Brno, 4. 11. 2020 PŘEDMĚT: TOXIKOLOGIE TESTOVÁNÍ TOXICITY Proč testovat toxicitu? Text Hodnocení toxických účinků: •predikční toxikologie •experimentální toxikologie •107 chemických sloučenin (ročně několik stovek přibývá) •u nových derivátů nejasný toxický účinek •nutné před použitím v průmyslu získat •časově i finančně náročný postup, dlouhodobý přínos je nedocenitelný •Zisk informací –z chemických provozů (pracovní lékařství, klinická toxikologie) –při chemických nehodách –katastrofách –epidemiích – C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 2 Bojové chemické látky Text ØJde o novou látku? Ø ØJaká toxikologická data jsou o ní k dispozici? Ø ØPůjde o jednorázovou, opakovanou nebo dlouhodobou expozici? Ø ØJakým dávkám mohou být lidé exponováni? Ø ØDojde k vypouštění do životního prostředí? Ø ØBude se látka přidávat do lidské potravy? Ø ØJe pravděpodobná exposice dětí a těhotných žen? 1. C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 3 Druhy testů Text Dle provedení: ØIn vivo (v živém prostředí) ØIn vitro (v lab. podmínkách) ØIn silico (počítačová simulace) v C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 4 Následné studie: §klinické studie §epidemiologické studie §biologické expoziční testy Testy dle druhu účinku: qkarcinogenity qmutagenity qteratogenity qreprodukční toxicity Dle délky expozice: vakutní toxicita vsubakutní toxicita vchronická toxicita In vivo Text Øtesty na zvířatech Ømezidruhové rozdíly velké, problematicky interpretovatelné Nejčastější pokusná laboratorní zvířata : •potkan •myš •králík (oční testy, dermální testy) •morče (alergizace) •křeček (karcinogenita) •prase – speciální malý typ (metabolicky nejblíž člověku) •pes, kočka, opice (v menší míře) C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 5 In vivo Text Identické podmínky: •jedinci stejného stáří •zastoupení pohlaví 1:1 •kontrolní skupina •stejné životní podmínky Kontroly a řízení pokusů (QA/QC Quality Assesment/Quality control) Správné laboratorní praxe (GLP – Good Laboratory Practise). C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 6 Druhy testů Text Nejčastější toxické indexy toxicity: •LD50 a LD100 (LC50 a LC100) –vyjadřují letální dávku (LD – lethal dose) nebo koncentraci (LC – lethal concentration), při níž zahyne 50 nebo 100 % jedinců v testovaném souboru •NOEL (no observed effect level) – koncentrace, při níž nejsou pozorovatelné žádné účinky látky (práh) •NOAEL (no observed adverse effect level) - nejvyšší úroveň expozice, při které není pozorována žádná nepříznivá odpověď na statisticky významné úrovni ve srovnání s kontrolní skupinou, jsou porovnávány účinky, které nejsou považovány za nežádoucí ani za prekurzory nežádoucích účinků •LOEL (lowest observed effect level) - nejnižší úroveň expozice, při které je ještě pozorována statisticky významná odpověď na statisticky významné úrovni ve srovnání s kontrolní skupinou •LOAEL (lowest observed adverse effect level) - nejnižší úroveň expozice, při které je ještě pozorována nepříznivá odpověď na statisticky významné úrovni ve srovnání s kontrolní skupinou C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 7 In vivo Text Testy akutní toxicity •účinky v krátkém čase (pozorování 14 dnů) •po jednorázovém podání •skupiny 6 – 10 jedinců + kontrolní skupina •výsledný index toxicity MUSÍ obsahovat údaj o způsobu podání, délce expozice, testovaném jedinců •mortalita LD50 nebo LC50 a závislost účinku na dávce •úvodní studie pro další toxikologické testy • C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 8 In vivo Text Akutní orální toxicita •2 druhy zvířat (hlodavec, nehlodavec), obojí pohlaví •skupina zvířat (nejméně 5, optimálně 10) •sledují se po dobu 14 dnů od jednorázové aplikace (tělesná hmotnost) •aplikace 3–6 rostoucích dávek (mg/kg) 3–6 skupinám zvířat •uhynulá i zvířata která přežila jsou na konci testu pitvána (histologické vyšetření orgánů a tkání) Akutní dermální toxicita •škodlivý účinek projevující se při krátkodobé dermální aplikaci (mg/kg) •experimentální zvířata – králík, morče, potkan Akutní inhalační toxicita •aplikace plynných látek nepřerušeně po krátkou časovou periodu inhalační cestou •LC50 se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené látky na standardní objem vzduchu (mg/l nebo ppm) C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 9 In vivo Text Akutní dermální dráždivost (poleptání) •při vzniku reverzibilních zánětlivých změn na pokožce •králík, morče (zdraví, obě pohlaví) •na depilovanou pokožku (plocha 2,5 x 2,5 cm, doba cca 4 hodiny) •hodnocení vizuální 0,5; 1; 4; 24 hodin po skončení expozice •hodnotí se edém (otok) a erytém (zarudnutí) Akutní podráždění oka •změna reverzibilní (akutní poleptání – ireverzibilní) •albinotický králík •aplikace 0,1 ml do spojivkového vaku do jednoho oka (druhé kontrola) •vyhodnocení po 24 hodinách •hodnotí se změny: poškození rohovky, reakce duhovky na světlo, zánět, otok a zčervenání spojivky, slzivost C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 10 In vivo Text Testy subakutní toxicity •délka testu 28 – 90 dní •přísně homogenní testovaná + kontrolní skupina (stejný věk, pohlaví, hmotnost) •každodenní jednorázová expozice dané látce •v průběhu testu pozorování biochemických reakcí (rozbor moči) •po skončení testu usmrcení a hodnocení toxicity na jednotlivé orgány •důležité pro stanovování NOAEL a LOAEL a pro plánování chronických testů •podání látky po dobu kratší než 10 % délky života • Øsubakutní orální toxicita Øsubakutní dermální toxicita Øsubakutní inhalační toxicita • C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 11 In vivo Text Testy chronické toxicity •dlouhodobý test opakovaných expozic, u potkana 2 roky životnost •zkoumají se biochemické parametry a příčina smrti •důležité pro stanovení NOAEL a LOAEL a popis dlouhodobého účinku • •sledování pozdních účinků (karcinogenních) •sledování patologických změn (úbytek hmotnosti, biochemické parametry) •kontrolní skupina (neexponovaná sledované látce) musí být stejně početná a držena za stejných podmínek •po skončení experimentu – utracení zvířat, pitva • • • C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 12 In vitro Text Testy chronické toxicity výsledky mají sloužit pro základní toxikologický výzkum •studium biochemických procesů •mechanismus účinku •molekulárně genetické experimenty. Testovaní organismy a části: •jednoduché organismy – bičíkovci, prvoci, bakterie, sinice, červi •buněčné preparáty – bílé krvinky, jaterní buňky, nádorové buňky Ørutinní testy akutní toxicity na nitěnkách Tubifex tubifex Øtesty mutagenity na bakteriích Salmonella typhimurium – Amesův test C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 13 In vitro – Amesův test Text C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 14 uměle vyvolaná mutace části histidinového operonu – neschopnost bakterií syntetizovat histidin – na půdě bez histidinu nerostou (esenciální pro jejich růst) je–li testovaná látka mutagenem, dojde v buňce k reverzní mutaci, tj. k návratu schopnosti histidin tvořit – růst i na živném médiu bez histidinu posouzení mutagenity látky – srovnání počty kolonií na kontrolních miskách a miskách obsahujících navíc toxikant In silico Text Predikční metody Øpředpověď velikosti účinku látek na základě zvolených parametrů struktury Vztahy mezi strukturou a biologickou aktivitou •kvalitativní (mutagenita, karcinogenita atd.) •kvantitativní QSAR (quantitative struture-activity relationship) •popis vztahu mezi strukturou a biologickou aktivitou •v sériích strukturně podobných látek •i prostorové interakce s receptory •bývají někdy nespolehlivé C:\Users\Jakub Rak\Desktop\PPT_Vicar\Bez názvu.jpg 15 Děkuji za pozornost prof. Ing. Dušan Vičar, CSc. Katedra fyziky, chemie a odborného vzdělávání