ a „stafylokoky“, bylo by to matoucí) lTyčinky rovné či zahnuté (vibria), případně několikrát zahnuté (spirily), krátké nebo dlouhé, tvořící až vlákna či rozvětvená vlákna; konce mohou být oblé či špičaté a i tyčinky můžou být různě uspořádané lSpirochety – tenké spirálovité bakterie lBeztvaré bakterie, například mykoplasmata (nemají buněčnou stěnu, takže nemají tvar) 06 ECFS Koky v řetízcích (elektronová mikrofotografie Enterococcus sp.) http://www.morgenwelt.de/typo3temp/5ce14d39b5.jpg Zprohýbaná tyčinka – helikobakter 39 helicobacter%20pylori http://vietsciences.free.fr/nobel/medecine/images/helicobacter%2520pylori.JPG Spirochety 11 treponema 53 kansen_02 idsc.nih.go.jp/.../k03/k03_012/k03_012.html www.primer.ru/std/gallery_std/treponema.htm Typ buněčné stěny bakterií lGrampozitivní bakterie mají tlustou a jednoduchou buněčnou stěnu. Jsou odolné hlavně mechanicky. Při barvení podle Grama jsou fialové. Například stafylokoky. lGramnegativní bakterie mají tenkou, ale o to složitější buněčnou stěnu. Jsou odolné hlavně chemicky. Při barvení podle Grama jsou červené. Například escherichie. lGramem se nebarvící bakterie buněčnou stěnu nemají (mykoplasmata) nebo ji mají hodně jinou (mykobakteria). Grampozitivní gm+%20cell%20wall Gramnegativní gm-%20cell%20wall mixed%20gram G+ G– http://www.arches.uga.edu/~emilyd/mibo3510/gm-%2520cell%2520wall.jpg Bakterie s bičíky (Escherichia coli) 03 escherichia_coli_1 http://www.biotox.cz/toxikon/bakterie/bakterie/obr/escherichia_coli_1.htm Pouzdro a biofilm lPouzdro obklopuje jednotlivou bakterii, popř. dvojici. Není to už integrální součást bakteriální buňky, spíš nánosy molekul (většinou polysacharidů), které buňku chrání lBiofilm je souvislá vrstva, vzniklá z bakterií, jejich pouzder a dalšího materiálu. Biofilm je mnohem odolnější než jednotlivá bakterie, žijící v tzv. planktonické formě. O biofilmu bude více v další části této prezentace Neobarvené pouzdro lV barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí dobarveno tuší; mikroskopista pak tuší pouzdro tam, kde se nic neobarvilo 05 Burri http://pathmicro.med.sc.edu/fox/capsule.jpg Vznik biofilmu lNa začátku je pevný povrch a plovoucí bakterie + lBakterie přilne na povrch lNásleduje shlukování dalších bakterií lBakterie začnou produkovat polysacharidovou hmotu lAž vznikne třídimenzionální struktura zvaná biofilm l Detekce biofilmu na jazyku J uPC210110 Červený jazyk jedné studentky v praktiku věnovaném průkazu ústního biofilmu Foto O. Z. Význam tvorby biofilmu u bakterií lBakterie mohou lépe regulovat početnost populace – v rámci biofilmu se totiž informují produkcí určitých látek (tzv. quorum sensing) lBakterie se stávají odolnější vůči vnějším vlivům: –desinfekčním prostředkům –antibiotikům (nemusí zabrat!) –imunitní reakci hostitele lBiofilm tvoří jak bakterie běžné lflóry (z hlediska organismu spíše lpozitivní), tak i patogeny. E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Obrazky na prezentace\Vladane\Foto na web\Tol 01.JPG Foto: Archiv Veroniky Holé Patologický biofilm – příběh lMuž, 58 let, v roce 2001 zaveden kardiostimulátor, v roce 2002 opakovaně hospitalizován na interním oddělení s teplotami nejasného původu lV kultivaci krve (hemokultivaci) prokázán Staphylococcus epidermidis s velmi dobrou citlivostí lNěkolikrát dlouhodobě přeléčován vysokými dávkami antibiotik v kombinacích lZpočátku vždy dobrá odezva, poté se ale vždycky objevují znovu teploty. lJe proto nasazena terapie velmi silnými antibiotiky, po zlepšení stavu je pacientovi vyměněna elektroda a to vede k celkovému zlepšení stavu pacienta. Příběh – pokračování Sporulace lSporulace je něco jako zimní spánek, ale mnohem dokonalejší než je zimní spánek zvířat. Opakem spory je vegetativní forma života buňky lSpory přežijí velmi vysoké teploty, vyschnutí, desinfekci a podobně lSpora vzniká tak, že se buňka rozdělí na dvě části. Ty se však neoddělí úplně: jedna, ze které se stane spora, je obklopena tou druhou, které zůstává vegetativní forma. Takové spoře říkáme endospora lV extrémních podmínkách vegetativní buňka hyne a zůstane pouze spora lZa příznivých podmínek spora vyklíčí lNepleťme si spory bakterií a spory hub! 21 bacillus Spory jsou biochemicky neaktivní, samy o sobě se nebarví při téměř žádném barvení www.cropsoil.uga.edu/~parrottlab/Bugs/index.shtml Fyziologie a metabolismus bakterií lTak jako každý organismus, i bakterie mají svůj katabolismus a anabolismus lKatabolismus může být trojí: –Fermentace – štěpení bez potřeby kyslíku. Málo energeticky výhodný, ale nepotřebuje kyslík. Využívají ji například střevní bakterie –Aerobní respirace – z mála živin se získá hodně energie, je ale nutný kyslík. Využívají ji bakterie, které nacházíme ve vnějším prostředí, na rostlinách aj. –Anaerobní respirace – jiný akceptor elektronů než kyslík, pro člověka málo významné Množení bakterií lKaždá bakterie má svou generační dobu lZa jednu generační dobu jsou z jedné dvě, za desetinásobek je z jedné bakterie 1024 bakterií (teoreticky) a podobně lIdeální množení by existovalo pouze kdybychom neustále přidávali živiny a popř. kyslík a odebírali odpadní produkty lPozor, nepleťme si generační dobu (za jak dlouho se bakterie rozdělí na dvě) a kultivační dobu (za jak dlouho vidíme výsledek na kultivační půdě) V jedné z našich laboratoří Obrázek22 Foto: archiv MÚ Životní podmínky bakterií lPro život bakterií jsou nutné určité podmínky lTyto podmínky musíme splnit také v případě, že chceme bakterie uměle pěstovat (třeba proto, abychom je přitom mohli určovat) lNestačí takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit lNa druhou stranu, pokud s bakteriemi bojujeme (při desinfekci, sterilizaci), nestačí obvykle potlačit jejich množení, ale musíme je úplně zahubit. Životní podmínky – pokračování lPodmínky musí být splněny, co se týče teploty, pH, koncentrace solí a mnoha dalších věcí lNepůsobí přitom jednotlivě, kombinují se Osa působícího faktoru Takto působí na bakterie např. různé pH (za předpokladu, že se nemění ostatní podmínky) Vztahy mikroba a hostitele lZ hlediska klinické mikrobiologie je významný vztah mikroorganismus – makroorganismus (což může být člověk, ale také zvíře či rostlina) lMůže jít o symbiózu, neutrální vztah či antibiózu lČasto se používají i termíny z potravních řetězců (komenzalismus, saprofytismus, parazitismus). Virulentní mikroby jsou zpravidla – ale ne vždy – parazitické lNe vždycky se dají mikroby jednoduše „zaškatulkovat“. Často záleží na okolnostech, jestli bude mikrob „zlý“ nebo „hodný“ 28 proteus1 Plazivá bakterie Proteus se podílí na likvidaci nestrávených bílkovinných zbytků potravy. Je to typický saprofyt. http://faculty.smu.edu/ayati/proteus/proteus1.gif Interakce mikrob – makroorganismus: mikroby napadající člověka lMikroorganismy, které napadají člověka, jsou vybaveny různými faktory virulence – jsou to faktory, které zajišťují schopnost mikroba proniknout do organismu. Nejčastěji to bývají různé enzymy, toxiny, bakteriální pouzdro aj. lMakroorganismus se mikrobům brání řadou různých způsobů. Jde vždy o to, zda se více prosadí faktor virulence mikroba, nebo mechanismus obranyschopnosti makroorganismu Patogenita mikroorganismů lExistují mikroby nepatogenní – neschopné vyvolat nemoc. Většinou jsou to ty, které vůbec nejsou schopny do organismu proniknout. lExistují mikroby podmíněně patogenní, které vyvolávají nemoci jen za určitých podmínek. Často jsou to prospěšné bakterie, které jsou většinou „hodné“ a jen výjimečně začnou „zlobit“, když se třeba dostanou kam nemají, nebo když zmutují lExistují i mikroby obligátně patogenní, které vyvolávají nemoc vždy, když se dostanou do těla v dostatečném počtu a vhodným způsobem Patogenita a virulence lVirulence –okamžitá vlastnost konkrétního kmene mikroba (kmen = populace z jedné buňky) –Kmeny tedy mohou být –avirulentní – tedy v daném okamžiku úplně neškodné, neschopné napadat makroorganismus –méně či více virulentní – tedy disponující různou mírou schopnosti napadnout makroorganismus. lPatogenita –vlastnost určitého mikrobiálního druhu –Nepatogenní: nejsou schopny vyvolat u daného živočišného druhu nemoc. –Potenciální (oportunní) patogeni: vyvolávají chorobu jen někdy –Obligátní (primární) patogeni vyvolávají nemoc "vždy" Příklad působení patogenního mikroba Necrotizing fasciitis Mikroflóra jako ekosystém lKdysi lidé mysleli, že všechny škůdce úrody jednoduše zahubí například DDT. Ukázalo se ale, že takový brutální zásah často nadělá víc škody než užitku, zvlášť když se použije nevhodným způsobem lPodobně složitý ekosystém je i třeba střevní mikroflóra. I proto dnes na střevní infekce většinou nedoporučujeme antibiotika, protože systém „rozhodí“ často ještě víc. Na čem záleží, jak těžký průběh bude mít infekční nemoc? lFaktory na straně mikroba: vybavenost faktory virulence (může být dána třeba i tím, že mikrob sám je napaden bakteriálním virem – bakteriofágem) lFaktory na straně makroorganismu: stav imunity, stav anatomických bariér, hormonální rovnováha, případné základní onemocnění a spousta dalších věcí lForma vzájemného setkání mikroba a makroorganismu Normální mikroflóra a její význam lNa různých místech lidského těla je přítomna tzv. normální (běžná) flóra či mikroflóra. lJe tvořena komenzálními či saprofytickými mikroby, které jsou hostiteli více či méně prospěšné: –kolonizací příslušné sliznice brání tomu, aby byla osídlena patogeny –podílejí se na stavu mikroprostředí, např. pH –ve střevě likvidují nestravitelné zbytky –mohou mít i další pozitivní efekty pro hostitele (např. tvorba vitamínů střevními bakteriemi) Kde mikroflóra je a kde není lMikroflóra není ve tkáních, v parenchymu orgánů, v krvi, v mozku ani mozkomíšním moku. Zde je každý nalezený mikrob velmi pravděpodobně patogenem lMikroflóra není ani v některých dutých orgánech, např. v jícnu, v plicích, v močovém měchýři (kromě starých osob) či v děloze lMikroflóra je zejména v dutině ústní a hltanu, v tlustém (a zčásti i tenkém) střevě, v.pochvě a v menším množství také na kůži Mikroflóra v průběhu života člověka lPlod nemá žádnou běžnou flóru, po narození zvolna začíná osidlování lBěhem prvních měsíců a let života se běžná mikroflóra vyvíjí (zejména střevní v souvislosti se změnami potravy) lU žen se mění vaginální mikroflóra v důsledku hormonů při menarche, dále při začátku pohlavního života a pak v menopause lU starších osob dochází k dalším změnám (např. se často ustanoví „běžná flóra“ v močovém měchýři, dříve sterilním) Mikroflóra jako ekosystém lKdysi lidé mysleli, že všechny škůdce úrody jednoduše zahubí například DDT. Ukázalo se ale, že takový brutální zásah často nadělá víc škody než užitku, zvlášť když se použije nevhodným způsobem lPodobně složitý ekosystém je i třeba střevní mikroflóra. I proto dnes na střevní infekce většinou nedoporučujeme antibiotika, protože systém „rozhodí“ často ještě víc. Přehled běžné mikroflóry Kůže, nos, boltec, zevní zvukovod, kožní adnexa Stafylokoky (i zlaté), korynebakteria, kvasinky Hltan a ústní dutina Ústní streptokoky a neisserie Hemofily, malá množství pneumokoků, meningokoků, anaeroby, nepat. treponem. Tlusté (i tenké) střevo Anaeroby, enterobakterie, enterokoky, Entamoeba coli Vagina Laktobacily, malá množství nejrůznějších mikrobů Přechody (rty apod.) Směs zástupců obou míst Normální osídlení dýchacích cest lNosní dutina nemá specifickou flóru, přechází tam však mikroflóra z kůže (přední část) a hltanu (zadní část) lV hltanu (stejně jako v ústní dutině) nacházíme ústní streptokoky, neisserie, nevirulentní kmeny hemofilů aj. Mnohé další tam jsou, ale většinou je nevykultivujeme lPlíce a dolní dýchací cesty jsou normálně bez většího množství mikrobů lNa ostatních místech (hrtan) jsou různé přechody (hrtan – jako v hltanu, ale méně) Normální osídlení trávicích cest lRty znamenají přechod kožní a ústní flóry lV ústní dutině (stejně jako v hltanu) nacházíme ústní streptokoky, neisserie, nevirulentní kmeny hemofilů aj. Mnohé další tam jsou, ale většinou je nevykultivujeme lJícen a žaludek jsou za normálních okolností bez většího množství mikrobů lV tenkém a zejména tlustém střevě nacházíme zpravidla asi 1 kg anaerobů, dále enterobakterie, enterokoky, kvasinky, někdy i nepatogenní améby lŘiť je opět místem přechodu střeva a kůže Normální situace v ústní dutině lÚstní dutina je i za normální situace velice složitý ekosystém, složený z různých druhů bakterií, usazených materiálů, lidských buněk a dalších složek lBakterie se v dutině ústní přitom nevyskytují v.nějakém chaosu, ale v komplikovaném, strukturovaném útvaru, zvaném biofilm. V daném případě jde o vícedruhový strukturovaný biofilm, ve kterém např. anaeroby jsou přítomny ve větší hloubce než aerobní bakterie Močové cesty zdravého člověka lLedviny – normálně bez mikrobů lPánvičky ledvinné – normálně bez mikrobů lMočovody (uretery) – normálně bez mikrobů lMočový měchýř mladých a středně starých osob – normálně bez mikrobů lMočový měchýř seniorů – i za normálních okolností může být osídlen mikroflórou, která nečiní problémy a stává se „běžnou flórou“ lMočová trubice – normálně bez mikrobů, část přilehlá k ústí však může být osídlena zvenčí Normální stav pohlavních orgánů lZa normálních poměrů nejsou mikroby –U ženy v děloze, vejcovodech, vaječnících –U muže v prostatě, chámovodech, varlatech lSpecifickou normální flóru má vagina (laktobacily, příměs různých aerobních i anaerobních mikrobů) lVulva tvoří přechod vaginální a kožní flóry lU muže je specifický předkožkový vak, vedle kožní flóry jsou tu i např. nepatogenní mykobakteria apod. Normální osídlení kůže lPřestože kůže je pro mikroby nejdostupnější, je její osídlení mnohem chudší než v.případě např. úst, pochvy či tlustého střeva lMikrob, který chce žít na kůži, musí snášet vyschnutí a vysoké koncentrace solí lNa kůži se tedy normálně vyskytují –koaguláza negativní druhy stafylokoků –zlatý stafylokok – malé množství je normální –korynebakteria a příbuzné G+ tyčinky –malá množství kvasinek Péče o střevní mikroflóru lV rekonvalescenci průjmů, ale i např. po celkové antimikrobiální terapii (kde mohlo dojít k vybití části mikroflóry) je vhodné snažit se o obnovu normálního stavu lPoužívají se jogurty (nesladké, netučné), kyselé zelí, různé preparáty (Hylac) –Některé obsahují substráty pro „dobré“ bakterie, to jsou prebiotika. –Některé obsahují přímo ty dobré bakterie, to jsou probiotika –Některé obsahují oboje, to jsou symbiotika Péče o vaginální mikroflóru lTaké vaginální ekosystém může být narušen antimikrobiální léčbou či nějakým onemocněním lTaké zde doporučují „lidové receptury“ např. aplikaci jogurtu do pochvy lJinak lze doporučit prebiotické či probiotické vaginální čípky lDůležitá je také výživa a úprava hormonálních hladin (antikoncepce) Diagnostika mikrobů Cíle mikrobiologické diagnostiky lOdhalení původce nemoci (patogena) lNěkdy: zjištění citlivosti patogena na antimikrobiální látky (hlavně u bakterií a kvasinek, nedělá se u parazitů a vláknitých hub, u virů je to ve fázi výzkumu) lNěkdy také: určení faktorů virulence Co je to vzorek lVzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře: lkusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) lstěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média. lPři diagnostice někdy pracujeme s celým vzorkem. Jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů. Co je to kmen lKmen je čistá kultura („výpěstek“) jednoho druhu mikroba lKmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. lKochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie. Přehled metod lMetody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt –Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem –Identifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu lMetody nepřímé: Hledáme protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu Přehled metod přímého průkazu Metoda Průkaz ve vzorku Identifikace Mikroskopie ano ano Kultivace ano ano Biochemická identifikace ne ano Průkaz antigenu ano ano Pokus na zvířeti ano v praxi ne Molekulární metody ano v praxi ne* *netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů 1. Mikroskopie Co vidíme v mikroskopu lV případě mikroskopování kmene vidíme jeden typ mikrobiálních buněk lV případě mikroskopování vzorku můžeme vidět –mikroby – nemusí tam být žádné, a může tam být i klidně deset druhů –buňky makroorganismu – nejčastěji epitelie a leukocyty, někdy erytrocyty –jiné struktury, např. fibrinová vlákna, buněčnou drť (detritus) a podobně Typy mikroskopie lElektronová mikroskopie – u virů; spíše výzkum než při běžném průkazu virů lOptická mikroskopie –Nativní preparát – na velké a/nebo pohyblivé mikroby –Nativní preparát v zástinu (hlavně spirochety) –Fixované a barvené preparáty, například: lBarvení dle Grama – nejdůležitější bakteriologické lBarvení dle Ziehl-Neelsena – např. u bacilů TBC lBarvení dle Giemsy – na některé prvoky Gramovo barvení – princip 1 lGrampozitivní bakterie mají ve své stěně tlustší vrstvu peptidoglykanu mureinu. –Díky tomu se na ně pevněji váže krystalová nebo genciánová violeť… –…a po upevnění této vazby Lugolovým roztokem… –…se neodbarví ani alkoholem. lGramnegativní bakterie se naopak odbarví alkoholem a dobarví se pak na červeno safraninem. Gramovo barvení – princip 2 Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní Krystal. violeť Obarví se fialově Obarví se fialově Lugolův roztok Vazba se upevní Upevní se méně Alkohol Neodbarví se Odbarví se Safranin Zůstanou fialové Obarví se červeně Gramem se nebarvící bakterie se neobarví v prvním kroku kvůli absenci buněčné stěny (Mycoplasma) nebo proto, že jejich stěna je vysoce hydrofobní (Mycobacterium). Spirochety by se barvily gramnegativně, ale jsou velmi tenké, takže i je lze také vlastně považovat za „Gramem se nebarvící“ a Gram se v jejich diagnostice nepoužívá. Dift1 P1010003 Mikroskopie vzorku Mikroskopie kmene Foto: archiv MÚ 2. Kultivace Kultivace (pěstování) bakterií (případně také kvasinek) lBakterie často pěstujeme na umělých půdách lBakterie na půdu naočkujeme a poté půdu umístíme do termostatu, většinou nastaveného na 37 °C (pro bakterie významné pro člověka je to většinou optimální teplota – což má logiku) lZa 24 (někdy až 48) hodin půdu vytáhneme a pozorujeme, jak nám bakterie vyrostly lVláknité houby se pěstují mnohem déle lViry a paraziti se většinou vůbec nepěstují Kultivace bakterií – podmínky lBakteriím musíme připravit přijatelné vnější podmínky – teplotu, vlhkost apod. lNěkteré jsou dány nastavením termostatu, jiné složením kultivační půdy lPoužíváme různá kultivační média, sloužící k.určitým účelům lAerobní a fakultativně anaerobní bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry lStriktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku. Kapnofilní zase zvýšený podíl CO2. lPřipravené kultivační půdy se uchovávají v chladničce P1010008 Foto: archiv MÚ Smysl kultivace bakterií lProč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? –Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) –Abychom získali kmen – pouze pevné půdy –Abychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k identifikaci Pojem kolonie lKolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) lKolonie je tedy vždy tvořena jedním kmenem. lV některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) lPopis kolonií má významné místo v.diagnostice S3 Foto: archiv MÚ Kultivace v praxi lVzorek se vloží do tekuté půdy nebo nanese na pevnou půdu lU pevné půdy se ho snažíme tzv. mikrobiologickou kličkou rozředit, abychom získali jednotlivé kolonie a mohli dále pracovat s.kmeny mikrobů lTekuté půdy –jsou půdy pomnožovací –základem je zpravidla hovězí vývar a bílkovinný hydrolyzát –nejdůležitější je peptonová voda, bujón, VL-bujón, selenitový bujón (selektivně pomnožovací) Tekuté půdy P1010001 Foto: archiv MÚ Hemofil na ČA Pevné (agarové) půdy lAbychom využili všech výhod, které pevné půdy nabízejí, musíme vzorek (kultivace vzorek à kmen), ale i kmen (kultivace kmen à kmen) dobře rozočkovat. Klasickým způsobem rozočkování je tzv. křížový roztěr. •Základem je opět masopeptonový bujón, ale navíc obsahují výtažek z agarové řasy. Používala se i želatina, ale neosvědčila se tolik jako agar. Foto: www.medmicro.info Co se dá popisovat u kolonií lVelikost lBarva lTvar (okrouhlý…) lProfil (vypouklý…) lOkraje (výběžky..) lPovrch (hladký, drsný) lKonzistence (suchá…) lPrůhlednost lVůně/zápach lOkolí kolonie To vše ale pouze v případě, že se podařilo rozočkováním získat jednotlivé kolonie. Tam, kde je hustý nárůst, se tyto vlastnosti hodnotit nedají. V případě směsi vytvoří každá bakterie svoje kolonie (při dobrém rozočkování) Rozočkování 1 – očkování směsi bakterií (naznačeny tečkami), 2 – výsledek kultivace: v prvních úsecích směs, až na konci izolované kolonie Kult5 Pevné půdy Foto: archiv MÚ Existují různé typy pevných půd lDiagnostické půdy – roste "kdeco, ale různě" (krevní agar, VL krevní agar) –Chromogenní půdy – zvláštní druh diagnostických půd lSelektivní půdy – roste "jen málo co" (krevní agar s.10 % NaCl pro kultivaci stafylokoků) lSelektivně diagnostické půdy – např. Endova (rostou tam jen některé G– bakterie = selektivita + rozlišení bakterií podle štěpení laktózy = diagnosticita) lObohacené půdy – k pěstování náročných baktérií (čokoládový agar, což je zahřátý krevní agar) lSpeciální půdy – mají své zvláštní určení (MH půda pro testy citlivosti kmene k antibiotikům) Kult6 Krevní agar lNejběžnější půda v klinické mikrobiologii. Roste na ní většina bakterií. Výhodný je také tím, že různé bakterie se na něm různě chovají (rozkládají či nerozkládají krvinky) Hemolýzy Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ Příklad selektivně diagnostické půdy – Endova půda lEndova půda umí také rozlišit bakterie podle toho, jestli dovedou štěpit laktózu, nebo ne (diagnostická vlastnost). Kult9 Endova půda je selektivní jen pro některé gramnegativní tyčinky (selektivní vlastnost) Foto: archiv MÚ Půdy se používají i k testování citlivosti na antibiotika atbstau17 atbpsae21 lV tomto případě se bakterie naočkují po celé ploše a na půdu se nakladou kulaté papírky napuštěné jednotlivými antibiotiky (antibiotické disky). Antibiotika difundují agarem. Je-li kmen citlivý, vytvoří se zóna citlivosti. lNejčastěji se používá bezbarvá MH půda, na které je zároveň dobře vidět i pigmenty bakterií Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ Postup očkování výtěru z krku Očkování výtěrů 1 očkováno tamponem 2 očkováno kličkou 3 stafylokoková čára 4 disk BH (bacitracin pro hemofily) 5 disk VK (vankomycin a kolistin pro meningokoky) Na celé naočkované ploše pátráme po streptokocích (bezbarvé) a po stafylokocích (spíše bílé či zlatavé) Výtěr z krku – reálný výsledek vytkrk Foto: archiv MÚ Pěstování anaerobních bakterií Anae1 Anae3 Anaerobní bakterie nesnášejí kyslík. Musíme je tedy pěstovat ve speciální atmosféře bez kyslíku. Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ 3. Biochemická (a jiná) identifikace kmenů Biochemické identifikační metody lI mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano lBakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt. Produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor lExistuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. Jednoduchý příklad: Katalázový test lKatalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H2O2) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H2O2 à 2 H2O + O2 14 catalase medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm Jiný test Obrázek20 Foto: archiv MÚ 11 indole …a další testy 15 urease2 medic.med.uth.tmc.edu Někdy se zkoumají i vzájemné interakce dvou různých bakteriálních kmenů Obrázek18 Foto: archiv MÚ Moderní biochemické testy zahrnují i desítky reakcí lTesty se dělají v důlcích plastových mikrotitračních destiček. lPočet testů v sadách kolísá od sedmi až po více než padesát lLiší se v technických detailech. Vždy je však substrát lyofilizovaný, bakterie se nejprve rozmíchá ve fyziologickém roztoku nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) P1010002upr Foto: O. Z. Zahraniční soupravy 03 api50 05 PR020505 04 api-strip Bioch2 Foto: O. Z. http://www.oxoid.com/bluePress/uk/en/images/PR020505.jpg www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. 02 API systémy www.ucd.ie/kyr/Images/jpgs/Photo16.htm 4. Pokus na zvířeti Pokus na zvířeti lPokus na zvířeti býval důležitou součástí diagnostiky v začátcích mikrobiologie. Jsou ale výjimečné případy, kdy se uplatní i dnes. newzealand7 www.rockinjawrabbits.com/newzealand.htm 5. Průkaz nukleové kyseliny Průkaz nukleové kyseliny lmetody bez amplifikace nukleové kyseliny (klasické genové sondy) lmetody s amplifikací (namnožením) –PCR (polymerázová řetězová reakce) –LCR (ligázová řetězová reakce) lPrincipiálně se použití v mikrobiologii neliší od použití jinde (např. v genetice) lNevýhoda – někdy jsou až příliš citlivé, takže se prokáže každá molekula DNA, která mohla třeba „přilétnout odněkud zvenčí“. Citlivost se dnes ale dá omezit. Praktické poznámky lVzorky, které budou zkoumány metodou PCR, se odebírají poněkud jinak, než vzorky ke kultivaci. Mikrob nemusí nutně přežít, zato je důležité –aby DNA nebyla kontaminovaná nějakou DNA zvenčí –aby vzorek neobsahoval nějakou látku, která přivodí tzv. inhibici reakce lProto se zpravidla používá suchý tampon, nikoli tampon s transportní půdou lJe nutno pracovat sterilně, a je nutno používat netalkované rukavice (talek může inhibovat reakci) 6. Průkaz antigenu + průkaz protilátky Metody založené na interakci antigen – protilátka lO antigenech a protilátkách bude řeč příště, dohromady s obranyschopností těla proti mikrobům lProzatím budiž jen řečeno, že můžeme detekovat antigen pomocí protilátky, anebo protilátku pomocí antigenu Shrnutí: Práce laboratoře v praxi Práce laboratoře v praxi lDo laboratoře přijde vzorek lK nepřímému průkazu jsou přijímány vzorky séra (kde hledáme protilátky) lK přímému průkazu jsou přijímány vzorky z těch míst na těle, kde předpokládáme infekci: nejčastější jsou výtěry z krku a nosu, vzorky moče a stolice, ale někdy přijde i třeba kousek srdeční chlopně odebraný při operaci Proces mikrobiologického vyšetřování – na všem záleží!!! LÉKAŘ (KLINIK) LABORATOŘ Indikace vyšetření – zda, jaké Vlastní provedení odběru Transport materiálu Rozhodnutí, jak zpracovat Vlastní zpracování materiálu Zaslání výsledku Interpretace v kontextu ostat. výsledků a stavu pacienta (léčit vždy pacienta, ne nález) Děkuji za pozornost C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Ústavní společenské\Šéf\Votava0045a.jpg G – bakterie v podání as. MUDr. Petra Ondrovčíka, CSc. (1957 – 2007)