6
7
větší než u nekuřáků. Díive se ho používalo také jako insekticidu, k čemuž se v současnosti vrací (produkce biopotravin apod.).
Chemikálie a činidla: nasycená vápenná voda, roztok jodu v jodidu draselném (Lugolův roztok), kyselina pikrová - nasycený roztok, 20% vodný roztok hydroxidu sodného, led.
Pomůcky a materiál: cigaretový nebo jiný tabák, Erlenmeyerova baňka (250 ml), pryžové zátky, zahnutá skleněná trubička, stojan na zkumavky, zkumavky, kovový stojan, varný kruh, železná sítka s azbestovou vložkou, zápalky, plynový kahan, varná baňka (150 ml), Claisenův nástavec, chladič, alonž, předloha (150 ml), kádinka (150 ml), hadice k chladiči, nůžky, třecí miska s tloučkem. Pracovní postup A: Do Erlenmeyerovy baňky objemu asi 250 ml nasypte 3-5 g co nejlépe rozmělněného cigaretového nebo lulkového tabáku, přidejte potom 20 ml nasycené vápenné vody a směsi 5 minut míchejte, aby se tabák dostal do maximálního kontaktu s vápennou vodou. Potom baňku uzátkujte pryžovou zátkou s otvorem, kterým prochází zahnutá skleněná trubička vedoucí do zkumavky ponořené do kádinky s ledovou vodou Po sestavení této aparatury zahřívejte baňku s tabákem a vápennou vodou tak dlouho, až najímáte asi 10 ml destilátu, který obsahuje nikotin. Po skončeni práce:
a) si všimněte barvy destilátu, jeho celkového vzhledu a zápachu,
b) odeberte asi 1 ml destilátu do čisté zkumavky a přidejte 2-3 kapky Lugolova roztoku. Vznikne čer-venohnědá sraženina, která se postupně rozpouští,
c) odeberte opět asi 1 ml destilátu do další zkumavky a přidejte asi 3-4 kapky nasyceného roztoku kyseliny pikrové. Vznikne jasně žiutá sraženina pikrátu nikotinu, která se v přebytku nikotinu rozpustí. Pozorováni zaznamenejte a vysvětlete
Pracovní postup B: Sestavte klasickou destilační' aparaturu. Do varné baňky o objemu 150 ml vložte 3-5 g jemně rozmělněného tabáku a 25 ml 20% vodného roztoku hydroxidu sodného. Baňku s tabákem a hydroxidem sodným zvolna zahřívejte tak, aby se tabák nepřipálil na stěny baňky. Oddestilujte asi 10 ml destilátu, který je vodným roztokem nikotinu, s nímž proveďte stejné reakce jako ad A. Poznámka: pro reakce roztok nikotinu nepipetujte, ale použijte malého odměrného válce nebo odměr-né zkumavky. Lze také použit injekční stříkačky.
3. IZOLACE TRIMYRISTINU Z MUŠKÁTOVÉHO ORISKU
Ester kyseliny myristové sglycerolem, trimyristin, je hlavni složkou tuků obsažených v muškátovém oříšku (Myristica fragrans). Zmýdelněním trimyristinu ethanolickým roztokem hydroxidu draselného lze získat kyselinu myristovou. Pozor matečné louhy po krystalizaci trimyristinu obsahují jedovatý myristicin. Při požití nadměrného množství nebo vodného výluhu muškátového oříšku se projevují halucinogenní účinky formou riskantního chováni (např. skákáni z okna).
H2C-OCOC13H27     KOH/EtOH    H^~°H ,0_/V/ HC-OCOCi3H27 ___HC-OH   + 3C13H27COOH
H2C-OCOC13H27 Irimy listin
zmýdelněni
H2C-OH glycerol
myristo\á kyselina
Chemikálie a činidla: ethanol, aceton
Pomůcky a materiál: muškátový oříšek, 2 varné baňky 100 ml, porcelánová třecí miska s tloučkem, ponorný vařič, chladič, hrnec, vata, mixér, odsávačka, nálevka s filtrační jehlou, kádinka 100 a 25 ml, filtrační nálevka, rotační vakuová odparka.
Pracovní postup: 4 g rozdrceného muškátového oříšku a 20 ml ethanolu refluxujte v baňce o objemu 100 ml na vodní lázni po dobu 60 min. Roztok zfiltrujte přes vatu do destilační baňky, ethanol oddestilujte. Polotuhý zbytek rozpusťte v asi 5 ml horkého acetonu. Ochlazený trimyristin odsajte a adjustujte. Stanovte výtěžek a teplotu tání (tab. 54-55 °C).
4. DŮKAZ PŘÍTOMNOSTI SOLANINU V HLÍZÁCH BRAMBORU
Solanin patři mezi alkaloidy steroidní povahy. Z čeledi lilkovitých (Solanaceae) je solanin z brambor, tomatin z rajských jablíček. Do stejné skupiny látek patří také různé akoni-tiny obsažené v různých druzích oměje (Aconi-lum), které jsou prudce jedovaté. cukerná složka-0
Chemikálie a činidla: koncentrovaná kyselina sírová, koncentrovaná kyselina octová, 1% vodný roztok formaldehydu, 0,5% roztok peroxidu vodíku.
Pomůcky a materiál: bramborové hlízy (zelené, nezelené, s očky, bez oček a s klíčky), Petriho miska, 4 krátké kapiláry nebo mikropipety, nerezový nůž, pinzeta, filtrační papír, podložní sklíčko, mikroskop. Pracovní postup: Z bramborové hlízy zelené i nezelené se slupkou nakrájejte dvakrát čtyři co nejtenčí řezy a položte je do řady za sebou na dno Petriho misky nebo pro případ, že budete reakce sledovat mikroskopicky na podložní mikroskopické sklíčko. Potom na jednotlivé řezy postupně kápněte na první řez 1-3 kapky koncentrované kyseliny sírové, na druhý kapku koncentrované kyseliny octové, na další kapku vodného roztoku formaldehydu a na poslední kapku 0,5% vodného roztoku peroxidu vodíku. Přítomnost solanínu se projeví po chvilce vznikem trvalého načervenalého až třešňově červeného zbarvení. Uveďte, kterou reakci vzniklo jaké zbarvení a jeho intenzitu.
5. LISTOVÁ BARVIVA
V listech zelených rostlin se vyskytuje větší počet lipofilních barviv, jejichž charakteristickou vlastností je rozpustnost v tucích a tukových rozpouštědlech. Pro fotosyntézu maji rozhodující význam chlorofyly a a b a karotenoidy (některé uvedeny v následující úloze).
Chlorofyly patří mezi tzv. isoprenoidni lipidy neboli prenyllipidy, můžeme je také pokládat za tzv. pyrroiová barviva čili porfyriny.
C2oH3gO
8
9
V molekule chlorofylu je atom dvojmocného hořčíku komplexován mezi čtyři dusíkové atomy porfyrinu. Kromě čtyř pyrrolových jader obsahuje ještě jedno cyklopentanové. Chlorofyl a se liší od chlorofylu b derivatizací jedné methylové skupiny formylem, je tudíž oxidačním produktem chlorofylu a. Chlorofyl je opticky aktivní. V roce 1960 nazávisle na sobě syntetizovali chlorofyl a Woodward a Streli podle struktury navržené H. Fisherem v roce 1940.
Listová barviva jsou značně citlivá vůči vzdušnému kyslíku a na světlo. Rozkladnými produkty chlorofylu jsou feofytiny; karoteny přecházejí přes epoxidy na bezbarvé sloučeniny. Feofytiny (a, b) se v přírodě nevyskytují. Narozdíl od chlorofylů neobsahují horečnaté kationty a pokládají se tudiž za artefakty, vznikající při extrakci. Lutein (3,3'-dihydroxy-a-karoten) je izomeml s zeaxanthinem (vzorec v následující úloze), violaxanthin je jeho derivátem (5,6,5',6'-diepoxyzeaxanthin) a neoxanthin má souhrnný vzorec CmHsbCv
Rychlého rozdělení listových barviv lze dosáhnout chromatografií na vrstvě silikagelu, Silufolu. Po rozděleni extraktu lze jednotlivé složky eluovat organickými rozpouštědly a fotometrický stanovit. Na obrázku je nákres chromatogramu s přiřazením jednotlivých složek barviv.
feofytin (šedozelený) chlorofyl a chlorofyl b
Chemikálie a činidla: uhličitan vápenatý práškový, bezvodý síran sodný, aceton, petrolether, isopropanol, voda.
Pomůcky a materiál: 5 g čerstvého zeleného rostlinného materiálu (listy musí být suché), uhličitan porcelánová třecí miska s pistilem, 2 destilační baňky (250 ml), Soxhletúv extraktor, lžíce na chemikálie,
2 dělené pipety 5 ml, odměrný válec 10 ml, extrakčni patrona nůžky, hadřík, varné kamínky, topné hnízdo na objem 250 ml, filtrační papír, stojan, filtrační kruh, filtrační nálevka, destilační baňka (250 ml), rotační vakuová odparka, chromatografické desky Silufol, skleněné kapiláry (silnějšího průměru) vytažené z tenkostenné trubice z lehkotavitelného skla, elučnl nádoba s krycí skleněnou deskou, kádinky 150, 50 a 25 ml, sada zkumavek, spektrofotometr.
5.1. Extrakce barviv
Pracovni postup: Pečlivě (na co nejmenší kousky) nastříhejte 5 g (přesnou hmotnost zaznamenejte) čerstvého zeleného rostlinného materiálu (listy předem otřete), přidejte 1 g práškovitého uhličitanu vápenatého a jemně rozetřenou hmotu přeneste do extrakčni patrony a umístěte do Soxhletova extraktom. Do destilační baňky o obsahu 250 ml nalijte 150 ml acetonu přidejte varné kamínky, nasacíte pod Soxhletúv extraktor a extrahujte (asi 1 hod.). Acetonový extrakt ochlacfte, potom pečlivě vysušte bezvodým síranem sodným, sušidlo odfiltrujte a filtrát zahustěte na rotační vakuové odparce na cca poloviční objem. Vysvětlete princip extrakce a jak lze poznat, že extrakce je již skončená.
5.2. Chromatografie barviv
Pracovni postup: Extrakt potom naneste na silufolovou desku (3x7 cm) a to několikrát (cca 5krát) vždy po předchozím odpaření rozpouštědla. Chromatogram eluujte ve směsi petrolether, isopropanol, voda v poměru 100:10:0,25. Při dobrém rozděleni je na chromatogramu vidět sedm barevných skvrn, odpovídajících jednotlivým barvivům. Jednotlivým skvrnám přiřaďte příslušné barvivo (podle nákresu chromatogramu v úvodu úkolu 5) a vypočtěte RF. Pozor, některé skvrny na světle rychle blednou, proto skvrny opatrně obtáhněte obyčejnou tužkou. Chromatogram zakreslete do protokolu s příslušnými hodnotami RF.
5.3. Fotometrické stanovení chlorofylů
Oba chlorofyly se poněkud liší svými absorpčními spektry. Empiricky bylo zjištěno, že změří-me-li absorbanci acetonového roztoku, který obsahuje oba chlorofyly (a neobsahuje jiné zelené sloučeniny), při dvou vhodně zvolených vlnových délkách, můžeme vypočítat koncentrace obou látek. Pozor, je ovšem třeba extrahovat jen kvantitativně (viz úloha 5.1.) a pracovat pečlivě.
Pracovní postup: Odměřené množství surového extraktu vhodně zřeďte acetonem a v 1 cm kyvetě změřte absorbanci při 663 nm a 645 nm. Koncentraci v mg ľ' rozpouštědla pro chlorofyl a (cj a chlorofyl b (Cb) vypočtěte podle vztahů: ^ = 12,70.^63-2,69.^5 Cb = 22,90 . AM5-4,68 . A633 Celková koncentrace obou barviv je dána vztahem: c, + c„ = 8,02 . A663- 20,20 . A„5
Nalezená množství obou chlorofylů a a b vyjádřete v mg/g čerstvé hmotnosti biologického materiálu, resp v procentech.
6. CHROMATOGRAFIE KAROTENOIDŮ NA TENKÉ VRSTVĚ
Karotenoidy jsou rostlinná barviva rozpustná v tucích a chemicky patři do skupiny přirozených isoprenoidů. Je jimi způsobena barva mrkve (karoteny), rajských jablíček (lykopen), šipku nebo třeba paprik. Vyskytují se však i v zelených částech rostlin.
Extrakt z papriky obsahuje vedle karotenu volné a estericky vázané xanthofyly (to jsou hydro-xyderiváty karotenu). Charakteristické jsou zejména oranžově-červená barviva kapsanthin a kapsobu-rin, která se eluuji teprve polárnějšími rozpouštědly.
Chemikálie a činidla: lékařský benzin, směs benzín-benzen 4:1 a směs benzin-benzen 1:1, voda. Pomůcky a materiál: suchá červená paprika nejlépe feferónka, porcelánová třecí miska s tloučkem, skleněné kapiláry (silnějšího průměru) vytažené z tenkostenné trubice z lehkotavitelného skla, ruční odstředivka se dvěma zkumavkami, porcelánová miska, chromatografická vana s kryci skleněnou deskou, preparační jehla, hodinky s sekundovou ručičkou, chromatografické desky Silufol, ponorný vařič, kádinka o objemu 250 ml, nůžky, žiletka.