ANALYTICKÁ CHEMIE Mgr. Jana Horská, Ph.D. Katedra fyziky, chemie a odborného vzdělávání Pedagogická fakulta MU Poříčí 7 603 00 Brno 4. část Instrumentální metody analytické chemie Hmotnostní spektrometrie (MS, mass spectrometry) Úvodem … analýzy hornin určení molekulové hmotnosti studované látky určení prvkového složení studované látky identifikace reakčních produktů určení poměru isotopů chemie, biologie, genetika, farmakologie atd. vysoce citlivá metoda Sonda Curiosity Úvodem… ̶ hmotnostní spektrometrie (MS) – analytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty, rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) a následnému záznamu relativních intenzit jednotlivých iontů ̶ hmotnostní spektrometr – je iontově-optické zařízení, které rozlišuje ionty podle poměru jejich m/z ̶  ̶ vysoká citlivost ̶ kvalitativní analýza – určení MR a dalších strukturních informací ̶ kvantitativní analýza – odezva je závislá na koncentraci ̶ minimální spotřeba vzorku ̶  ̶ destruktivní metoda ̶ vysoké pořizovací a provozní náklady Úvodem… ̶ hmotnostní spektrum – graf závislosti intenzity iontů (absolutní/relativní) na jejich m/z - nikoliv chromatogram ̶ !Nepoužívat! ̶ hmotnostní spektroskopie nebo hmotnostní spektroskop ̶ hmotnostní spektrofotometr, atd. ̶ m/z - bezrozměrná veličina získaná vydělením hmotnosti iontu nábojovým číslem (počtem elementárních nábojů, bez ohledu na polaritu Úvodem… ̶ základní pík spektra – pík s největší intenzitou ve spektru ̶ ion prekurzoru – ion, který reaguje za vzniku konkrétních produktových iontů – nepoužívá se termín "rodičovský ion" ̶ produktový ion – vzniká jako produkt po reakci z jednotlivých iontů prekurzoru – disociace (fragmentový ion) – nepoužívá se termín "dceřiný ion" ̶ fragmentový ion – produktový ion vzniklý disociací iontu prekurzoru ̶ aduktový ion – ion tvořený interakcí iontu s jedním a více atomy nebo molekulami ̶ [M+Na]+, [M+K]+, [M+Cl]-, atd. ̶ molekulární ion – ion vzniklý odebráním nebo přidáním jednoho a více elektronů za vzniku kladného nebo záporného iontu Základní části hmotnostního spektrometru ̶ 1) iontový zdroj – slouží k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice (tzv. ionizace), konstrukce se liší podle použité ionizační techniky ̶ 2) hmotnostní analyzátor – slouží k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) ̶ 3) detektor – slouží k detekci iontů po jejich rozdělení podle m/z a k určení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontů další důležité části: vakuový systém, PC Blokové schéma Ionizační techniky = tvorba iontů ̶ iontový zdroj hmotnostního spektrometru slouží k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice (ionty) ̶ tvrdé ionizační techniky (EI) - ionizovaná molekula při ionizaci získá nadbytek vnitřní energie, což se projeví fragmentací molekulového iontu na menší části (tzv. fragmentové ionty) ̶ měkké ionizační techniky - (šetrné) ionizovaná molekula získá mnohem menší množství energie oproti EI, proto ve spektrech pozorujeme zejména (de)protonované molekuly a minimum fragmentových iontů Nejdůležitější ionizační techniky Název a zkratka techniky Zdroj ionizační techniky Vlastnosti spektra Ionizace nárazem elektronu (EI) Elektrony o vysoké energii Intenzivní fragmentace Chemická ionizace (CI) Reaktivní částice reakčního plynu Malá fragmentace, píky většinou při hmotnosti o jednotku vyšší Ionizace odstřelováním urychlenými ionty (FAB) Paprsek atomů o vysoké energii Molekulový ion i fragmenty Laserová desorpce a ionizace za účasti matrice (MALDI) Fotony o vysoké energii Molekulový ion, vícenásobné nabité ionty Ionizace elektrosprejem (ESI) Elektrické pole produkující nabitý sprej částic, které následně desolvatují Vícenásobné nabité ionty FAB (fast atom bombardment) MALDI (matrix-assissted laser desorption/ionization) ESI (electrospray ionization) ESI MALDI ̶ vzorek v roztoku smíchán s matricí ̶ roztok nakápnut a vysušen (vykrystalizován) na MALDI destičce ̶ pulzní ozáření směsných krystalů zábleskem laseru Hmotnostní analyzátory = dělení iontů ̶ hmotnostní analyzátor slouží k dělení iontů v plynné fázi za vakua podle poměru jejich hmotnosti a náboje (m/z) ̶ analyzátor je umístěn za iontovým zdrojem (tzn. molekuly již byly převedeny na ionty) a před detektorem (před detekcí musíme ionty rozdělit podle m/z) ̶ dělení iontů v analyzátoru probíhá za vysokého vakua (cca. 10-3 - 10-11 Pa, podle typu analyzátoru) ̶ sektorové analyzátory ̶ kvadrupolové analyzátory ̶ průletový analyzátor (TOF, time-off-flight) Sektorové analyzátory ̶ magnetický sektorový analyzátor ̶ nejdéle používaný a nejdéle prozkoumaný, stále se vyvíjí ̶ velmi přesný, ve své moderní verzi velmi nákladný (v klin. chemii není běžně používaný) ̶ využívá skutečnosti, že dráha nabité částice se v magnetickém poli zakřivuje tím více, čím má vyšší náboj a nižší hmotnost ̶ pouze GC-MS Kvadrupolové analyzátory ̶ konstrukce – 4 kovové tyče na ně vloženo stejnosměrné a střídavé napětí ̶ lze použít pro GC-MS nebo LC-MS Průletový analyzátor ̶ detekuje hmotnosti ionizovaných molekul na základě doby jejich letu evakuovanou trubicí ̶ rychlosti letu závisí na hodnotách efektivního náboje m/z ̶ v kombinaci s MALDI ionizací Detektory ̶ elektronový násobič – systém dynod se vzrůstajícím potenciálem ̶ fotonásobič Hmotnostní spektrum Instrumentální metody analytické chemie Nukleární magnetická rezonance (NMR, nuclear magnetic resonance) Úvodem ... ̶ absorpce elektromagnetického záření z mikrovlnné a radiofrekvenční oblasti ν = 100-1000 MHz (λ = 3000-300 mm) jádry některých atomů v molekulách analyzovaných látek (vzorků) umístěných v magnetickém poli patří mezi spektroskopické metody (NMR spektroskopie) ̶ kvalitativní analýza: identifikace a řešení struktury organických sloučenin (nejčastěji využití 1H-, 13C-, 19F-, 31P-NMR) ̶ určování způsobu vazby méně běžných prvků (Al, Se, Sn…) jak studium nízkomolekulárních látek, tak makromolekulárních (bílkoviny, DNA, RNA, atd.) ̶ kvantitativní analýza směsí Úvodem ... ̶ nukleární ̶ využívá vlastnosti jader atomů (magnetický moment) ̶ záření absorbováno jádry atomů ̶ magnetická ̶ studovaný vzorek v silném externím magnetickém poli ̶ 100 MHz → 2,35 T ̶ 1000 MHz → 23,5 T ̶ resonance ̶ absorpce a následná emise záření o energii (frekvenci, MHz) potřebné pro přechod mezi energetickými stavy jádra ̶ 300 MHz NMR spektrometr ̶ 300 MHz pro 1H 75,5 MHz pro 13C 25,4 MHz pro 15N Fyzikální podstata ̶ základní podmínka: nenulový jaderný magnetický moment µ ̶ spinové kvantové číslo (I nebo ms) – popisuje vnitřní moment rotace elektronu (spin jádra je dán kombinací spinů jednotlivých protonů a neutronů, které nabývají hodnot +1/2 nebo -1/2) ̶ jaderný spin = součet spinů všech částic v jádře typy jader: sudý počet protonů i neutronů (4He, 12C, 16O) → I = 0 lichý počet protonů i neutronů (2H, 6Li, 10B, 14N) → I = 1, 2, 3 Fyzikální podstata ̶ typy jader: ̶ sudé A i Z ̶ (4He, 12C, 16O) → I = 0 ̶ liché A nebo Z nebo obojí (→ I > 0) ̶ spiny nejsou spárovány ̶ jádro rotuje, má magnetický moment ̶ I = 1/2 - např. 1H, 13C, 15N, 19F ̶ rotující koule, vhodné pro NMR ̶ I ≥ 1/2 - např. 2H, 14N, 17O ̶ rotující elipsoid, kvadrupolární jádra Fyzikální podstata ̶ magnetický moment - μ ̶ rotující náboje (tzn. atomová jádra s I > 0) okolo sebe vytváří magnetické pole charakterizované magnetickým momentem ̶ vektorová veličina s velikostí a směrem ̶ různý pro různá jádra Účinek magnetického pole na jádro ̶ základní stav (bez vlivu externího magnetického pole, B0 = 0) ̶ magnetické momenty neuspořádané, energeticky jednotné ̶ jádro v externím magnetickém poli (B0 > 0) ̶ magnetické momenty uspořádány ve směru nebo proti směru působícího magnetického pole ̶ každá orientace magnetického momentu odpovídá určitému energetickému stavu ̶ jádra s I = 1/2 → dvě orientace magnetického momentu (dva energetické stavy) ̶ Iz = +1/2 - nižší energetický stav (paralelně s vnějším magnetickým polem) - více jader ̶ Iz = -1/2 - vyšší energetický stav (antiparalelně s vnějším magnetickým polem) - méně jader Účinek magnetického pole na jádro ̶ počet hladin = 2 I +1 , tj. počet možných orientací vektoru magnetického momentu jádra v magnetickém poli ̶ vzdálenost energetických hladin Magnetická rezonance jádra (NMR experiment) ̶ precesní pohyb ̶ magnetický moment není rovnoběžný s vnějším magnetickým polem ̶ magnetický moment rotuje okolo osy z ̶ úhlová frekvence pohybu = Larmorova (ω0) ̶ obecně platí ω = 2π∙ν Magnetická rezonance jádra (NMR experiment) ̶ měníme ν – tedy v určitém okamžiku je tato frekvence rovná Larmorově frekvenci ̶ absorpce a emise elektromagnetického záření ̶ absorpce - přechod jádra z nižšího energetického stavu do vyššího (+1/2 → -1/2) ̶ emise - přechod jádra z vyššího energetického stavu do nižšího (-1/2 → +1/2) ̶ před experimentem je více jader v nižším energetickém stavu → převládá absorpce ̶ = RESONANCE Magnetická rezonance jádra (NMR experiment) ̶ jádro ve vnějším magnetickém poli (B0) → dva spinové stavy ̶ magnetické momenty rotují (ω0) kolem osy z ve směru paralelním nebo antiparalelním s vnějším magnetickým polem ̶ na jádro působíme elektromagnetickým zářením (ν) (kolmo na směr vnějšího magnetického pole) ̶ měníme ν - v určitém okamžiku je tato frekvence rovná Larmorově frekvenci teplota -269 °C a méně proud 100 a více A pole generované touto cívkou je 4 -18 T NMR CEITEC MRI, nuclear magnetic imaging NMR spektrum – chemický posun NMR spektrum – chemický posun Chemický posun (δ) se udává v jednotkách ppm NMR spektrum: spin-spinová interakce ̶ 1-chloro-4-nitrobenzen ̶ dva typy vodíků (HA, HB) s různým okolím ̶ HA - ovlivňovány magnetickým polem vodíků HB NMR spektrum: spin-spinová interakce NMR spektrum: spin-spinová interakce ̶ tzv. Pascalův trojúhelník Instrumentální metody analytické chemie Kapilární elektroforéza (capillary electrophoresis) Úvodem ... ̶ elektromigrační separační metoda – založena na rozdílné migrační rychlosti elektricky nabitých částic v elektrickém poli elektroforetická mobilita rychlost iontu Blokové schéma BGE (background electrolyte) = základní elektrolyt 2 jevy: migrace iontů (ionty putují k opačně nabité elektrodě) elektroosmóza elektroosmotický tok (EOF, electroosmotic flow) křemenná kapilára porvchové silanolové skupiny -SiOH -SiO− pH>3 je rychlost EOF větší než rychlost migrace většiny iontů KATODAANODA BGE KŘEMENNÁ KAPILÁRA Elektroosmotický tok ̶ elektroosmóza způsobuje tok celého roztoku, tzv. elektroosmotický tok ̶ jedna z hybných sil elektroforézy ̶ při pH > 3 se ionizují silanové skupiny na vnitřní straně kapiláry tato vnitřní strana se chová, jako by měla záporný náboj ̶ přitahování kationtu putujících se katodě, ale vzhledem k malým rozměrům kapiláry (průměr menší než 1 mm) dochází k strhávaní aniontu, které poté také putují ke katodě (tento předpoklad neplatí, pokud pohyblivost aniontu je větší, něž pohyblivost elektroosmózy) ̶ rychlost elektroosmózy je po celé délce kapiláry stejná ̶ díky elektroosmotickému toku, lze separovat kationty i anionty zároveň Elektroosmotický tok ̶ seřazení složek analytu do jednotlivých zón: ̶ 1 kationty urychlené EOF ̶ n neutrální látky pohybující se rychlostí EOF ̶ 2,3 anionty opožďující se za EOF křemenná kapilára kazeta Instrumentální metody analytické chemie Optické metody – refraktometrie, polarimetrie, nefelometrie, turbidimetrie Refraktometrie ̶ metoda pro měření indexu lomu látek pevných, kapalných i plynných, při které se využívá mezního úhlu lomu, resp. úplného odrazu světla ̶ index lomu je charakteristickou veličinou látek, je znakem jejich čistoty a pomocí něho lze určit také koncentraci ̶ kvalitativní, tak kvantitativní analýza (ověřování čistoty pevných nebo kapalných látek) ̶ refraktometr Refraktometrie ̶ index lomu ̶ absolutní index lomu ̶ relativní index lomu ̶ Snellův zákon Refraktometr Další typy: Ruční Ponorný Abbeův suchý refraktometr pro měření postačí pár kapek vzorku, který se nakápne mezi 2 hranoly Polarimetrie ̶ využívá se schopnosti opticky aktivních látek stáčet rovinu polarizovaného světla doprava nebo doleva ̶ lineárně polarizované světlo – kmitá v jedné rovině proložené paprskem (elektrická složka v jedné, magnetická složka ve druhé, na ni kolmé rovině) ̶ kruhově polarizované světlo – elektrický (a magnetický) vektor koná rotační pohyb ve směru šíření paprsku ̶ opticky aktivní látky – nelze ztotožnit s jejich zrcadlovým obrazem, asymetrické centrum (nejčastěji asymetrický uhlík) Polarimetrie ̶ Měrná otáčivost ̶ rovná se úhlu otočení roviny polarizovaného světla pro jednotkovou tloušťku kyvety a jednotkovou koncentraci roztoku ̶ charakterizuje opticky aktivní látku ̶ udává se pro teplotu 20 ̊C a vlnovou délku 589,3 nm (sodíkový dublet) ̶ klesá s rostoucí teplotu Polarimetrie ̶ úhel otočení je přímo úměrný délce kyvety a koncentraci opticky aktivní látky ̶ α .... úhel otočení roviny polarizovaného světla ̶ l .... tloušťka vrstvy opticky aktivní látky v dm ̶ c .... koncentrace látky v g/cm3 Polarimetr Použití ̶ využívá se ke kontrole čistoty chirálních látek ̶ cukrovarnictví a potravinářství ̶ v klinické praxi – bílkoviny v moči, ve farmacii a biochemii pro stanovení steroidů, vitamínů a alkaloidů Nefelometrie ̶ optická nespektrální metoda založená na měření záření rozptýleného vzorkem ̶ rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem odlišným od směru dopadajícího záření ̶ konvenční nefelometry – halogenová nebo xenonová výbojka ̶ optika přístrojů obsahuje navíc interferenční filtr ̶ detektor nastaven pod úhlem 70° až 90° Nefelometrie stanovení látek přítomných v malé koncentraci, často v klinických laboratořích Turbidimetrie ̶ optická nespektrální metoda založená na měření záření prošlého vzorkem ̶ měří se tzv. stupeň zákalu (turbidita) ̶ měření se provádí v přímém směru v ose světelného paprsku zdroje Nefelometrie a turbidimetrie ̶ v praxi se používá technika kalibrační křivky ̶ turbidimetrie vhodná pro měření vzorků s velkým obsahem částic ̶ nefelometrie slouží ke stanovení látek přítomných v malé koncentraci ̶ metody lze aplikovat pro kapalné i plynné vzorky ̶ častá jsou použití v klinických laboratořích ̶ pomocí obou metod se provádí sledování znečištění vzduchu (kouře, mlhy, aerosolů a vod ̶ ve vodárenské praxi se provádí turbidimetrické stanovení síranu po vysrážení ve formě jako nerozpustného BaSO4 Instrumentální metody analytické chemie Elektroanalytické metody – elektrogravimetrie, coulometrie Elektrogravimetrie a coulometrie ̶ dochází v důsledku elektrolýzy probíhající na pracovní elektrodě ke kvantitativní přeměně analytu přítomného v elektrochemické cele ̶ elektrogravimetrie – analyt je stanoven z hmotnosti látky vyloučené na pracovní elektrodě ̶ coulometrie - analyt je stanoven z velikosti náboje prošlého elektrodou ̶ společné vlastnosti metod: ̶ kvantitativní přeměna analytu ̶ a) vyčerpávající elektrolýzou (oxidace či redukce) ̶ b) chemickou reakcí s látkou vznikající elektrolyticky na elektrodě Faradayův zákon m = M Q / n F ̶ pracovní elektrody – velkoplošné, Pt síťka či plech, rtuťová "louže„ ̶ pomocné elektrody – Pt, C (oddělené od pracovního prostoru cely) ̶ základním transportním mechanismem analytu k elektrodě – konvekce ̶ metody lze považovat za absolutní, nevyžadují kalibraci ̶ při coulometrii musí elektrolýza probíhat se 100% proudovou účinností Elektrogravimetrie Coulometrie Instrumentální metody analytické chemie Elektrochemické metody – voltametrie, potenciometrie, konduktometrie, polarografie Voltametrie ̶ měřena závislost protékajícího elektrického proudu na vloženém potenciálu ̶ elektrochemický článek – tzv. voltametrická cela – obsahuje pracovní elektrodu (tvořena z tuhých materiálů) a referentní elektrodu (nejčastěji argentchloridová, kalomelová či merkurosulfátová) ̶ transport elektroaktivní látky je k povrchu elektrody zprostředkován třemi ději: ̶ migrace ̶ konvekce ̶ difuze ̶ pozn. amperometrie/amperometrická titrace Potenciometrie ̶ používaná ke stanovení koncentrace látek z napětí elektrochemického (galvanického) článku, který je tvořen pracovní elektrodou ponořenou do analyzovaného vzorku a referentní elektrodou, která je spojena s analyzovaným vzorkem solným můstkem ̶ Bez protékajícího proudu! ̶ přímá potenciometrie – měření pH roztoků ̶ nepřímá potenciometrie – potenciometrické titrace Potenciometrie Konduktometrie ̶ jedna z nejstarších elektroanalytických metod ̶ není selektivní a není založena na redoxní reakci ̶ měření vodivosti roztoků (migrace iontů v roztoku) ̶ konduktometr ̶ konduktometrická cela Polarografie ̶ roku 1922 objevil český akademik Jaroslav Heyrovský ̶ v roce 1924 sestrojil se svým japonským žákem M. Shikatou polarograf = přístroj, který automaticky zaznamenává křivky závislosti proudu na napětí při elektrolýze roztoku vzorku ̶ v roce 1959, jakožto první Čech, obdržel Nobelovu cenu za chemii ̶ sleduje závislost procházejícího elektrického proudu na potenciálu ̶ využívána rtuťová kapková elektroda jako pracovní elektroda ̶ výhody: pravidelné odkapávání čisté rtuti, která vytváří v roztoku nový povrch, který není téměř ovlivněn předchozí polarizací, elektroda nepodléhá jevům pasivace a otrav a lze ji pro své nepatrné rozměry používat i ve velmi malých objemech Heyrovského polarograf Polarografie ̶ podle průběhu nárůstu napětí vkládaného na elektrody a na způsobu odečítání elektrického proudu protékajícího mezi nimi existuje řada druhů provedení polarografické analýzy: ̶ stejnosměrná (normální) polarografie – narůstá vložené napětí na pracovní elektrodě lineárně v čase (projevuje se i kapacitní proud, který je spojen se vznikem el. dvojvrstvy – nejvyšší na počátku růstu kapky) ̶ vzorkované polarografie – zaznamenání velikosti protékajícího proudu těsně před ukápnutím kapky Polarografie ̶ normální a diferenční pulzní polarografie ̶ normální pulzní polarografie – na elektrodu pokaždé těsně před odkápnutím kapky rtuti vložen napěťový puls a hodnota proudu je odečítána před koncem pulsu ̶ na každou kapku je vložen jeden puls ̶ velikost pulsů se během měření navyšuje ̶ diferenční pulzní polarografie –na elektrodu se vkládá lineárně vzrůstající napětí s vloženými pravoúhlými pulsy ̶ pulsy opět vkládány těsně před odkápnutím kapky, proud vkládán těsně před koncem pulsu a těsně před vložením pulsu a následně je odečten Použitá literatura ̶ Crouch S., Skoog D., Holler F., West M., Fundamentals of Analytical Chemistry. United States, 2013. 1072 s. ̶ Záruba K. a kolektiv., Analytická chemie (1.díl). VŠCHT Praha, 2016. 224 s. ̶ Holzbecher, Z. a Churáček J., Analytická chemie. 1. vyd. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1987. 663 s. ̶ Zýka J., Analytická příručka. 4. upr. vyd. Praha: SNTL, Nakladatelství technické literatury, 1988. 831 s. ̶ Klouda, P., Moderní analytické metody. 2. upr. a dopl. vyd. Ostrava 2003. 132 s. ̶ Okáč A., Analytická chemie kvalitativní, Academia, Praha 1966. ̶ Dostál V., Šimek J., Důkaz některých anorganických iontů vybranými analytickými reakcemi, Skripta UP Olomouc, 2. upr. a dopl. vyd. Olomouc 2000. 76 s. ̶ Jančářová I., Jančář L., Analytická chemie. MZLU Brno, 2003, 195s.