Cvičení z biochemie ÚLOHA 2 Důkaz prítomnosti solaninu v hlízách bramboru Teoretická příprava V odborné literatuře vyhledejte základní údaje o solani-nu, jeho chemickém složení,konstitučním vzorci,zařazení do sy-stému organických sloučenin a fyziologickém puso -bení . Uveďte některé látky chemicky příbuzné solaninu. Chemikálie a činidla koncentrovaná kyselina sírová, koncentrovaná kyselina octová, 1 % vodný roztok formaldehydu, 0,5 % roztok peroxidu vodíku, Pomůcky a materiál bramborové hlízy ( zelené,nezelené, s očky, bez oček a s klíčky),Petriho miska - dno, 4 krátke kapiláry nebo mi-kropipety, nerezový nůž, pinzeta, filtrační papír, podložní sklíčko, mikroskop Pracovní postup Z bramborové hlízy zelené i nezelené se slupkou nakrájejte dvakrát čtyři co nej tenší řezy a položze je do řady za sebou na dno Petriho misky nebo pro prípad,že budete reakce sledovat mikroskopicky na podložní mikroskopické sklíčko . Potom na jednotlivé řezy postupné kápněte na první řez 1 -3 kapky kone.kyseliny sírové, na druhý};kapku koncentrované kyseliny octové, na další kapku vodného roztoku formaldehydu a na poslední kapku 0,5 % vodného roztoku peroxidu vodíku. Přítomnost solaninu se projeví po chvilce vznikem trva_ lého načervenalého až třešňově červeného zbarvení. Hodnocení a závery Uveďte, kterou reakcí vzniklo jaké zbarvení a jeho intenzitu. Co je to Albertiho reakce ? Cvičení z biochemie č. 4 Úloha č. 1 Chemické reakce sacharidu II Úloha č. 1 Důkaz škrobu v rostlinném materiálu Úloha č. 2 Hydrolýza bramborového škrobu Chemikálie a činidla 1 % vodný ^6^6^':^L^^^^'^i^''^^ioy^m^\XS'% vodný roztok uhličitanu disodného, Lugolův roztok, Fehlingovo reagens I a II, vodný nebo ethanolocký roztok jodu, Schweitzerovo činidlo, koncentrovaná HC1, koncentrovaná kyselina sírová, vodný roztok fenolu, pevný floroglucin, ethanol Pomůcky, materiál a zařízení bramborová hlíza,semena hrachu, fazole, obilky pšenice, ovsa nebo ječmene, mikroskop, podložní a krycí mikroskopické sklo, stojan na zkumavky, 20 zkumavek, nedělená pipeta 5 ml, 2 kádinky 250 ml, kovový stojan, varný kruh, železná síťka s asbestovou vložkou, zápalky, plynový kahan, destilovaná voda, nůž, filtrační nálevka, plátěný hadřík, ruční odstředivka se dvěma zkumavkami, třecí miska s pistilem, porcelánová miska, kapátko, pipeta Pracovní postup Úloha č. 1 Důkaz přítomnosti škrobu v bramborové hlíze a semenech luštěnin a obilkách Bramborovou hlízu dobře operte, aby na ní nelpěly žádné stopy zeminy, potom ji oloupejte a z oloupané hlízy ukrojte několik kousků, které ve třecí misce dokonale rozetřete.Přidejte destilované vody a směs přefiltrujete přes kousek plátěného hadříku. Potřebujete oddělit drť tvořenou stěnami buněk od škrobových zra.Filtrát dejte i s trochou vody do centrifugační zkumavky, do druhé zkumavky dejte stejný objem vody. Potom odstřeďte škrobová zrna od vody, vodu slejte a usazená škrobová zrna dejte na porcelánovou misku. Kapátkem odeberte miriimáhií množství vody se škrobovými zrny a dejte je na podložní mikroskopické sklíčko na pracovním stole mikroskopu. Jiným kapátkem opatrně přikápněte alkoholického roztoku jodu nebo Lugolova roztoku. Počkejte asi 2 - 3 minuty a potom pozorujte mikroskopem při středně velkém zvětšení. Zakreslete několik škrobových zrn včetně jejich barvy. Jaký mají škrobová zrna tvar a velikost ? Obdobný experiment proveďte se semeny obilovin nebo luštěnin. Porovnejte jak velikost, tak také tvar škrobových zrn z různého materiálu. Bylo by možné této skutečnosti v praxi využít? Úloha č. 2 F Jrolýza bramborového škrobu Kysf-iou hydrolýzou působením kyseliny chlorovodíkové o pH = asi 2,0 - 2,5 se škrob postupně štěpí na dextriny ( což jsou vyšší maltosacharidy), maltosu až glukosu. Dextriny^ o různé velikosti molekul lze rozlišit pomocí barevných reakcí s jodem. Maltosu a glukosu. jejichž obsah v hydrolyzátu postupně vzrůstá, je možné dokázat na základě jejich redukčních vlastností. Pracovní postup V kádince o objemu asi 250 ml rozmíchejte asi 5 gramů škrobu s destilovanou vodu -a potom vařte na asbestové síťce tak dlouho, až se vytvoří škrobový maz. Během vaření musíte mazem míchat skleněnou tyčinkou, aby se maz neprilepil na dno a nebo nepřipálil. Po uvaření mazu odeberte do další kádinky objemu 250 ml asi 15 mľškrobového mazu, přidejte asi 25 ml vody ( destilované) a nakonec 2 ml 10 % kyseliny chlorovodíkové a směs dále zahřívejte. ^'í;< ///^C< Každých 5 minut odebírejte z kádinky vzorek 1 ml do zkumavky, přidejte asi 5 ml destilované vody a postupně tolik roztoku uhličitanu sodného, dokud se uvolňuje oxid uhličitý Potom přikápněte kapilárkou 2-3^p^y=alk£|^ického.jrp_ztokiLJ,odu aiiebo Lugolova roztoku. Pozorajte^zbärwnT^usSv^Pbkuš ukončete až se roztok hydrolyzátu přestane barvit modře. Hydrolýza je ukončena za asi 35^- 40 minut. S roztokem v poslední zkumavce po neutralizaci kyseliny chlorovodíkové proveďte důkaz glukosy např. reakcí s Fehlingovým reagens. Hned při začátku experimentu proveďte slepý srovnávací pokus tím, že do čisté zkumavky přidáte 5 ml destilované vody a tolik kapek Lugolova roztoku, kolik dáváte do zkumavek s hydrolyzátem. Experiment vyhodnoťte časově. Poznámka: Pokud do zkumavky přidáte nadměrné množství uhličitanu sodného, dojde v zásaditém prostředí k disproporcionaci jodu na jodid a jodnan, které jsou bezbarvé.Tím se však ztrácí značná část jodu pro reakci s dextriny a škála barevných změn je pak zkreslena. Pokud budete' pracovat přesně, získáte sadu zkumavek s postupně se měnící modrou barvou až do bezbarvé.Každá zkumavka. Přitoir každá zkumavka představuje časový interval 5 minut. 19 Reakce celulózy 8.4.1. REAKCE CELULÓZY SE SCHWEITZEROVÝM ČINIDLEM Schweitzerovo činidlo je jedno z mála rozpouštědel, v němž se celulóza rozpouští, aniž se chemicky mění. Pracovní postup: Do čisté zkumavky nastříhejte několik proužků čistého filtračního papíru, potom přidejte 2 ml Schweitzerova činidla a jednu až dvě minuty důkladně protřepávejte. Celulóza se začne rozpouštět. 8.4.2. VZNIK HYDROLYZÁTU CELULÓZY Pracovní postup: K roztoku celulózy ve Schweitzerově činidle z předchozí úlohy opatrně po kapkách přidávejte koncentrovanou kyselinu chlorovodíkovou. Roztok se zpočátku nemění, a!e postupně začíná zelenat vzniklým chloridem meďnatým a z roztoku se vyloučí celulóza ve formě hydrátové celulózy, což je rosolovitá hmota. 8.4.3. VZNIK AMYLOIDU REAKCÍ CELULÓZY S KYSELINOU SÍROVOU Pracovní postup: Ve třecí misce opatrně roztírejte tloučkem kousky čistého filtračního papíru s koncentrovanou kyselinou sírovou. Celulóza se rozpouští na nažloutlý roztok, který opatrně vlijte do kádinky objemu 250 ml, v níž je 200 ml destilované studené vody. Voda se zakalí vyloučeným amyloi-dem. Odeberte vzorek a přesvědčete se, zda reaguje na jódovou zkoušku. Výsledek pozorovánLza-znamenejte do pracovního protokolu. 3 8.4.4. HYDROLÝZA CELULÓZY NA GLUKÓZU Pracovní postup: Ve zkumavce rozpusťte za neustálého protřepávání několik proužků čistého filtračního papíru v koncentrované kyselině sírové a roztok opatrně vlijte do kádinky se 100 ml destilované studené vody. Vařte potom na síťce 20 minut a po 5 minutách odebírejte do zkumavek vzorky na flů-kaz glukózy Fehlingovým nebo Tollensovým činidlem. Tyto reakce probíhají pouze v neutrálním nebo alkalickém prostředí, proto vždy před přidáním Fehlingova nebo Tollensova činidla roztok zalkalizujte roztokem hydroxidu sodného. Jakmile bude, reakce na glukózu pozitivní, přestaňte zahřívat. Vysvětlete, jaká reakce proběhla a zapište její chemickou rovnici. 8.5. Důkaz laktózy v mléCT^ Pracovní postup: Do čisté kádinky crake 50 ml čerstvého syrového mléka, přidejte pár kapek kyseliny octové a zvolna protřepejte. Vysráží se ka%&m, který odfiltrujte. Filtrát zneutralizujte přidáním uhličitanu vápenatého a pH roztoku změřte univerzálním^ndikátorovým papírkem. Upravte na neutrální prostře-di. Odeberte 2 ml roztoku a proveďte zkoušku s Fefftingovým činidlem a Tollensovým činidlem. ...... T/77 ÉuJt&* U 3L0IÍA 3 Důkaz přítomnosti sacharidů v přírodních produktech ( ovoce, zelenina, kravské mléko ) Teoretická příprava Vypracujte schéma rozdělení sacharidů. Napište konštituční vzorce ( Fischerovy projekce,Tollen-sovy a Haworthovy) - Tj-......3 L- aldopentosy ( ribosa) .. - D- ,a L- deoxiribosy Napište konštituční vzorce ( Fischerovy projekce)všech - D- a L- aldohexb-s - D- a L- ketohexos U všech uveďte jejich názvy. Praktická část Chemikálie,činidla a odměrné roztoky Fehlingovo reagens I a II, 10 % vodný roztok AglíO^ , t .vodný roztok "a "moniaku o c= 0,2 mol/dm , koncentrovaná HNO^, Hesslerovo Činidlo, 30 % KC1, roztok'-". 1 -n3fto-::lu v . ethanolu, ^koncentrovaná kyselina sírová, 3- % etha-nolický roztok'thymolu, pevný NaCl, octan-anili nu, f e -nylhydrazinové Činidlo, koncentrovaný vodný ro k NaOH (min. 30 % ), 1 % vodný roztok CuSO^, ethanol, mořský písek, močovina, .r-esorcinol, Pomůcky'-, materiál a zařízení jablko, kořen mrkve, kravské mléko, pomeranč, porcelá -nová třenke s tloučkem, filtrační papír, filtrační ná -levka, filtrační kruh, stojan, nůžky, Erlenmeyerova ban-ka 150 - 2-jQ cm , třepačka, stojan na zkumavky, 12 zkumavek,kartáč na zkumavky, zápalky, plynový kahan, dělená pipeta ( 1 Pracovní postup pipeta ( 10 cm po 1 cín ), ruční odstředivka se zkumavkou. 1 Příprava ^vjdných extraktů z přírodních produktů - ovoce, zelenina. . • Z čistě opraného kořene mrkve ukrojte několik men- í; í ch řezů, dejte je do tře c-: misky, p 'idejte trochu či.clcho moř £.4: í j10 nebo křem-.- .^éno pír.-ku a :,'<•«:_ íeriál .;otře rozetřete.ľo rozetření je^ dojte do Erlereney-erovy banky a umístěte do třepačky.:>noc potom ne - ■ čnejte 10 minut třepat. Po uplynutí 1C minut extrakt přefiltrujte a u-chovejte ve zkumavce pro odebírání vzorků na jednotlivé důkazy sacharidů. Stejným způsobem si připravíte extrakt z jablka nebo pomeranče. Při práci se snažte používat co nejmenšího objemu vody,aby extrakt byl co ne jkoncentrovanějŠí . 2 Příprava syrovátky z kravského mléka pro důkazy cukrů. Do kádinky (150 - 250 cnr3) dejte kolem 100 cm3 mlé-' ka ( ne kondenzovaného nebo sušeného), přidejte několik kapek kyseliny octové a mírně zahřejte.Potom směs důkladně protřepejte,aby se vysrážel veškerý kasein . Suspensi dejte do xetriíugační zkumavky a odstřeďte na ruční ,odstředivce..Proces odstreďovaní opakujte 2x, abyste' získali větší objem syrovátky pro další použití. Kasein pro další práci nebudete potřebovat. 3 Důkaz přítomnosti sacharidů V získaných extraktech a syrovátce dokažte přítomnost ........ , * sacharidů 1 ,• - - reakcí S el ivano vo vo u reakcí Tollensovou p - reakcí Thymolovou reakcí Molischovou ŕ reakcí s močovinou -. Vždy uvedte výsledek důkazu a zdůvodněte jej. Reakce založené na redukčních r.3a]-:c ich ( redukčních vis; ncr/tech sacharidů } ľ.'.cnosacharidy , aldosy, h e i; osy a ty o ligo sacharidy, které msjí volnou alespoň jednu poloacetálovou hydroxylovou —OE skupinu''iía j í redukční účinky, proto se působením oxi -dacních činidel oxidují na s Ido nové kyseliny.Při těchto reakcích se oxiduje karbony love sldehydická skupina na karboxylovou a vzniká aldonová/ky.s,elina H - C = 0 H - C - OH CH20H ildosaft aldonová kyselina Ketosy by takto reagovat neměly,protože nemají volnou poloacetálovou hydroxyskupinu,ale v závislosti na reakčních podmínkách prav-d||ÉcWbně isoraerují na aldosy, .a proto podle reakčních podmínek reagují stejně jako aldosy: '_' CKo0H é I o ketosa CH20H : H - C - OH- C - CH. f H - C = 0 •H - C - OH ! OH K - C HO' - G O H enolizace -;H g OH epimerace aldosa JH0 OH CHo-0H K-C =0 H - C = 0 ' C =0 II-C - OH HO - C - H HO-C - H - strukturní KO-C - H epimerace' HO - C - H H-C - OH 7~ 7 H-C - OH " ^ H - C - OH 1 :. isornerace 1 • ■ ■ ■ f ■ * K-C - OK K-C - OH H - C - OH -CK^OH ----------- - CII2-0K - ----- CH20K D-fruktosa . D-glukosa D-mannosa * mědi preakce Fehlingova) bizinut-u ( reskce Nylan&erova ) železa, ( reakce Ksgendornova - Jenšenova s fenylky-" drazinem) stříbra ( reskce Tollenscva ) Obecně: za různých reakčních podmínek vznikají různé o-'xt&ačrít"vT o g ukty- líy s e Ti ry pdT?W^?^&žä~?myT^ 5 š'T " jsou ty, které se odvozují cd aldos: a) kyseliny aldonové jsou kyseliny polyhydroxynonokarfcoxy1cv b) kyseliny aldsrové jsou kyseliny polyhydroxydikarboxylové c) kyseliny uronové jsou kyseliny• aldopolyhydroxykarboxylcvé (h-c-oh) ch2oh aldosa n H-C=0 (E-C-CK)n CH,OH H-'-C=0 (H -C-OH) I OH ky s. .A LDOrJQYA n kys.UROJľOTA- KO-C=0 . • (H-C-OH) HO-C=0. kys. ALDAEOVA Reakce sacharidů s 7 e hl i ng o výr: reagens úloha 4-1 Reakce.. Fehlingova iJo 1 cm zahřátého vzorku sacharidu dáme 1 cm Fehlingova reagens ( připraví se etaícháníjš 0,5 cm^ roztoku I a 0,5 cm3ros toku II). 'i Při reakcí se vyredukuje. íervený oxid Kěďný.Cuo0, v přípa dě použitíkoncentrovaných roztoků sacharidů se na stěně sku •mavky-může '.vytvořit., červené • měděné zrcátko ( po experimentu je odstraníte konc.kyselinou dusičnou) .*- úloha 4-2 Reakce Toliensova /. y Ec 1 cm3 studeného nebe zahřátého vzorku sachs-n-i.řhi tvS-i/!*.-. stejný objem amoniakálního ..obtoku e;-: i c: u stříbrného ( To 1 ]. g rovo č inidlo). ?oôle t;/p u ''^"oľiä,; v e v;: c r ku a teploty vznikne šedý koloidní roztok střrHxra , nraženina ne bo sž stříbrné zrcátko na stene n zkunavky* . Poznámka: --ířollensovo ľinidlo nikdy nepřipravujte do zásoby, protože stáním v něm vznikají explozivní slcullniny stříbra ! ! ÚLOKA 4-3 Reakce Barfoedova Octan meďnatý se v prostředí octoví kyseliny redukuje na oxid meďnatý.Jeho přítomnost se projeví červeným zbarvením re -akční směsi. Pro zvýšení citlivosti reakce lze použít Kelsonova činidla ( je to kyselina arsenomolybděnová), jehož reakcí s oxidem měd-ným vzniká molybdenová modř. B Další■reakce sacharidů ÚLOHA 4-4 Reakce • Selivanova-WEEHUIZBNOVA -V ^ ; * So. zkumavky de-jte 1-2 cm/ 30 % HCl a potom 1 cm'' roztoku' vzorku cukru, dále jeden krystalek resorcinolu a směs důkladně promíchejte třepáním.Po promíchání dejte zkumavky, ("podle počtu vzorků ) do zahřáté vodní lázně •'.(-•'kádinka s teplou.vodou) a 10 minut zahřívejte. ,. : :' Ketosy dávají třešňové zbarvení (aIdosy ■takto nereagují, proto je tato reakce specifická pro ketosy ). Podstatou reakce je reakce 5-nydrosjrmethylfuralu ( ten se tvoří dehydratací sacharidů nspř. minerálními ]-yselinami) s re-"sorcinolem. - . Zkoušek udělejte tolik, kolik máte vzorků sacharidů. ÚLOHA 4-5 _2_ Reakce sacharidů s močovinou ■ví Deriváty iuralu vznikající dehydratací sacharidů např.mi-..nerálními kyselinami, reaguj í s močovinou za vzniku barevných".pro duktů:.: % - - ■ v: :.c.\-n : ••" i ioke:-X'sy i/i-r-v c í", c no b .•u r aldopentocy Sluté • ketohe:-:osy med r-' ( po pričiní etha nolu a nírrini za Iko lisování přechází zbarvení na červené) Podle po c tu vzorku cukrů" si připravte potřebný počet zkumavek, dc každé dejte 0,3 - 0,5g močoviny,přidejte 5-6 kapek koncentrované HC1 a maximálne 5 kspek vodného roztoku sacharidu. S^ěsi pro třepejte a dejte na dvacet minut do horké vodní lásně.Egrevné směny s e projevují za 15 - 20 minut. ÚLOHA 4-6 Reakce Molischova V J Mono-, di- a polysacharidy dávají s-kone. kysel inou sírovou a 1-naftolem intensivni fialové zbarvení, jehož vznik není dosud spolehlivě vysvětlen.Pravděpodobně vzniká di- -naítohydroxy-íenylmetha-ii, který se dále oxiduje na příslušné trifenylmetha -nové barvivo. Po zkumavek ( podle počtu vzorků) dejte 2 crrP roztoku sa -charidu, přidejte vždy po 5 kapkách roztoku 1-naftolu v ethandlu a směs dokonale protřepe j te.Potorri směs velice opatrně,sle zejména pomalu podvrstvěte konc.kysel inou sírovou.Z8 přítomnosti sacharidu u monosacharidů a disacharidů hned, u polysacharidu po něko -lika minutami objeví modro- nebo červenofialový prstenec. Reakci-dádá také' fural a jeho deriváty,to "zn. také ty sloučeniny, které /během, reakcí vzniká jí .Pro ^ô.: reakce není specifická pro sacharidy,ale nevznikne-li pří^lijjpé zabarvení, není v reakční směsi sacharid přítomen. iÍLOHA 4-7 Rea k c e t hy m o 1 o v á V některé sacharidy reagují v silně kyselen prostředí s alkoholickým roztokem thymolu za vzniku karmínového - zbarvení . So sady zku-r.avek •(• podle počtu vzorku cukrů) dejte postupne proužek 'filtračního papíru, do druhé 0,1 g škrobu, do další 1 cir? vodného roztoku glukosy, dále Lem-3 roztoku sacharosy a nakonec 1 cm roztoku maltosy.Ke-škrobu přidejte 1 cnr destilované .vody. r y0 tom cic v S c c r, zkux^vok dejte :;o 3 korkeck 3 ;'■ etkanolic-):ého rozteku thymolu, 3 c mi kone.HC1 a několik krystalků Iv?-01. Směsí několik minut p cm.-:-1 u, s* 1 e důkladně třepejte,aby ne pro -míchala.Po 3-4 minutách třepání ponořte zkumavky do horké vodní lázně a za třepání vařte minimálně 5 minut.Výsledky reakce zapište do tabulky.Jako kontrolní provedte tentýc experiment s f ruleto sou. • 3r£ců ÚLOHA'1" 4-8 Reakce sacharidů s fenylhadrazinem Positivní reakci s fenyIhydrazinem ( a jinými hydra siny) dávají aldosy i ketosy.Reakce probdí tak,, že nejprve reaguje aldosá' š^3'edlicu molekulou "féňylliýďrasxríu" zV/v¥iiiku íenylhy dra-zonu: H-C=0 (K-C-OH) i R a 1 do sa ■ ä. n + H2N--H-C6H, H-C=If-KH-C6H5' -n-1 CH20H OSASOK 4- C^H-KKh, 4- iSo Reakce nitrochromová J.lezi skupinové reglcce sacharidů patří i t. zv.nitrochromová reakce.Je založena na oxidaci sacharidů v kyselém prostředí chrč many.Reakci, nedávají nehydrolyzující sacharidy-.Produkty jreekce jsou modře zbarveny. . Do dvou :: k r.-"-- •"' jí-' - ::' ; 3 vr.í 2 e:r.-' v /:"u;:oí;/ a co druhé -tejn;' orejv. rcntoku ;-s •:■):* 2 ■>.. oy , p ř id t ■■ ■ 7:: 3 r;r/ koncentrované HnO^ ( ne r .i]; e t u j te,als odměřte cdmérr.ou zkumavkou nebo odmorným válečkem ) a 5 kapek 10 v-; roztoku chromenu draselného.Směsi dobre promíchejte a pozorujte průběh reakcí . ÚLOHA 4-10 Rozlišení pentos a hexos Ve zkumavce zahřívejte 1-2 cm^ roztoku pentosy se stejným objemem kone.HC1.Jakmile začne roztok vřít,přiložte k ústí zkumavky ' proužek"íirtráchího papíru smočeného roztokem octanu anilinu. Vznikne červené zbarvení, typické pro .pentosy<, Provedte tutéž skeušku s glukosou. Jaký je vý slede}-: reakce ? 0r 0 9 8.5. Důkaz laktózy v mléce Pracovní postup: Do čisté kádinky dejte 50 mi čerstvého syrového miéka, přidejte pár kapek kyseliny octové a zvolna protřepejte. Vysrážíse kasein, který odfiltrujte. Filtrát zneutralizujte přidáním uhličitanu vápenatěliu a pH roztoku změřte univerzálním indikátorovým papírkem. Upravte na neutrální prostředí. Odeberte 2 ml roztoku a proveďte zkoušku s Fehlingovým činidlem a Tollensovým činidlem. Důkaz přííomnosíi sacharidu ve vzorcích ovocných šťáv Chemikálie a činidla Pro důkazy sacharidu použijeme stejné Chemikálie a činidla jako ve cvičení č. 3 Pomůcky, materiál a zařízení V práci použijeme stejné pomůcky a zařízení jako ye cvičení č. 3 Pracovní postup Důkaz sacharidů ve vzorcích ovocných šťáv provedeme minimálně dvěma způsoby výsledky zaznamenáme do pracovního protokolu. OK CVIČENÍ Z BIOCHEMIE Úloha 3 / Chemické reakce sacharidů I Chemikálie a činidla: 3 % vodné roztoky dostupných monosacha- ridů a disacharidů, škrob,celulosa, zásobní roztok Fehlingova reagens (la II), 10 % vodný roztok AgN07, vodný roz- 3 tok amoniaku o c= 2 mol/dm , vodný roztok 3 NaOH ( c = 2 mol/dm , kyselina dusičná , Nelsonovo činidlo, 30 % kyselina chlorovodíková, roztok 1-naftolu v ethanolu,kyselina sírová koncentrovaná,3 % ethano -lický roztok thymolu, pevný NaCl, ootan anilinu, fenylhadrazinové Činidlo, kon -centrovaný vodný roztok NaOH (min. 30 %), 1 % vodný roztok CuSO,, suspense Ca(0H)o ve vodě, ethanolj tr^a/f^Utíťu^c^^ e**<'«fO ve vode, ethanolj t^^ra^^. í Pomůcky a materiál:stojan na zkumavky, minimálne 20 ks zkuma - vek, kádinky objemu min. 250 cm ,kovová t roj nožka nebo kovový stojan s varným kru-s hem, železná sitka s asbestovou vložkou , lžíce na chemikálie, filtrační papír, nůž- 3 ky,. plynový kahan, zápalky, pipeta 10 cm delená, podložní mikroskopické sklíčko a mikroskop, kartáč na čištění zkumavek,mi-kropipety zhotovené z tenkostenné sklenené trubice na dávkování vzorků sacharidů, nůž na sklo ; Poznámky: při práci pracujte mimořádně pečlivě, aby nedošlo ke znečišťování roztoků jednotlivých sacharidů jinými , protože by to rušilo správný průběh reakcí. Po ukončení práce veškeré sklo důkladně vymyjte a zkumavky dejte sušit do stojanu dnem vzhůru. oha 3.1 PEHLIKGOVA REAKCE Mono sacharidy ,aldosy a ketosy ( ale také ty oligosacha-ridy,které mají volnou alespoň jednu poloacetálovou -OH skupinu), mají redukční účinky,proto se účinkem oxidačních činidel oxidují na aldonové kyseliny.Při reakci se oxiduje aldehydická skupina na skupinu karboxylovou,kov, který je součástí oxidačního činidla se redukuje, někdy až na elementární formu.Redukované kovy se snadno poznávají, což je základem mnohých reakcí cukrů.Ketosy by se oxidovat neměly, ale protože pravděpodobně izomerují na příslu-šné aldosy, tyto reakce rovněž poskytují. H-C-OH H-C-0H H-C-OH H-C-OH CH20H aldosa H-C-OH H-C-OH CH2OH aldosa CH2OH kyselina glukonová CHo0H C=0 H-C-OH CH20H ketosa Pracovní postup: Do sady zkumavek dejte postupně po 1 cm^ vodného roztoku glukosy,fruktosy,sacharosy,maltosy,galaktosy a laktosy a všechny zkumavky dejte zahřát do kádinky s vroucí vodou.Po dvou až třech minutách přidejte do každé zkumavky po 1 cm^ Fehlingova činidla ( 0,5 cm^ roz toku I a 0,5 cm roztoku II).Pozorujte změny ve zkumavkách a zaznamenejte je do pracovních protokolů.Doložte je chemickými rovnicemi. ;' Při reakcích se vy redukuj e červený Cu20,v případě použití koncentrovaných roztoků dokonce elementární Cu. J n.*A* >v eix Úloha 3.2 TOLLENSDVA REAKCE! Tato reakce je rovněž založena na redukčních vlastnostech sacharidu.V tomto případě se však ( na rozdíl od úlohy 3.1) vyredukovává kovové stříbro,někdy ve formě stříbrného zrcátka. Pracovní postup: Do sady zkumavek dejte vzorky vodních roztoků sacharidů jako v úloze 3.1 a zkumavky postavte do stojanu.V samostatné zkumavce si připravte z příslušných roz- 3 toků maximálně 5 cm Tollensova činidla.Potom do každé 3 zkumavky dejte asi 0,5 cm tohoto činidla a pozorujte , zda dochází ve zkumavkách k barevným změnám.Tu zkumavku, ........^^e,^aQ,-MsMé,.,mP^-.J^^Jj^^^ dejte do kádinky s horkou vodou a sledujte,za jakou dobu se barevná změna projeví. Pokud po 5 minutách zahřívaná směs nereaguje,pokus ukončete.Pří slušný sacharid je neredukující. Po ukončení pokusu ty zkumavky,kde se vyredukovalo kovové stříbro vymyjte několika kapkami koncentrované kyseliny dusičné, potom vodou. Úloha 3.3 BARFO EDOVA REAKCE V prostředí koyseliny octové se redukuje octan meďnatý na oxid měďný ( ten je Červený).Tuto reakci dávají před-nostně mono sacharidy, redukující disacharidy až po delším ^zahřívání.Citlivost reakce lze zvýšit přidáním několika kapek Nelsonova činidla. Pracovní postup: Podle postupu v předchozích úlohách si připravte sa-du zkumavek se vzorky sacharidů,přidejte po 1 cm Barfoe-dova činidla a zkumavky postavte do kádinky s vroucí vo -dou.Zahřívejte 30 minut.Potom zkumavky ochlaďte vnějším chlazením studenou vodou buď pod tekoucí vodou a nebo ponořením do kádinky se studenou vodou. Zapište si výsledky pozorování a potom do každé zku- 3 *. mavky přidejte 0,5-1 cm Nelsonova činidla.Pozorujte zmeny a zapište si je do protokolu. Monosacharidy dávají modré zbarvení,disacharidy žlutozelené. T Úloha 3.4 SELIVANOVA A WEEHUI2EN0VA REAKCE : Reakce je založena na vzniku červeného zbarvení, které dává 5-hydroxymethylfural s resorcinolem a kyselinou HC1. Deriváty furalu vznikají dehydratací sacharidů např.působením minerálních kyselin. Pracovní postup: Připravte si vodní lázeň se zahřátou vodou pro ohřev sady zkumavek.Do sady zkumavek ( podle počtu vzorků sacharidů) si dejte 1-2 cm 30 % HC1,potom přidejte vždy 1 cm vzorku vodného roztoku sacharidu a zkumavky dejte ohřívat do vodní lázně .Zahřívejte 10 minut.Potom přidejte do každé zkumavky několik krystalků resorcinolu ( lépe je přidat resorcinol před začátkem zahřívání).Ketonické sacharidy dávají třešňově červené zbarvení.Proto je tato reakce specifická pro ketosy. Úloha 3.5 REAKCE S MOČOVINOU Působením minerálních kyselin na sacharidy vznikají deriváty furalu, které reagují s močovinou za vzniku barevných produktů; fruktosa dává zelenomodré zbarvení Připravte si podobně jako v předchozích úlohách vodní lázeň a zahřejte ji do varu.Do zkumavek (počet závisí na poctu vzorků sacharidů) dejte vždy 0,3 - 0,5 g močo -viny, přidejte 5-6 kapek koncentrované kyseliny chloro -vodíkové a 2 - 3 kapky vodného roztoku vzorku sacharidu. Směsí ve zkumavkách vždy důkladně,ale opatrně třepejte a potom vložte do horké vodní lázně.Reakce ty se měly projevit po 15 - 20 minutách. Úloha 3.6 MOLISCHOVA REAKCE Sacharidy ( mono-,di- a polysacharidy) dávají s koncentrovanou kyselinou sírovou a 1-naftolem intenzivní fialové zbarvení .Jeho ;vznik není ještě přesně vy světlen, ale aldohexosy červené nebo purpurové aldopentosy žluté ketohexosy modré; po přidání ethanolu a mírném zalkalizování přechází na červené. Pracovní T "7 •J zdá se, že při reakci vznikají pravděpodobně di-1-nafto-hydroxyfurylmethany, které se zřejmě oxidují na příslušné trifenylmethanové barvivo. Pracovní postup: Do sady zkumavek ( podle předchozích úloh) dejte po 2 cm"^ vodných roztoků sacharidů, zkumavky postavte do stojanu a přidejte do nich po 5 kapkách roztoku 1-naftolu v ethanolu a směsí vždy dobře promíchejte.Potom obsah každé 3 zkumavky opatrně podvrstvěte 1 cm koncentrované kyseliny sírové ( pracujte velice opatrně a pomalu).Za přítomnosti sacharidu se na rozhraní kapalin objeví modrofialový nebo červenofialový prstenec.( U monosacharidů a disacharidů ihned, u polysacharidu po chvíli). Poznámka: Tuto reakci dává fural a jeho deriváty a tedy i ty látky, z nichž za podmínek reakce fural vzniká.Proto re -akce není specifická pro sacharidy.Negativní výsledek ale svědčí o nepřítomnosti sacharidu. Úloha 3.7 THYMOLOVÁ REAKCE Některé sacharidy reagují v silně kyselém prostředí s alkoholickým roztokem thymolu za vzniku karmínového zbarveni. Do sady zkumavek dejte postupně:proužek filtračního ^3 3 papíru, 0,1g škrobu a 1 cm destilované vody, 1 cm vod- 3 ného roztoku glukosy, 1 cm vodného roztoku sacharosy a 3 1 cm vodného roztoku vzorku maltosy.Potom do všech zkumavek dejte po 3 kapkách 3 % ethanolického roztoku thy -molu,3 cm koncentrované HCI a několik krystalků chloridu sodného.Směsí vždy velmi opatrně ale důkladně protře-pejte a potom za třepání 2-5 minut vařte.Po ukončení experimentu proveďte tuto reakci s fruktosou. Pracovní postup: 3 Ve zkumavce zahřívejte 1-2 cm roztoku pentosy se stejným objemem koncentrované HCI.Jakmile začne roztok vřít, přiložte k ústí zkumavky proužek filtračního papíru smočeného v roztoku octanu anilinu. PracovnjĹ postup: X Úloha 3.8 ROZLIŠENÍ PENTOS A HEXOS Pentosy dávají touto reakcí červené zbarvení.Proveďte tutéž reakci s glukosou.Dávají hexosy stejné zbarvení? Úloha 3.9 NITROCHROMOVÁ REAKCE ( Je to skupinová reakce mono- a o ligo sacharidů) Roztok chromanu v kyselém prostředí oxiduje všechny sacharidy ( s výjimkou nehy dře? lyžujících polysacharidu) . Redukční produkty chromanu jsou zbarveny modře. Pracovní postup: 3 Do zkumavky dejte asi 2 cm vzorku roztoku sacha - 3 ridu, přidejte asi 3 cm koncentrované kyseliny dusičné (tu nepipetujte, ale odměřujte odměrným válečkem) a 5 kapek roztoku chromanu didraselného.Směs dohře, ale velice opatrně protřepejte a pozorujte průběh reakce.Po -dobné úlohy proveďte s různými sacharidy; zvolte ty,které máte k disposici. Úloha 3.10 TVORBA OSAZONU Mono-případně disacharidy lze charakterizovat na základě jejich kondenzačních reakci s fenylhydrazinem případně 2,4-dinitrofenylhydrazinem.Produkty^ těchto reakcí se málo rozpouštějí ve vodě ale dobře krystalizují a tvoří krystaly s typickým tvarem a ostrou teplotou tání.Nutno je pozorovat mikroskopicky. ^ :. Pracovní postup: 3 Roztok cukru o objemu 1 cm zahřívejte ve zkumavce se 3 cm fenylhydrazinového činidla na vodní lázni asi 20 minut. Po této době začne vzorek se sacharidem pomalu žloutnout a po jeho ochlazení pod tekoucí vodou se vyloučí žluté krystalky osazonu.V případe pomalého chlad -nutí při teplotě místnosti se vytvoří dobře vyvinuté a dobře pozorovatelné krystalky .Pozorujte při mírnén zaclonění rožného pole. Reakci proveďte se všemi sacharidy, které máte k disposici. Úloha 3.11 REAKCE GLUKOSY a) Reakce Mooreova 3 Ve zkumavce zahřívejte 1 cm roztoku glukosy se 3-4 kapkami koncentrovaného roztoku hydroxidu sodného . f .f Glukosa se začne rozkládat na aceton, kyselinu mravenčí a mléčnou a roztok začne žloutnout až hbědnout a voní karamelem. Tuto reakci nedává sacharosa - dokážte to príslušným experimentem. b) Reakce Trommerova 3 Do čisté zkumavky dejte 1 cm vodného roztoku glukosy , 3 přidejte 0,25 cm roztoku HaOH a velice pomalu po stěně zkumavky přidejte 1 kapku ředěného vodného roztoku síranu meďnatého.Vznikne temně modře zbarvený roztok ( někdy až modrofialový), který se při dalším přidávání roztoku síranu začne kalit.Přestaňte přidávat další síran a obsah zkumavky zahřejte do varu.Sloučenina měďnatá se zredukuje na měďnou.Podle koncentrace použitých roztoků se reakční směs zbarví zelenavě,žlutavě až červeně. c) Reakce Tollensova v Tuto reakci glukosy provedte podle jiz drive uvedeného návodu. Úloha 3*12 VZNIK SACHARITU VÁPENATÉHO Pracovní postup: 3 Do větší zkumavky dejte 1,5-2 cm vodného roztoku sa-charosy a po malých dávkách přidávejte suspenzi hydroxidu vápenatého ( vápenné mléko).Po každé dávoe vápenného mléka směsí důkladně pro třepejte, nechejte chvíli ustát. Přidávejte vápenné mléko tak dlouho,dokud se roztok nezakalí.Potom čirý roztok přelejte do druhé zkumavky a rozdělte jej na tři části a proveďte s nimi následující reakce: a) Obsah první zkumavky zvolna zahřívejte a pozorujte změny, které při zahřívání probíhají; 3 b) Do druhé zkumavky dejte k roztoku asi 0,5 cm ethanolu a pozorujte změny; c) Do třetí zkumavky foukejte pipetou vzduch z plic 2-3 minuty a rovněž pozorujte změny. Ve všech zkumavkách byl roztok sacharátu vápenatého , který je za studena dobře rozpustný ve vodě,ale nerozpustný za tepla,proto se obsah první zkumavky při zahřívání zakalí vyloučeným Ca(OíOg;sacharát vápenatý je rovněž nerozpustný v ethanolu a rovněž se vysráží;ve třetím případě oxid uhličitý vytěsní Ca ze sacharátu a vzniklý CaCO^ se rovněž vysráží. í Úkol 1 Vypracujte podrobné schéma rozdělení sacharidu. 2 Ne příkladu liboIné aldohexosy a ketohexosy uveďte všechny užívané vzorce sacharidu( vzorce molekulové soúhrnné,Fischerovy,Tollensovy s poloaceťálovou vazbou, vzorce Haworthovy,vzorce konformační) a potom u-dejte příklady D- a L-konfigurací,epimerii, anomerii, furanosu,pyranosu, židličkové uspořádání ^"Cj (dříve C1) a 1C4 '{ dříve 1C). 3 Na příkladu glukosy nebo jiné hexosy vysvětlete oxidaci sacharidů na kyselinu glukuronovou, glukonovou a cukrovou a vznik glukuronidů. I 4 1 CVIČEK .T V, BIOCHEMIE Olo ho 9 Chcení c.'-: ž vlastnosti a reakce bílkovin Chemikálie z činidla: sír&n amonný - pevný,destilovaná voda, ředěný roztok CuSO^ (0,5%), ředěný roztok BaCl0 ( C, 5%),ředěný roztok Fb(NO^)2 (0,::/,-), vodný roztok formaldehydu,octová kyselina, 10^ vodný roztok hydroxidu sodného, chlornan alka lichého kov; Pijaku L 9 1 -na ftol, kyselina dusičná kone., sul fsnilová ky fVWft selina, dusitan^ôdný, Na2C0^,glyoxalová kysel i: kyselina sírová kone.,ninhydrin,octan olovnatý, Pomůcky a materiál: plynový kahan, zápalky, syrové vejce, sto jar. na zkumavky, 15 zkumavek, kádinka 250 cm ,tycink na míchání,stojan,filtrační nálevka, vata,kádink 3 100 cm , filtrační kruh, špachtilčka a nebo malé lžíce na chemikálie, ^rfo'L z^hĹa-m *<-> lĹj Poznámky: všechny úkoly v tomto laboratorním cvičení patří mezi srážecí nebo barevné reakce bílkovin.Jsou t to reakce citlivé,proto je třeba používat čistéh skla,čerstvých roztoků činidel a používat také ř-d ěných roztoků činidel,protože při použití konc trovaných roztoků jsou zbarvení produktů špatně í. nebo vůbec nepozorovatelná. Po každé reakci nutno zkumavky vymýt za použití kartáče na zkumavky a ne pouze vypláchnout. Během všech experimentů používejte destilované vo 1. Příprava roztoku bílkoviny vaječného .bílku Nad kádinkou objemu 250 cm3 se" 150 cm3 destilované vody opatrně rozbijeme syrové vejce tak/abychom oddělili bílek od žloutku. Žloutek přeneseme do čisté kádinky, stačí objem 150 cm a použijeme jej k dalším zkouškám.''Bílek rozpustíme v kádince za míchání tyčinkou. Po dokonalém'rozpuštění bílku roztok přefiltrujeme přes chomáček čisté vaty nebo čistý plátěný hadřík do čisté Erlenmeyerovy baňky objemu kolem 250 cm3. Filtrát budeme používat ke zkouškám a dalším experimentům. 2. Nevratné srážení bílkoviny teplem Do zkumavky dáme 1-2 cm roztoku bílku a za protřepávéní zahříváme- nad plynovým kahanem. Bílkovina se vysráží. Pozorujte,zds zůstane sraženina zachována i po ochlazení roztoku. Zůstanerli zachována vysvětlete o jaký typ srážení jde. 3. Působení neutrálních solí na roztoky bílkovin Do, zkumavky s 1,5 cm3 roztoku vaječného bílku přidejte špachtličkou po malých dávkách asi 0,5 g pevného síranu amonného. Po každé dávce síranu obsahem zkumavky zvolna, ale důkladně protřepejte^Súl přidávejte tak dlouho, dokud se ne-začne bílkovina srážet. Pďtom přidejte ještě jednu dávku soli, protřepejte, nechteřchvíli ustát, pozorujte a výsledek pozorování zapište do protokolu. Po zápisu výsledku pozorování přidejte do zkumavky asi 3 ' 1 cm destilované vody,obsahem opět protřepejte a znovu pozorujte.Výsledek pozorování opět zapište do protokolu.O jaký: v "v proces slo ? 4. Reakce bílkovin s roztoky solí těžkých kovu Do tří zkumavek dejte po 1,5 cm3 vodného roztoku bílku a potom do 1 první zkumavky přidejte několik kapek 0,5% roztoku CuS04 druhé zkumavky přidejte několik kapek 0,5% roztoku BaCl2 třetí zkumavky přidejte několik kapek 0,5% roztoku Pb(N03)2 . Obsahy zkumavek protřepejte a pozorujte. Výsledky pozoro-vání zapište.Potom do všech zkumavek přidejte po dvou cm destilované vody a opět protřepejte.Rozpustila se sraženina ? Jak typ srážení proběhl ? 5. Reakce bílkovin s aldehydy a karboxylovými kyselinami Do dvou zkumavek dejte po 1,5 cm vodného roztoku bílku a potom do pryní zkumavky dejte několik kapek vodného roztoku formaldehydu (formalinu) a do druhé zkumavky stejné množství kyseliny octové.Obsahy zkumavek protřepejte,pozorujte a výsledky pozorování zapište.Po zápisu výsledku pozorování zřeďte obsahy zkumavek 2 cm destilované vody, protřepejte, znovu pozorujte a výsledky pozorování opět zaznamenejte do protokolu. Jaký typ srážení se ve zkumavkách uskutečnil ? 6. Biuretová reakce bílkovin Do zkumavky dejte 1,5 cm3 vodného roztoku bílku nebo jiné bílkoviny a roztok zalkalizujte přidáním 0,5 cm3 10% vodného roztoku NaOH. Směsí důkladně protřepejte a potom do roztoku přidejte kapku silně zředěného vodného roztoku CuS04 a znovu obsahem zkumavky důkladně protřepejte. Pozorujte změny ve zkumavce a zaznamenejte výsledky pozorování. Reakce se nazývá biuretová od biuretu,kondenzačního produktu dvou molekul močoviny: Tuto reakci dávají i jiné sloučeniny,které mají aspoň dvě peptidické skupiny -NH-CO- .K těm patří peptidy od tripeptidů výše a samozřejmě i bílkoviny.Pozitivní reakci dává i seskupe- 2 ní -CS-NH- a =CH-NH- , histidin a arginin. 7. Reakce Sakaguchiho Bílkoviny poskytují s bromnanera, případně s chlornanem a alfa naftolem v alkalickém prostředí červené zbarvení.Reakce je podmíněna přítomností guanidinové složky argininu. Reakci provedeme tak, že ke zalkalizovanému vzorku bílkoviny nebo argininu přidáme 0,5 cm alkoholického roztoku alfa naf-tolu a nakonec několik kapek roztoku bromnanu. Vznikne malinově červené zbarvení. 8. Reakce xanthoproteinová Aromatické aminokyseliny (tyrozin,tryptofan) dávají výraznou reakci s HN03 Jejich benzenová jádra se nitrují á dávají žlutě zbarvené nitrosloučeniny.Rovněž většina bílkovin se při zahřátí s kyselinou dusičnou barví žlutě ( řecky xanthos - žlutý). Při působení koncentrované kyseliny dusičné na kůži, nehty,vlnu a pod. se rovněž objevuje žluté zbarvení.Působením -alkalií vzniká oranžově zbarvená sul aci-formy nitrosloučeniny. 3 K 1,5 cmJ vodného roztoku bílkoviny ve zkumavce přidáme opatrně asi 0,5 cm3 konc.HN03. Vzniká žluté zbarvení až sraženina. Po ochlazení a zalkalizování 10% roztokem NaOH se barva změní ze žluté na oranžovou. 9. Pauiiho reakce Tyrosin spolu s heterocyklickým histidinem je reagující složkou při Pauiiho reakci!Tyto aminokyseliny a t volné nebo jejich zbytky vázané v bílkovinách, poskytují s diazotovanou kyselinou súlfanilovou v alkalickém prostředí oranžově červené kopulační produkty. Ve zkumavce si připravíme Pauiiho reagens tak,že smísíme o 3 2 cm roztoku kyseliny sulf anilové s 0,5 ( případně 0,2) cm roztoku dusitanu a smísíme protřepáním.Do zkumavky dáme 1-2 3 3 cm roztoku vzorku bílkoviny a přidáme asi 0,5 cm Paulxho činidla a tolik roztoku Na2C03 o koncentraci 3 mol/dm3,aby reakce byla zřetelně alkalická. V případě přítomnosti uvedených aminokyselin nebo jejich zbytku se objeví oranžově červené zbarvení. 4 10. Adamkiewiczova reakce 3 Do zkumavky nalijeme vzorek bílkoviny,t.j. asi 1 cm a přidáme téměř stejný objem kyseliny glyoxalové (Adamkiewicz-ovo činidlo) nebo kyseliny octové, která téméž vždy obsahuje kyselinu glyoxalovou, velmi opatné v silně nakloněné zkumavce podvrstvíme asi 1 cm3 kyseliny sírové koncentrované. Po chvíli se na rozhraní kapalin objeví červenofialový prstenec. 11. Reakce ninhydrinová Reakci s ninhydrinem poskytují všechny volné aminokyseliny a peptidy. Z aminokyselinových zbytků vázaných v bílkovinách reaguje ovšem pouze lysin. Zkoušku provedeme tak,že ke vzorku 1-2 cm3 bílkoviny přidáme asi 0,3 cm3 roztoku ninhydrinu a důkladně povaříme.V pozitivním případě vzniká fialově modré zbarvení. 12. Reakce Hellerova Do zkumavky dáme asi 1 cm3 konc.kyseliny dusičné a potom pomalu po stěně zkumavky,kterou držíme šikmo opatrně přidáváme vodhý roztok bílku _tak,aby se kapaliny nesmísily.Na jejich rozbíraní se vytvoří bílý prstenec sražené bílkoviny. 13. Reakce na síru v bílkovinách Zkoušku na přítomnost síry provedeme následujícím zpúso-bem. Do zkumavky nalejeme asi 1 crrr 0,5% octanu olovnatého a 10% roztoku NaOH.Vytvoří-li se bílá sraženina, přidáme právě tolik roztoku hydroxidu, aby se sraženina rozpustila.K tomuto roztoku přilejeme několik kapek bílkovinného roztoku a směs opatrně chvíli povaříme. Roztok zhnědne nebo zčerná. 5 mm Cvičení 2 biochemie ULOKA 10 Teoretická pří p ra va Bílko viny složené,heteroproteiny,proteidy,bílkoviny konju-gované Tato skupina organických sloučenin biochemicky a biologicky velice významných patří mezi sloučeniny obsahující dusík. J sou složeny z vlastní bílkoviny,na niž je vázána nebíl-kovinná složka,t.zv. prostetická skupina.Mezi složené bílkoviny patří také fosfoproteidy,které jsou tvořeny bílkovinou, na niž je vázán zbytek kyseliny ÍIPO^ nebo H^PO^.Jednou z nich je KASEIE,hlavní bílkovina mléka. Kasein je přítomen v kravském mléce v množství asi 35 g 3 v 1 dm ,tedy asi 3,5 %, v mateřském mléce, je ho kolem 1 % . Y mléce se nachází ve formě své rozpustné vápenaté soli,ka -seinanu vápenatého, který se teplem nesrazí.Z mléka se dá vy-srážet octovou kyselinou nebo minerální kyselinou. kaseinan + ;kyse][ina -> kasein + vápenatá sůl vápenatý ' . , kyseliny * \.. .. Kasein je nerozpustný, ve vodě,ale rozpouští se roztocích alkalických, hydroxidů..V nadbytku kyseliny se rovněž rozpouští, protože obsahuje bazické skupiny. Při kysání mléka-vzniká vlivem enzymů způsobujících kvašená: la kto sy mléčná kyselina, která způsobí vysrážení kasienu. Tak jako většina bílkovin i kasein má nejmenší rozpustnost v okolí svého izoelektrického bodu,který je pH = 4,8.Samotné mléko má pH 6,6 - 6,9. Bílkoviny jednoduché,prosté,proteiny,holoproteiny Jsou to látky složené z mnoha zbytků aminokarboxylových kyselin ( molekulová hmotnost do 10.00C přísluší peptidům,nad 10o000 pak bílkovinám).Patří k nim např. albuminy a globuliny. A LBUIi/IIITY obsahují vázané diaminokarboxylové kyseliny .Ve vodě jsou rozpustné.Ze svých neutrálních roztoků se- něsrážejí nasyceným roztokem.KaČl a síranem horečnatým,ale srážejí " se -síranem: amonným a varem. . Albuminy se srážejí rovněž minerálními kyselinami. V mléce je v malém mnetz.stv/'' přítomen albumin niléčný, v ^revfjíw seru albujwíty sérové f •:..:-um;:j buminy ), v oční čočce jsou přítomny kry st o 1 iny, sc u č ú s t í h c. .oglobinu je albumin glcbin, v e vaječném žloutku je ul bumr. vó ječný , semenech hra-; h u legumelin, v obilí leukosin e po a. GLOBULÍNY jsou ve vodě neorospn.stne,a 1 e rozpouštějí se už v ředěných roztocích solí, zředěných kyselinách a louzích. Z neutrálních roztoků se srážejí naoř. síranem amonným,horečnatým a dalšími solemi nebo varem.Ľezi globulín, patří např. ^ioliuITny, sérové.,raíečne T TákírogÍoS^i^^v&Tově~'( "myoglo -bul iny), fibrinogen, globulíny vaječné ( ovoglobulíny), v bramborách je tuberiň e pod. Praktická část Chemikálie a činidla ředěný- roztok síranu meďnatého, 5-10 % vodný roztok hydroxidu sodného,- octová kyselina,kyseliny chlorovodíková, dusičná, sírová, destilovaná voda, pevný síran amonný,vodný roztok formaldehydu, octan olovnatý, ethanol,Líillonovo činidlo, nekondenzované syrové kravské mléko,nabotnalá semena hrachu, . Pomůcky a materiál plátěný hadřík,filtrační nálevka,filtrační kruh,stojan na zkumavky, sada zkumavek,lžíce na chemikálie, mikropipeta, plynový kahan, zápalky, odsávací . nálevka, Buchnerova baňka, filtrační, papír, nůžky, kádinka 250 cnrá, tyčinka (skleněná), železná sítka s azbestovou vložkou ; Ír f /sV fij o či fa /> rh1 i/# ÚKOL 10.1 . Isolace kaseinu z mléka Pracovní postup Do kádinky dejte asi 100 cm syrového mléka,zahřejte je na teplotu kolem 40°C a za míchání pomalu přidávejte octovou kyselinu nebo kyselinu minerální).Během přidávání sledujte pH roztoku,které by nemělo klesno.ut pod pH=5.Jakmile; se yysrá kyselinu a vy -srážený kase in odfiltrujte buď na odsávací baňce a-nebo ■'f J tra cm papír se nehodí, pro tcř-ř jdft) J^i' .po 4Mpou a filtrace i ze oríženrhc tlaku probíhá porr.a] v« o .':p.:31 ně). Pil t rát uschovejte pro ds": reakce,kasein z filtru a nebo z hadříku pc dvoj- a 2 t roj n .-.•ob:::'-n premytí destilovanou vodou přeneste do čisté zkumavky,přidejte asi 5 cm^ destilované vody a protřepejte. V další.fázi postupujte takto: ze zkumavky s dobře pro- třepanou suspensí kase-inu v destilované vodě odeberte asi 1 3 cm do další zkumavky,po kapkách přidávejte 5-10 % vodný roztok ITaOH a vždy dobře prctřerejte,kasein se bude rozpouštět . ~ 3 Porozpuštění kaaeinu opět odeberte asi 1 cm roztoku do další zkumavky-a-přidávejte po m ikrb kapkách silně zředěného roztoku síranu meďnatého.Roztok se modro- až červenofialově zbarví -důkaz přítomnosti bílkoviny. Do zbytku zalkalizovaneho roztoku kaseinu přidávejte po malých^kapkách kyseliny chlorovodíkové.Postupujte opatrně,protože ve zkumavce bude probíhat neutralizace,bude se uvolňovat teplo' a obsah zkumavky by mohl vystříknout do očí !Sraženina se bude opět vytvářet. ÚKOL 10.2 . Další úkoly provádějte s filtrátem získaným po oddělení kaseinu. • ' Roztok filtrátu bývá bezbarvý,někdy až nazelenalý - to je je závislé na tom,jakým krmivem se krmí dobytek.Obsahuje.ve vo-• dě rozpustné bílkoviny,zejména mléčný albumin,který lze dokázat, řadou reakcí. Ze zkumavky s filtrátem odebírejte asi po 1 ern^ roztoku vždy do nové zkumavky a proveďte následující zkoušky - reakce, a) srážení vo d n vn roztnkpm f/-.-.-.moi /JoW^n i , v- d) reakci biuretovou ( &,(Sjy js sJ^a?h ) -s e) reakci xantoproteinovou " srážení roztokem soli těžkého kovu •• t .Všechna pozorování podrobně zapište do protokolu. ÚKOL 10.3 Reakce lec-uninr. ze semen hrochu setého Několik semen hro obu ( nebo čočky) nechejte ve vlsžn:' vodě dokonale na bot na t.-ctorn několik semen dejte tcoc--' mií;ky a s asi 3 ern^ do:, til o vane vody dobře rozet "''ete .Potow homo-genát dejte do "rle.nmayerovy baňky kterou uzavřete o nechej na třepačce asi 10 minut třepat, aby. se maximálně vyluhovaly rozpustné bílkoviny. Po pro třepání provědte filtraci přes plátěný hadřík; tuhé zbytky yyhodte do odpadu a s filtrátem,který obsahuje bílkovdnu legiunin proveďte reakce na bílkoviny - viz úkol 10.2 . -........... ■ ....... Výsledky srovnejet s výsledky reakcí kaseinu. : v íček í ;■; biochemie / & JT% fAřJ y á;* Úloha 9 '■■''">' 'nic'.:', vlastnosti o reakce bílkovin Chemikálie c činidla: síran amonný - pevný, de .st :i .1 ova ni voda, ředěný roztok CuSO^ (0,5%), ředěný /o,'tok BaCl., ( 0,5%),ředěný roztok rb(N0-Jo (G,/,.), vodný roz-tok formaldehydu,octová kyselina, 107 vodný roztok hydroxidu sodného, chlornan alkal ic^'ho kov P^/^yi^ 1-na f tol, kyselina dusičná konc ., sul f s nilová ky v selina, dusitan^odný", Na2C0^ , glyoxal cvá kyselí: kyselina sírová ko nc ,, ninbzydrin, octan olovnatý, Pomůcky a materiál: plynový kahan, zápalky, syrově ve j ce , stoja; :kumavky, 15 zkumavek, kádinka a o<~ na míchaní, stojan, filtrační nálevka, vata , kádi: 3 „ . 100 cm , filtracra kruh, spachtilckc a nebo ms! lžíce na chemikálie, rj ' ťť> „ j. ■,.>.. .<.-- ■'■ - Poznámky: všechny úkoly v tomto laboratorním cvičení pati mezi srážecí nebo barevné reakce bílkovin, J sou to reakce citlivé,proto je třeba používat či skla,čerstvých roztoků činidel a používat ta d ěných roztoků činidel,proto že při pcužizí trovaných roztoků jsou zbarvení produktů spatní nebo vůbec nepozorovatelná. Po každé reakci nutno zkumavky vymýt za použit: kartáče na zkumavky a ne pouze vypláchnout. Během všech experimentů používejte destilované v 1. Příprava roztoku bílkoviny vaječného .bílku Nad kádinkou objemu 250 cm se 150 cm destilované vody opatrně rozbijeme syrové vejce tak,abyčhom oddělili bílek od žloutku. Žloutek přeneseme do čisté kádinky, stačí objem 150 cm a použijeme je'} k dalším zkouškám. 'Bílek rozpustime v kádince za míchání tyčinkou. Po dokonalém'rozpuštění bílku roztok přefiltrujeme pres chomáček čisté vaty nebo čistý plátěný hadřík do čisté Erlem;;eyerovy baňky objemu kolem 250 cm3. Filtrát budeme používat ke zkouškám a dalším experimentům. 2. Nevratné srážení bílkoviny teplem Do zkumavky dáme 1-2 cm3 roztoku bílku a za protřepávání zahříváme nad plynovým kahanem. Bílkovina se vysrází. Pozorujte,zds zůstane sraženina zachována i po ochlazení roztoku. Zůstanerli nachována vysvětlete o jaký typ srážení jde. 3. Působení neutrálních solí na roztoky bílkovin Do zkumavky s 1,5 cnr roztoku vaječného bílku přidejte špachtličkou po malých dávkách asi 0,5 g pevného síranu amonného. Po každé dávce síranu obsahem zkumavky zvolna, ale důkladně protřepejtj^Sůl přidávejte tak dlouho, dokud se nezačne bílkovina sráret. Potom přidejte ještě jednu dávku soli, protřepejte, nechte chvíli ustát, pozorujte a výsledek pozoro-vání zapište do protokolu. Po zápisu výsledku pozorování přidejte do zkumavky asi 1 cm destilované vody,obsahem opět protřepejte a znovu pozorujte.Výsledek pozorování opět zapište do protokolu.O jaký proces šlo ? 4. Reakce bílkovin s roztoky solí těžkých kovu l Do tři zkumavek dejte po 1,5 cm vodného roztoku bílku a potom do 1 první zkumavky přidejte několik kapek 0,5% roztoku CuS04 druhé zkumavky přidejte několik kapek 0,5% roztoku BaCl2 třetí zkumavky přidejte několik kapek 0,5% roztoku Pb(N03)2 . Obsahy zkumavek protřepejte a pozorujte- Výsledky pozoro-Vjáni zapište. Potom do všech zkumavek přidejte po dvou cm destilované vody a opět protřepejte.Rozpustila se sraženina ? Jak typ srážení proběhl ? 5. Reakce bílkovin s aldehydy a karboxylovými kyselinami Do dvou zkumavek dejte po 1,5 cm vodného roztoku bílku a potom do první' zkumavky dejte několik kapek vodného roztoku formaldehydu (formalinu) a do druhé zkumavky stejné množství kyseliny octové.Obsahy zkumavek protřepejte,pozorujte a výsledky pozorování zapište.Po zápisu výsledku pozorování zřeďte obsahy zkumavek 2 cm3 destilované vody, protřepejte, znovu pozorujte a výsledky pozorování opět zaznamenejte do protokolu. Jaký typ srážení se ve zkumavkách uskutečnil ? 6. Biuretová reakce bílkovin Do zkumavky dejte 1,5 cm vodného roztoku bílku nebo jiné bílkoviny a roztok zalkalizujte přidáním 0,5 cm3 10% vodného roztoku NaOH. Směsí důkladně protřepejte a potom do roztoku přidejte kapku silně zředěného vodného roztoku CuSÓ4 a znovu obsahem zkumavky důkladně protřepejte. Pozorujte změny ve zkumavce a zaznamenejte výsledky pozorování. Reakce se nazývá biuretová od biuretu,kondenzačního) produktu dvou molekul močoviny: Tuto reakci dávají i jiné sloučeniny,které mají aspoň dvě peptidické skupiny -NH-CO- .K těm patří peptidy od tripeptidů výše a samozřejmě i bílkoviny.Pozitivní reakci dává i seskupe- 2 ní -CS-NH- a =CH-NH- , histidin a arginin. 7. Reakce Sakaguchxho Bílkoviny poskytují s bromnanem, případně s chlornanem a alfa naftolem v alkalickém prostředí červené zbarvení.Reakce je podmíněna přítomností guanidxnové složky argininu. Reakci provedeme tak, že ke zalkalizovanému vzorku bílkoviny nebo argininu přidáme 0,5 cm3 alkoholického roztoku alfa naf-tolu a nakonec několik kapek roztoku bromnanu. Vznikne malinově červené zbarvení. Aromatické aminokyseliny (tyrozin,tryptofan) dávají výraznou reakci s HN03 Jejich benzenová jádra se nitrují a dávají žlutě zbarvené nitrosloučeniny.Rovněž většina bílkovin se při zahřátí s kyselinou dusičnou barví žlutě ( řecky xanthos - žlutý). Při působení koncentrované kyseliny dusičné na kůži, nehty,vlnu a pod. se rovněž objevuje žluté zbarvení.Působením alkalií vzniká oranžově zbarvená sul aci-formy nitrosloučeniny. £| 8. Reakce xanthoproteinová 3 K 1,5 cm vodného roztoku bílkoviny ve zkumavce pridáme opatrně asi 0,5 cm3 konc.HN03. Vzniká žluté zbarvení až sraženina. Po ochlazení a zalkalizování 10% roztokem NaOH se barva změní ze žluté na oranžovou. 9. Pauliho reakce— Tyrosin spolu s heterocyklickým histidinem je reagující složkou při Pauliho reakci.Tyto aminokyseliny ať volné nebo jejich zbycky vázané v bílkovinách, poskytují s diazotovanou kyselinou sulfanilovou v alkalickém prostředí oranžově červené kopulační produkty. Ve zkumavce si připravíme Pauliho reagens tak,že smísíme T 3 2 cirr roztoku kyseliny sulfanilové s 0,5 ( případně 0,2) cm roztoku dusitanu a smísíme protřepáním.Do zkumavky dáme 1-2 cm roztoku vzorku bílkoviny a přidáme asi 0,5 cm Pauliho činidla a tolik roztoku Na2C03 o koncentraci 3 mol/dm3,aby reakce byla zřetelně alkalická. V případě přítomnosti uvedených aminokyselin nebo jejich zbytku se objeví oranžově červené zbarvení. 10. Adamkiewiczova reakce Do zkumavky nalijeme vzorek bílkoviny,t.j. asi 1 cm a přidáme téméř stejný objem kyseliny glyoxalové (Adamkiewicz-ovo činidlo) nebo kyseliny octové, která témě ž vždy obsahuje kyselinu glyoxalovou, velmi opatně v silně nakloněné zkumavce podvrstvíme asi 1 cm kyseliny sírové koncentrované. Po chvíli se na rozhraní kapalin objeví červenofialový prstenec. 11. Reakce ninhydrinová Reakci s ninhydrinem poskytují všechny volné aminokyseliny a peptidy. Z aminokyselinových zbytků vázaných v bílkovinách reaguje ovšem pouze lysin. Zkoušku provedeme tak,že ke vzorku 1-2 cm bílkoviny přidáme asi 0,3 cm roztoku ninhydrinu a důkladně povaříme.V pozitivním případě vzniká fialově modré zbarvení. 12. Reakce Hellerova Do zkumavky dáme asi 1 cm konc.kyseliny dusičné a potom pomalu po stěně zkumavky,kterou držíme šikmo opatrně přidáváme vodný roztok bílku tak,aby se kapaliny nesmísily.Na jejich rozhraní se vytvoří bílý prstenec sražené bílkoviny. 13. Reakce na síru v bílkovinách Zkoušku na přítomnost síry provedeme následujícím způso-bem. Do zkumavky nalejeme asi 1 cm 0,5% octanu olovnatého a 10% roztoku NaOH.Vytvoří-li se bílá sraženina, přidáme právě tolik roztoku hydroxidu, aby se sraženina rozpustila.K tomuto roztoku přilejeme několik kapek bílkovinného roztoku a směs opatrně chvíli povaříme. Roztok zhnedne nebo zčerná. 5