Úloha č.6: Stanovení pK
a
fenytoinu
Úkol: 1.Stanovit pK
a
5,5-difenylhydantoinu s využitím spektrofotometrie v UV oblasti
2.Kolik procent fenytoinu bude v ionizované formě a) v žaludku při pH=1
b) v tenkém střevě při pH=5,5
c) v krevní plazmě při pH=7,4 ?
Princip metody
Pro disociaci slabých kyselin, mezi něž se řadí i klasické antiepileptikum fenytoin, platí
Hendersonova-Hasselbachova rovnice, kterou lze psát ve tvaru
pKa
= pH + log ([HA]/[A])
, [1]
kde [HA] je rovnovážná koncentrace nedisociované formy kyseliny a [A]
rovnovážná koncentrace
její disociované formy.
Spektrofotometrické stanovení disociační konstanty vyžaduje výrazné změny absorpčního
spektra v závislosti na pH. Jako optimální vlnovou délku pro toto stanovení volíme takovou, při níž
je největší rozdíl absorbancí spektra změřeného v silně kyselém a silně bazickém roztoku, t.j. mezi
plně disociovanou a plně nedisociovanou formou sloučeniny. Změříme tady absorbanci látky v plně
disociované formě (v naší úloze v roztoku NaOH o koncentraci 0,01 mol.l-1
) a ve formě, kde je
disociace zcela potlačena (v našem případě v roztoku HCl o koncentraci 0,01 mol.l-1
). Pro
absorbanci látky platí Lambert-Beerův zákon
A = e.c.l , [2]
kde A je absorbance, e je molární absorpční koeficient, c koncentrace látky a l délka vrstvy, kterou
záření prochází, t.j. v praxi šířka kyvety. Pro absorbanci fenytoinu v plně disociované formě, t.j. v
roztoku silné baze lze psát
1
NH
NH
O
O
+ B
-
N
-
NH
O
O
+ BH
Mr = 252,27
AA=
eA.
[A].
l = eA.
cF
. l , [3]
kde cF
je celková koncentrace fenytoinu, protože veškerá látka je za těchto podmínek disociována,
tzn. [A]
= cF
. Pro absorbanci fenytoinu v plně nedisociované formě platí obdobně
AHA
= eHA
. [HA] . l = eHA
. cF
. l , [4]
protože veškerá látka je v nedisociované formě, tzn. [HA] = cF
.
Změříme dále absorbance sady roztoků fenytoinu s pH odstupňovaným tak, aby v
nejkyselejším z nich byla látka prakticky úplně ve formě HA a v nejbazičtějším téměř zcela ve
formě A.
Pokud jsme schopni hodnotu pKa
nějak odhadnout, např. na základě analogií nebo
výpočtem pomocí vhodného programu pro predikci disociačních konstant, měla by hodnota pH
číselně odpovídající odhadu pKa
ležet přibližně ve středu intervalu pH měřených roztoků. Pro
absorbanci každého takového roztoku platí
A = eA.
[A]
. l + eHA
. [HA] . l [5]
Řešením rovnic [2]-[5] dostaneme pro poměr rovnovážných koncentrací v měřených
roztocích [HA] / [A-
]
[HA] / [A]
= (AA
- A) / (A - AHA
) [6]
Dosazením vztahu [6] do rovnice [1] dostaneme pro hledané pKa
vztah
pKa
= pH - log {(AA
- A) / (A - AHA
)}[7]]
Postup
1.Příprava roztoků
Ze zásobních roztoků TRIS pufru o pH 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8 a 9,0 a koncentraci 0,2 mol.l
-1
připravíme ředěním destilovanou vodou sadu odpovídajích roztoků o koncentraci 0,01 mol.l
-1
a
objemu 100 ml. Ze zásobních roztoků připravíme rovněž roztoky hydroxidu sodného a kyseliny
chlorovodíkové o koncentraci 0,01 mol.l
-1
také v objemu 100 ml. Dále připravíme roztok
fenytoinu v ethanolu o koncentraci 0,01 mol.l
-1
takto: na analytických vahách odvážíme množství
fenytoinu potřebné k přípravě 100 ml roztoku, v kádince mícháním tyčinkou rozpustíme asi v 80 ml
ethanolu, přeneseme kvantitativně do odměrné baňky a doplníme ethanolem do 100,00 ml.
Zůstane-li část krystalů v 80 ml ethanolu nerozpuštěná, zfiltrujeme směs přes papírový filtr do
odměrmé baňky na 100 ml a filtr promyjeme malým objemem ethanolu rovněž do odměrné baňky,
objem doplníme do 100,00 ml. Z tohoto roztoku odpipetujeme 90,5 ml do 9 odměrných baněk na
2
50 ml, které doplníme do 50,00 ml roztokem hydroxidu sodného, kyseliny chlorovodíkové a TRIS
pufrů o pH 7,8 - 9,0 vždy o koncentraci 0,01 mol.l
-1
. Takto získáme sadu roztoků k měření.
Podobně odpipetujeme 90,5 ml ethanolu do odměrných baněk na 50 ml a doplníme výše
zmíněnými roztoky NaOH, HCl a pufrů do 50,00 ml, čímž získáme sadu porovnávacích roztoků
("blanks").
2a. Měření na jednoduchém UV-VIS spektrofotometru Jenway 6305
Zapneme spektrofotometr vypínačem vzadu a necháme proběhnout všechny testy. Zapneme
počítač, přihlásíme se do Windows a spustíme software 63-Zero. V záložce ConcentrationMethod
zadáme vlnovou délku 236 nm a potvrdíme Update Instrument. Do prostoru pro kyvetu
vložíme kyvetu naplněnou příslušným porovnávacím roztokem a v záložce Measure klikneme na
Cal to blank. Je-li v okénku Auto-read jakékoliv číslo, vymažeme ho. Pak vypláchneme kyvetu
malým množstvím roztoku vzorku a naplníme kyvetu tímto roztokem. Kliknutím na Read
změříme absorbanci. Dvojice porovnávací roztok-vzorek měříme zásadně v pořadí, jak
jednotlivá pH následují po sobě, vzestupně nebo sestupně, ale pořadí důsledně zachováváme, a
hodnoty absorbance ihned zapisujeme. Mezi měřeními po sobě jdoucích dvojic opakovaně
proplachujeme kyvetu malým objemem následujícího porovnávacího roztoku. Takto postupně
změříme všechny roztoky počínaje roztokem v kyselině, následují jednotlivá pH od nejnižšího
po nejvyšší, a končíme roztokem v hydroxidu (nebo opačně, ale důsledně). Bez dodržení pořadí
pH se jednak budete těžko orientovat v naměřených hodnotách, ale rovněž bude větší
chyba měření, způsobená změnou pH mícháním roztoků se zbytky předchozího. Naměřená
data lze vymazat pouze zavřením a novým otevřením 63-Zero.
2b.Měření na UV-VIS spektrofotometru Hewlett-Packard 8453
Po zapnutí spektrofotometru, počítače a monitoru se po nastartování Windows 3.11 objeví políčko,
požadující jméno operátora a heslo. Zrušíme je položkou Cancel. Poklepáním na ikonu Instrument
1 on line v okně HP UV-Visible ChemStation spustíme program, ovládající spektrofotometr.
Sledujeme hlášení v dolní části obrazovky. Svítí-li v pravém dolním rohu modré políčko s nápisem
busy, počkáme s další činností, až zmizí. V položce Instrument horní nabídky zvolíme Lamps a
přesvědčíme se, je-li zapnuta deuteriová výbojka, která je zdrojem ultrafialového záření (u
Deuterium lamp musí být vybráno ON). Wolframovou žárovku vypneme nebo necháme vypnutou
(Tungsten lamp OFF), k měření v UV oblasti ji nepotřebujeme. V položce Task zvolíme Fixed
wavelenghts a v nabídce Setup vepíšeme do tabulky jedinou vlnovou délku 236 nm. Kliknutím
zaškrtneme Prompt for sample information. Rozsah zobrazení spektra Display spectrum zvolíme od
220 do 320 nm. Volby potvrdíme tlačítkem OK.
3
Při vlastním měření vždy dvakrát vypláchneme kyvetu porovnávacím (slepým) roztokem,
naplníme tímto roztokem a umístíme do držáku přístroje (není nutné kyvetu zcela zasouvat, špatně
se pak vyndává) a přitáhneme páčkou po straně držáku. Kliknutím na tlačítko Blank změříme
spektrum slepého roztoku, které se objeví na obrazovce v okně nadepsaném Last blank spectrum.
Stejným způsobem změříme spektrum vzorku, jen klikneme na tlačítko Sample a do políčka Name
v okně Sample information, které se následně objeví, zapíšeme pH pufru a potvrdíme OK. Takto
změříme absorbance všech 9 roztoků proti jejich porovnávacím roztokům. Zvolením položky File a
následně Print report  Results vytiskneme naměřená spektra a tabulku absorbancí. Nezapomeňte
se zapsat do sešitu u přístroje.
3. Výpočet pK
a
Dosazením do vztahu [7] vypočteme hodnoty pKa
pro 7 pufrovaných roztoků a výslednou hodnotu
pKa
získáme jako jejich průměr.
Do protokolu uveďte:
 systematický název fenytoinu
 navážku fenytoinu
 veškerá ředění
 výpočet jednotlivých hodnot pKa
a výslednou hodnotu
 výpočet % ionizované formy a) b) c)
Přiložte vytištěný záznam měření, byl-li pořízen.
4