64 Thomson došel k závěru, že neonový plyn byl složen z atomů s různým nukleonovým číslem (20 Ne a 22 Ne)8 . Teoretické základy hmotnostní spektrometrie položil J. J. Thomson roku 1913 9 . O několik let později F. W. Aston sestrojil první moderní hmotnostní spektrometr, který je založen na separaci iontů v silném magnetickém poli permanentního magnetu tzv. magnetického selektoru10 . Pomocí hmotnostního spektrometru identifikoval 212 z 287 přirozeně se vyskytujících izotopů, za což získal v roce 1922 Nobelovu cenu za chemii 11 .   MALDI TOF–MS Na Obr. 1 je uvedeno jednoduché schéma MALDI–TOF. Na krystaly matrice se vzorkem je aplikováno laserové záření, které způsobí desorpci molekul matrice spolu s molekulami vzorku a zároveň dojde k ionizaci molekul vzorku předáním H+ od molekul matrice. Poté je aplikováno extrakční napětí mezi MALDI destičku a vstupní štěrbinu průletového analyzátoru, čímž dojde k extrakci nabitých molekul podle zvolené polarity napětí a k jejich analýze v průletovém hmotnostním analyzátoru. V závislosti na době letu molekul analyzátorem k detektoru se vypočítá poměr m/z. Identifikace mikroorganismů pomocí MALDI-TOF MS Truong Thanh Huonga , Markéta Komínkováa , Roman Guráňa , Branislav Ruttkay-Nedeckýb , Pavel Kopelb , Libuše Trnkováb , Ondřej Zítkaa,b , Vojtěch Adama,b, René Kizeka,b a Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika b Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, 616 00 Brno, Česká republika Přijato k publikování: 20. 6. 2014 Klíčová slova: identifikace bakterií, MALDI–TOF MS, mikroorganismy Úvod Identifikace mikroorganismů pomocí metody MALDI–TOF MS (hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem: Matrix–Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight mass spectrometry) je vysoce přesná, aplikovatelná pro široké spektrum mikroorganismů a mnohem rychlejší ve srovnání s tradičními metodami 1 . Dosavadní znalosti a výsledky pokusů provedenýchpomocíMALDI–TOFMSdokazují schopnost rozlišit bakterie či jiné mikroorganismy na rodové, druhové a často i na kmenové úrovni2,3 . Jejich přesné stanovení může sloužit pro monitoring životního prostředí, zpracování potravin, ochranu veřejného zdraví či klinickou diagnostiku, kde je důležité zjištění přítomnosti patogenních organismů 4-7 . Hmotnostní spektrometrie Na počátku hmotnostní spektrometrie stál J. J. Thomson, který zacílil proud částic ionizovaného neonu přes magnetické a elektrické pole, umístěním fotografické desky v proudu iontů neonu změřil jejich odchylku. Pozoroval dvě světelné stopy na fotografické desce, pro které navrhl dvě odlišné odchylky parabol. Identification of microorganisms using MALDI–TOF MS One of the possible usages of MALDI–TOF MS is identification of microorganisms. It is highly accurate and faster than other methods and suitable for a large area of microorganisms. But unfortunately cannot reliably differentiate some closely related species. Often, it is possible to detect pathogenic organisms and use their accurate determination for monitoring environment, food processing or clinical diagnostics. Data obtained from mass spectra are compared with library of microorganisms and result of this was agreement or disagreement of microorganisms with specific spectrum. REVIEW 65 Detektor Detektor je schopen zachytit dopadající ionty, ze kterých vypočítává hmotnost každého iontu, který na něj dopadne. Velká část detektorů je založena na převodu iontů na elektrický signál pomocí scintilační vrstvy, která při dopadu iontů vydává světelné záření. Tento typ záření je převeden na elektrický proud a dále zesílen. Detektory rozdělujeme na elektronový, fotonásobič a Faradayovu klec 12 . Matrice Výběr matrice je důležitým faktorem analýzy. Vhodné matrice pro UV lasery jsou aromatické karboxylové kyseliny, většinou deriváty kyseliny benzoové rozpuštěné nejčastěji ve vodném roztoku acetonitrilu, ethanolu nebo methanolu. Roztok se navíc často okyseluje kyselinou trifluoroctovou. Nejpoužívanější matrice jsou kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (HCCA), 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová (sinapová, SA), 2,5-dihydroxybenzoová (gentisová, DHB), 4-hydroxy-3-methoxyskořicová (ferulová, FA). Matrice odlišně krystalizují a ionizují látky. DHB (viz Obr. 2) se používá jako univerzální matrice, je vhodná pro stanovení vysokomolekulárních látek, dobře ionizuje peptidy, proteiny, lipidy, nukleové kyseliny a sacharidy 12 . Obr. 2: Vzorec DHB (2,5 - dihydroxybenzoová kyselina) Závěr Hmotnostní spektrometrie je mimo celé řady svého využití velmi často využívána pro identifikaci mikroorganismů 12,14 . Tato práce shrnuje vlastní popis analytické metody, a to především v souvislosti s vlastní detekcí mikroorganismů. Vyhodnocená data získaná z hmotnostních spekter a následující porovnání s knihovnou Obr. 1: Schéma MALDI–TOF hmotnostního spektrometru TOF analyzátor Základním principem TOF analyzátoru je extrakceiontůaměřenídobyjejichletu.Iontyse pomocí vloženého napětí na extrakční mřížku urychlí (extrahují) elektrickým polem a získají rychlost v závislosti na jejich hmotnosti m a velikosti náboje z. Získaná kinetická energie je přímo úměrná náboji iontů a nepřímo úměrná jejich hmotnosti. Výsledkem je rozdílná rychlost iontů s různým poměrem m/z, a proto takto urychlené ionty dopadnou na detektor v rozdílném čase, pokud urazí stejnou vzdálenost 7,12 . Ionizace Proces matricí zprostředkované laserové ionizace „matrix assisted laser desorption ionization“ (MALDI) využívá ke své funkci matrici, schopnou transformovat energii laseru na ionizaci a předat ji analytu. V případě MALDI dochází k podobným desorpčním procesům jako v případě LDI (laserem indukovaná ionizace). Energie, která je potřebná pro desorpci, závisí na sublimační energii daného vzorku a chemických reakcích probíhajících v kondenzované fázi těsně před expanzí plazmového obláčku. Při jednom „střelení“ se vytvoří řádově několik tisíc iontů. V průběhu MALDI „mikroexploze“ dochází nejen k desorpčním jevům podobným LDI, ale také k chemickým a fotony indukovaným reakcím. Nejčastěji se využívají dusíkové nebo Nd-YAG lasery emitující UV záření 12,13 . Huong et al. Obr. 2: Vzorec DHB (2,5 - dihydroxybenzoová kyselina) Obr. 1: Schéma MALDI–TOF hmotnostního spektrometru 66 hmotnostních spekter mikroorganismů v programu MALDI Biotyper slouží k identifikaci mikroorganismů na úrovni rodu, druhu a často i kmenu 15 . Výsledkem porovnání může být shoda nebo neshoda s hmotnostními spektry vzorku16 . Program Biotyper vyhodnocuje výsledky pomocí tzv. skóre (nejvyšší možná hodnota je 3), které je dále barevně označeno červenou (žádná shoda), žlutou (částečná shoda) a zelenou (plná shoda) barvou 17 . Příčiny neshody výsledků s knihovnou mohou často souviset například s kontaminací vzorků s jinými mikroorganismy nebo nesprávnou kultivací mikroorganismů 17 . Tato práce byla financována z projektu SIX CZ.1.05/2.1.00/03.0072. The authors declare they have no potential conflicts of interests concerning drugs, products, services or another research outputs in this study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE „uniform reguirements“ for biomedical papers. Literatura 1. Guo L., Ye L., Zhao Q., Ma Y., Yang J., Luo Y.: Journal of thoracic disease, 6, 534 (2014). 2. Trevino M., Areses P., Penalver M. D., Cortizo S., Pardo F., del Molino M. L. P., Garcia-Riestra C., Hernandez M., Llovo J., Regueiro B. J.: Anaerobe, 18, 37 (2012). 3. Pinto L., Poeta P., Vieira S., Caleja C., Radhouani H., Carvalho C., Vieira-Pinto M., Themudo P., Torres C., Vitorino R., Domingues P., Igrejas G.: Journal of Proteomics, 73, 1535 (2010). 4. Schafer M. O., Genersch E., Funfhaus A., Poppinga L., Formella N., Bettin B., Karger A.: Veterinary Microbiology, 170, 291 (2014). 5. Wang W., Xi H., Huang M., Wang J., Fan M., Chen Y., Shao H., Li X.: Journal of thoracic disease, 6, 524 (2014). 6. Chalupova J., Raus M., Sedlarova M., Sebela M.: Biotechnology Advances, 32, 230 (2014). 7. DeMarco M. L., Ford B. A.: Clinics in Laboratory Medicine, 33, 611 (2013). 8. Thomson J. J.: Proceedings of the Royal Society, 1, 1 (1913). 9. Thomson J. J.: Science (New York, N.Y.), 37, 360 (1913). 10. W. A. F.: Phys. Review, 316 (1918). 11. Aston F. W.: 152 (1922). 12. van den Boom D., Wjst M., Everts R. E.: Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1015, 71 (2013). 13. Cho Y. T., Su H., Huang T. L., Chen H. C., Wu W. J., Wu P. C., Wu D. C., Shiea J.: Clinica Chimica Acta, 415, 266 (2013). 14. Samb-Ba B., Mazenot C., Gassama-Sow A., Dubourg G., Richet H., Hugon P., Lagier J. C., Raoult D., Fenollar F.: Plos One, 9, (2014). 15. Braga P. A. C., Tata A., dos Santos V. G., Barreiro J. R., Schwab N. V., dos Santos M. V., Eberlin M. N., Ferreira C. R.: Rsc Advances, 3, 994 (2013). 16. Sauer S., Kliem M.: Nature Reviews Microbiology, 8, 74 (2010). 17. Machen A., Drake T., Wang Y. F.: Plos One, 9, (2014). Článek je volně šiřitelný pod licencí Creative Commons (BY-NC-ND). Musí však být uveden autor a dokument nelze měnit a použivat pro komerční účely. Journal of Metallomics and Nanotechnologies 2014, 1, 64—66