RTG difrakční metody a jejich
aplikace ve farmacii
Bohumil Kratochvíl
Farmaceutická fakulta VFU Brno
PXRD – Powder X-Ray Diffraction
SCXRD – Single Crystal X-Ray Diffraction
ssNMR – Solid State Nuclear Magnetic Resonance
DSC – Differential Scanning Calorimetry (HyperDSc, MicroDSC)
MTDSC – Modulated Temperature Differential Scanning Calorimetry
IR – mid-Infrared Spectroscopy
NIR – Near-Infrared Spectroscopy
TGA – Termogravimetric Analysis
DVS – Dynamic Vapour Sorption
FTIR – Fourier Transform Infrared
TPS – Terahertz Pulsed Spectroscopy
IMC – Isothermal Microcalorimetry
PLM – Polarised Light Microscopy
MS – Mass Spectroscopy
TSC – Thermally Stimulated Current
TEM, SEM, HRTEM – Transmission (Scaning, High Resolution) Electron Microscopy
AFM – Atomic Force Microscopy
STM - Scaning Tunelling Microscopy
RS – Raman Spectroscopy
IMC – Isothermal Microcalorimetry
DRIFTS – Diffuse Reflectance Infrared Transmission Spectroscopy
EXAFS – X-Ray Absorption Fine Structure
XANES - X-Ray Absorption Near Edge Structure
SAXS – Small Angle X-Ray Scattering
Pevnolátkové analytické metody používané ve farmacii
Rozdělení pevnolátkových analytických metod
metody analyzující molekuly: RTG difrakce,
IR, NIR a Ramanova spektr., pevnolátková NMR,
hmotnostní spektroskopie (MS)
metody analyzující krystalovou (amorfní)
strukturu: RTG difrakce (prášková,
monokrystalová) , teplotní metody (TGA, DSC,
mikroDSC, hyperDSC, kalorimetrie (SC, TSC,
IMC), pokročilé mikroskopie (TEM, SEM, AFM,
HRTEM, STM), terahertzová spektr., RTG
absorpční spektr. (EXAFS, XANES), maloúhlový
rozptyl (SAXS)
metody analyzující „bulk“ (povrch, velikost a
tvar částic, sypné a filtrační charakteristiky,
hygroskopicitu…): optická mikroskopie (v polarizov.
světle, teplotní), dynamická sorpce par (DVS), sítová
analýza, laserová difrakce, zeta potenciál, měření
adsorpčních izoterem, RTG difrakce
PXRD – Powder X-Ray Diffraction ( RTG prášková (fázová) analýza)
SCXRD – Single Crystal X-Ray Diffraction ( RTG monokrystalová (strukturní) analýza)
Přístrojové zázemí v ČR a SR pro metodiku RTG difrakce
RTG prášková (fázová) analýza:
• rutinní technika nejenom ve farmaceutických laboratořích –
RTG práškový difraktometr (v ČR a SR v provozu okolo 150 přístrojů)
• hlavní výrobci: Bruker, PanAnalytical, Rigaku (cena okolo 150 tis. EUR)
RTG monokrystalová (strukturní) analýza:
• náročná technika, v ČR a SR nemá žádná farmaceutická firma –
RTG monokrystalový difraktometr (v ČR a SR v provozu asi 10 přístrojů)
• hlavní výrobci: Bruker, Agilent (Oxford Diffraction), Rigaku (cena okolo
550 tis. EUR)
Typ měřeného materiálu
Monokrystalové metody Práškové (polykrystalické) metody
RTG difrakční metody používané ve farmaceutickém průmyslu
10-1 mm 10-2 mm
malé molekuly biomakromolekuly prášek
10-3 – 10-5 mm
kompaktní
těleso
Výstup
tenká vrstva
0,1 nm – 10 m
1 - 100 nm
strukturní analýza fázová analýza, ale i strukturní analýzastrukturní analýza
Farmaceutické materiály - chemické a fyzikální typy
pevných léčivých látek
Jedna farmaceutická molekula může tvořit více než 100 různých pevných substancí
pevná substance
(léčivá látka)
Farmaceutické materiály - pevné lékové formy
(tablety, tobolky, dražé, čípky)
Nejčastěji zkoumané jevy a procesy v pevných substancích a
v pevných lékových formách metodami RTG difrakce
• Monitorování fázového složení farmaceutických prášků, reprodukovatelnost šarží
• „Screening“ hydrátů a solvátů a procesů dehydratace a desolvatace
• Identifikace a stanovení polymorfů a studium polymorfních transformací
• Amorfní fáze a jejich transformace na krystalické fáze, stupeň krystalinity
• Farmaceutické soli, kokrystaly a jejich příprava
• Monitorování stability, degradačních procesů a strukturní charakterizace pevných
degradačních produktů
• Stanovení technologických parametrů prášků, segregační chování směsí
• Analýza homogenity (mikrostruktury) kompaktních lékových forem (tablety, tobolky)
• Farmaceutická dokumentace, expertní posouzení při patentových sporech
Krátký pohled do historie RTG difrakce
První RTG difraktogram krystalu
modré skalice
Friedrich W., Knipping P., Laue M.:
Ann.d. Physik 41, 971 (1913).
1912: Laue, Friedrich, Knipping –
objevili difraci RTG záření na
krystalických látkách
1912-22: W.L. Bragg & W.H. Bragg –
vyřešili struktury jednoduchých
anorganických a organických sloučenin:
Braggova rovnice
diamant, grafit, měď, chlorid sodný a
draselný, sfalerit,fluorit, pyrit,
vápenec, korund, spinel, led, naftalen
W. L. Bragg
n = 2d sin 
M. von Laue
Ethylendiammonium – tartrate (EDT), model struktury byl vystaven na
EXPO1958 v Bruselu (N-modrý, O-červený, C-černý)
První krystalová struktura byla vyřešena v létech 1951-1957
Dr. Allan Línek (fyzik)
Historie RTG strukturní analýzy v ČR
Krátká historie používání RTG difrakčních
metod ve farmacii a lékařství
~ 1950: Franklin, Crick, Watson
– RTG difraktogram DNA
(struktura dvojité šroubovice)
~ 1950: Farmaceutické společnosti začaly
využívat RTG práškovou metodu pro
kontrolu fázové čistoty výrobních šarží
Difraktogramy výrobních šarží jednoho produktu
– je prokázána reprodukovatelnost výroby
RTG záření
Vlnová délka RTG záření je srovnatelná se vzdálenostmi atomů
(rozptylujících center) ve struktuře krystalu – proto může
vzniknout pozorovatelný difrakční obraz, který analyzujeme
1 pm = 10-12 m = 0,001 nm, 1 Å = 10-10 m = 0,1 nm, 1 nm = 10-9 m
Zdroje RTG záření
RTG lampa
Laboratorní zdroj
─────────────────────────────────────────────────────────────────
Vlnové délky (pm)
Anoda Kα1
Kα2
Kα* Budící napětí(kV)
─────────────────────────────────────────────────────────────────
Cu 154,056 154,439 154,184 8,98
Mo 70,930 71,359 71,073 20,00
Co 178,897 179,285 179,026 7,71
Fe 193,600 193,998 193,736 7,11
Synchrotronové záření v oblasti RTG pro
difrakční experimenty (0,1 – 5 Å)
Srovnání kvality experimentální dat při difrakci z
laboratorního zdroje a ze synchrotronu
synchrotron
lab. zdroj
Synchrotron X-ray source ESRF Grenoble
RTG difrakční experiment a difrakční obrazce
(difraktogramy) – nikoliv atomy !
primární svazek
roviny (hkl)
rotace vzorku
2hkl
Difraktogramy
difrakční skvrna
(difrakce)
Ihkl
krystalové

Analyticky využitelné
veličiny:
Difrakční intenzita, Ihkl
Pozice difrakce, 2hkl
Různé podoby difraktogramů
monokrystal
prášek
Interpretace RTG difraktogramu – difrakce je reflexe
Destruktivní interference - reflexe
vyhasne, protože R1 a R2 jsou v
protifázi
Konstruktivní interference - reflexe
nevyhasne, protože R1 a R2 jsou ve fázi
n = 2d sin 
Energie primárního RTG svazku je krystalem rozptýlena
(reflektována) pouze do určitých směrů (zatímco v jiných vyhasne)
 = 2d sin 
řád reflexe n je zahrnut do d
RTG difrakční experiment „vidí“ (prostřednictvím
difrakčního obrazu) strukturu pevné fáze
Struktura: elektronová, molekulová, krystalová (amorfní),
mikrostruktura (kompaktní tělesa),
charakteristiky sypkého práškového „bulku“
Struktura vs. Vlastnosti
Každá pevná forma má jiné vlastnosti (funkční a
technologické parametry) a pouze změnou
struktury formy lze tyto vlastnosti měnit !
Vnitřní struktura – nejdůležitější fenomén
pevné fáze
Struktura (dimenzionální hierarchie):
▪ elektronová (< 10-10)
▪ molekulová (10-10 - 10-9 m)
▪ krystalová, amorfní (10-8- 10-6m)
▪ charakteristiky sypkého práškového „bulku“(10-5- 10-3 m)
▪ mikrostruktura kompaktního tělesa (10-5- 10-3 m)
Elektronová struktura:
Pásová teorie pevných látek - viz
přednáška: Chemie a fyzika pevných
látek, pro farmacii méně důležitá
Molekulová struktura: Viz dále, Pro farmacii důležitá!
Krystalová nebo
amorfní struktura:
Viz dále, pro farmacii
velmi důležité!
Mikrostruktura
kompaktních
lékových forem:
Pro farmacii důležitá –
homogenita lékových forem !
Charakteristiky
sypkého
práškového bulku
Viz přednáška: Inženýrství
farmaceutických výrob, pro farmacii
důležité!
Molekulová struktura
• Isomerie cis, trans
• Chiralita
thalidomid: S- isomer teratogen,
R-isomer sedativum
jako kancerostatikum účinkuje
pouze forma cis
RS
➢ kontrola správné chirality vstupních surovin
➢ kontrola zda při mnohastupňových organických syntézách nedochází k nečekané
změně chirality meziproduktu (finálního produktu)
➢ kontrola, zda při stereoselektivní syntéze nedochází k racemizaci meziproduktu
(produktu)
➢ lokalizace příp. změny chirality u molekul s více chirálními centry
Krystalické a amorfní fáze
Makroskopické vlastnosti API jsou určeny mírou vzájemné uspořádanosti
molekul (vnitřní strukturou API)
- Krystalické API mají vnitřní krystalickou
strukturu uspořádanou na dlouhou vzdálenost
(zhruba nad 100 Å, 1Å = 10-10 m)
- Amorfní API mají vnitřní strukturu
uspořádanou pouze na krátkou vzdálenost
(zhruba pod 100 Å)
Krystalická fáze Amorfní fáze
forma krystalická
LRO (long-range order)
forma semikrystalická forma amorfní
SRO (short-range order)
Semikrystalické API
RTG difraktogramy
Amorfní a semikrystalické API jsou fázemi nestabilními (výše energetickými) a proto
přechází na fáze krystalické (níže energetické)
S a m o v o l n ý p r o c e s
Amorfní, semikrystalické a krystalické fáze
atorvastatin vápenatý . 3H2O krystal,
forma I , firma Warner-Lambert (Pfizer)
atorvastatin vápenatý
semikrystal, forma V, firma Teva
atorvastatin vápenatý amorfát
RTG difraktogramy:
Semikrystalická fáze může tvořit mezistupeň při fázové transformaci :
Amorfát → Semikrystalická fáze → Krystal
Základní charakteristika a rozdíl mezi krystalickou a
amorfní fází
Krystalická fáze:
- ostrý bod tání, Tt
- parametry krystalové (vnitřní)
struktury:
- mřížkové parametry, délky hran
buňky a,b,c [Å] a jimi sevřené
úhly ,, [o] , mezirovinné
vzdálenosti dhkl,
- prostorová grupa symetrie
- pozice atomů x,y,z
Amorfní fáze:
- teplota skelného přechodu, Tg
- vnitřní (neuspořádaná) struktura
není charakterizována žádnými
parametry
Ideální krystal - elementy krystalové geometrie
V nultém přiblížení hovoříme o tzv. ideální krystalové struktuře neboli o ideálním
krystalu, který je dokonalý (neporušený) a nekonečně translačně periodický.
Krystalová struktura realita – el.mikroskopie Ideální krystal – molekulární grafika,
výstup z řešení RTG difrakčními metodami
=
Ideální krystalová struktura = prostorová mřížka + hmotná báze
•
hmotná báze
uzel
Ideální krystal - popis
Ideální krystal - popis
Elementární buňka (a,b,c,,,) Roviny (hkl) – „zrcadla“ – obsazeny atomy
(elektrony), mezirovinná vzdálenost dhkl
Geometrie krystalové struktury elementární
buňka
Rozměry buňky, délky hran a,b,c [Å] a jimi sevřené úhly ,, [o] , se
také nazývají mřížkové parametry. Počet molekul v buňce udává symbol
Z (zde Z=1). Objem V = 2abc.{sin s . sin(s - ) sin (s -) .
sin (s - )}1/2 , kde s = ( +  + )/2. V [Å3].
14 Bravaisových buněk přiřazených k
7 krystalografickým soustavám
1. Triklinická
2. Monoklinická
3. Orthorombická
4. Romboedrická
5. Hexagonální
6.Tetragonální
7. Kubická
Krystalografické soustavy
Bravaisovy buňky
Pozice atomů v elementární buňce
Pozici x,y,z udávají bezrozměrná čísla. Pozice atomu N v buňce:
x=0.5, y=0.75; translačně symetrické pozice dalších atomů N :
i = x+1,y-1; ii = x,y-3 atd.
Prostorová grupa – elementy krystalové symetrie
Prostorová grupa je soubor všech možných operací symetrie a jejich kombinací s
elementární buňkou (primitivní nebo centrovanou), které je možné nalézt v dané krystalové
struktuře. Vzhledem ke translační periodicitě krystalových struktur je počet možných
prostorových grup omezen na 230.
Symboly P.G.: P 1, P 21 /c, P 21 21 21 , Pmna ……..
Krystalová struktura sulfathiazolu (forma III) s vyznačením elementární buňky, šroubových os 21,
skluzné roviny b, a středů souměrnosti1 (prostorová grupa P21/b)
Kompletní popis symetrie
krystalové struktury udává její
prostorová grupa (space group).
V přírodě existuje pouze 230
prostorově-symetrických uspořádání
neboli 230 prostorových grup.
Zastoupení všech prostorových grup v
přírodě není rovnoměrné, ale jsou
upřednostňovány pouze některé
Analyticky využitelná data ve strukturní RTG difrakci:
1) intenzita difrakční stopy, Ihkl
Realističtější pohled na strukturu
(distribuce elektronové hustoty)
Strukturní model typu „ball
and sticks“
elektron atom el. buňka krystal
http://blogearth.wordpress.com/2
008/02/27/electron-filmed-for-
the-first-time/
IhklFhkl
Abstraktní rozklad RTG difrakčního experimentu –
jak vznikají difrakční intenzity
fj
atomový faktor strukturní faktor pozorovaná intenzita
Intenzita difrakce Ihkl souvisí přímo úměrně s „množstvím elektronů“ v rovině hkl
Difrakce od různých rovin (hkl) jsou vůči sobě a počátku různě
fázově posunuty, tzn., že ke každé intenzitě I
hklpřísluší hodnota fáze 
hkl
Experimentálně (RTG difrakcí) jsou měřitelné pouze
hodnoty I
hkl
Strukturní faktor Fhkl – „difrakční mohutnost
jedné elementární buňky“
Skládáme příspěvky všech j –
atomů v elementární buňce sčítání
vln (atomových amplitud
fj a jejich fází j)
j = 2 (hxj + kyj + lzj) - hodnota fáze je závislá na pozici atomu xjyjzj
Ihkl |Fhkl|2
~
zrcadlo &
monochromátor
rotující kapilára se vzorkem
“Debye-Scherrer”
transmisní
geometrie
RTG lampa
optika & monochromátor
“Bragg-Brentano”
reflexní geometrie
detektor
detektor
RTG lampa
2 hkl
2 hkl
vzorek
Analyticky využitelná data ve fázové RTG difrakci:
2) poloha difrakční skvrny, 2hkl
Souhrnná data Ihkl, 2hkl (10 – 106 dat)
Z poloh difrakcí (2hkl) lze vypočíst mřížkové parametry (a,b,c,,,);
Z intenzit difrakcí (Ihkl) lze určit pozice atomů v elementární buňce (x,y,z)
Z vyhasínání difrakcí (Ihkl = 0) lze určit prostorovu grupu krystalu
 = 2d hkl sin hkl
RTG strukturní analýza na monokrystalu rutinní
technika
Vstupní materiál - monokrystal
Výběr
▪ rozměr ~ 10-1 mm (výjimečně i menší)
• bez zjevných defektů (srostlice atd.)
• průhledný
• nestabilní materiál (kapilára nebo pokrytí inertní
vrstvou)
• elementární analýza !!!
Příprava
• vhodné rozpouštědlo resp. kombinace rozpouš.
• nejpomalejší dosažení mírně přesyceného
roztoku (pomalé chladnutí i desítky hod.)
• pomalá difúze „srážedla“ do roztoku
• nerušený růst
• trpělivost ( desítky pokusů…)
Experiment – RTG difrakce na monokrystalu
goniometrická
hlavička
Goniometr
záření (MoK, CuK)
monokrystalový
difraktometr
Měření:
• během řádově několika hodin se proměří téměř celý difrakční prostor
(–h → +h; –k → +k; –l → +l) a získá se několik tisíc až stovek tisíc
difrakcí (reflexí) – „measured reflections“ „independent reflections“
• pro potlačení teplotních vibrací atomů se měří za nízké teploty (150 K)
vstupní monokrystal
Postup řešení krystalové struktury
RTG difrakční
experiment
výpočet mapy elektronové
hustoty
zobrazení výsledku
molekulární grafikou



(xyz) = (1/V)    Fhkl exp [-2i (hx + ky + lz)]
Zpracování dat – RTG strukturní analýza
Vstupní soubor: dhkl (hkl), Ihkl
Fhkl = Fhklexp i hkl Fhkl2  Ihkl - fázový problém
Přímé metody - určení hodnot fází, hkl , ze statistických a
pravděpodobnostních výpočtů z Ihkl (Karle & Hauptmann, Nobelova
cena za chemii v r. 1985)
„Charge flipping“ – nová metoda z r.2004 využívající brutální síly
počítačů
Mapa elektronové hustoty
h k l
RTG strukturní analýza – výsledky
ORTEP
(Oak Ridge National Laboratory)
Příklad vyřešené krystalové struktury – sertralin . HCl (antidepresivum)
Chemická struktura Molekulová struktura
Krystalová struktura
Cell dimensions (Å) a = 8.004(5)
b = 8.372(5)
c = 25.21(2)
Cell volume (Å3) V = 1689.3(6)
Space group P 2
1
2
1
2
1
Crystal system Orthorombic
Molecules/unit cell, Z = 4
Density calculated (g/cm3)  = 1.354
Základní krystalografické parametry
Krystalizace v laboratoři
10-2 – 10-5 mm
Primárním produktem výroby léčivé látky je prášek
10-1 mm
RTG strukturní analýza nikoliv z monokrystalu, ale z prášku !
RTG difrakční
experiment
monokrystal
RTG difrakční
experiment
prášek
Řešení krystalové struktury z prášku
7-kruhový RTG difraktometr u
synchrotronového zdroje ESRF
v Grenoble
manipulace a získávání
dat z mikromonokrystalů
řešení struktury
z práškových dat
molekula má 14 DOF
~ 10-2 mm
Studium krystalové a molekulové struktury –
z práškových RTG difrakčních dat (nestandardní technika)
methylergometrin maleinát
N+
H
HN
H
CH3
CH
O
N
H
C
CH2CH3
CH2OH
H
COO-
COOH
RTG prášková data
struktura, DOF = 20
Struktura z prášku je méně přesná než z monokrystalu a navíc je řešení
omezeno hodnotou DOF (Degrees of Freedom) ≈ 30, ale primárním
produktem průmyslu je prášek
parametry DOF
Tiotropium bromide – (14 DOF)
anticholinergic bronchodilator
Matematická kritéria posouzení kvality struktury – R-faktory
spolehlivosti
• Rint = ∑ | Io – < Ic > | / ∑ Io
• R = ∑ |(|Fo| - |Fc|)| / ∑ |Fo|
• R1 = ∑ |(|Fo| - |Fc|)| / ∑ |Fo|, kde Fo > 2
σ(Fo)
• wR2 = { ∑ [w (Fo
2 - Fc
2)2] / ∑ [w (Fo
2)2] }1/2
o – observed (experimental) data; c – calculated data
Stanovili jsme krystalovou strukturu správně ??
Za spolehlivě určenou strukturu se dnes považuje hodnota R-faktoru do 0, 08 (8%)
Stanovili jsme krystalovou strukturu správně ??
Porovnání změřeného RTG práškového záznamu (obs) a
práškového záznamu vypočteného ze stanoveného
strukturního modelu (calc):
Řešení krystalové struktury z prášku má svá omezení a je méně přesné než z
monokrystalu - ale primárním produktem výroby je prášek !
Vyřešená struktura fluticasonu: vlevo z monokrystalu, vpravo z prášku
Srovnání struktury z monokrystalu a z prášku
Fluticason (léčba astmatu)
http://bioportal.weizmann.ac.il/iucr-top/cif/index.html
Crystallographic Information File
Standardní uložení výsledků RTG strukturní analýzy
data_TOZ _audit_creation_date 91-03-20 _chemical_name_systematic ;trans-3-Benzoyl-2-(tert-butyl)-4(iso-butyl)-1,3-oxazolidin-5-one
; _chemical_formula_sum 'C18 H25 N O3' _cell_length_a 5.959(1)
_cell_length_b 14.956(1) _cell_length_c 19.737(3) _cell_angle_alpha 90 _cell_angle_beta 90
_cell_angle_gamma 90 loop_ _reflns_scale_group_code _reflns_scale_meas_F 1 .960926 loop_
_symmetry_equiv_pos_as_xyz +x,+y,+z 1/2-x,-y,1/2+z 1/2+x,1/2-y,-z -x,1/2+y,1/2-z loop_
_atom_type_symbol _atom_type_number_in_cell _atom_type_scat_dispersion_real
_atom_type_scat_dispersion_imag C 72 .017 .009 H 100 0 0 O 12 .047 .032 N 4 .029 .018 loop_
_atom_site_label _atom_site_fract_x _atom_site_fract_y _atom_site_fract_z _atom_site_test_rubbish #
requested item not present _atom_site_thermal_displace_type _atom_site_U_iso_or_equiv O1 .4154(4)
.5699(1) .3026(1) ? Uani .060(1) C2 .5630(5) .5087(2) .3246(1) ? Uani .060(2) C3 .5350(5) .4920(2)
.3997(1) ? Uani .048(1) N4 .3570(3) .5558(1) .4167(1) ? Uani .039(1) C5 .3000(5) .6122(2) .3581(1) ? Uani
.045(1) O21 .6958(5) .4738(2) .2874(1) ? Uani .090(2) C31 .4869(6) .3929(2) .4143(2) ? Uani .059(2) C32
.2552(7) .3558(2) .3953(2) ? Uani .073(2) C321 .209(1) .3542(4) .3211(3) ? Uani .111(4) C322 .230(1)
.2626(3) .4264(3) ? Uani .149(5) C41 .2034(4) .5476(2) .4682(1) ? Uani .041(1) H321C .04(1) .318(3)
.320(2) ? Uiso .14000 H322A .25(1) .272(4) .475(3) ? Uiso .19000 H322B .34976 .22118 .40954 ? Uiso
.19000 H322C .08(1) .234(4) .397(3) ? Uiso .19000 H412 -.007(6) .447(2) .552(2) ? Uiso .08000 H513B
.115(7) .757(3) .426(2) ? Uiso .09000 H513C .329(6) .817(2) .430(2) ? Uiso .09000 loop_ _refln_index_h
_refln_index_k _refln_index_l _refln_F_meas _refln_F_sigma _refln_observed_status
_refln_scale_group_code
Příklad
Příklady využití RTG strukturní analýzy ve farmacii
RTG strukturní analýza malých molekul
(do 1 000 atomů v molekule)
RTG proteinová krystalografie (např.
ribosom obsahuje okolo 64 000 atomů)
biomakromolekuly - bioléčivamolekulární krystaly - léčiva
Proč řešíme struktury farmaceutických molekul a biomakromolekul :
- strukturní charakterizace farmakoforu (struktura vs. vlastnosti)
- strukturní charakterizace mechanismu účinku (návrh nových léků)
- strukturní identifikace pevné formy (polymorfu)
- mapování výskytu možných solventů (hydrátů)
- farmaceutická dokumentace
- důkazy v patentových soudních sporech
Stanovení absolutní a relativní chirality RTG difrakcí
Stanovení absolutní chirality je možné pouze u enantiomeru, protože krystaluje v
polární prostorové grupě (nemá střed symetrie ani jiné operace symetrie, které jej
zahrnují - 65 polárních PG z celkových 230 PG). U racemátu je možné určit pouze
relativní chiralitu (krystaluje v centrosymetrické PG).
„Normální” rozptyl: I(hkl) = I (hkl ), Friedelův zákon
atomový rozptylový faktor je reálné číslo
„Anomální” rozptyl: I(hkl)  I (hkl )
atomový rozptylový faktor je komplexní číslo
Důvod anomálního rozptylu: rezonanční frekvence (frekvence elektronu
v atomu rezonuje s frekvencí dopadajícího RTG svazku). Anomální
rozptyl závisí na velikosti atomu a použité vlnové délce dopadajícího
RTG svazku
Testy pro stanovení absolutní chirality:
Kritérium: x=0 správně, x=1 opačně
Zkrácená notace:Fh  Fhkl
Úspěšnost stanovení absolutní chirality:
Absolutní chiralita: předpokladem je těžký atom ve struktuře
Relativní chiralita: pouze lehké atomy (C,N,O,H)
Absolutní chiralita centra: je-li přítomen atom o známé
chiralitě, pak podle něho přiřadíme absolutní chiralitu
celému centru
Hamiltonův R-faktor test, Rogersův parametr ,
Flackův parametr x
Kontrola chirální čistoty molekul
➢ kontrola správné chirality vstupních surovin
➢ kontrola zda při mnohastupňových organických syntézách
nedochází k nečekané změně chirality meziproduktu
(finálního produktu)
➢ kontrola, zda při stereoselektivní syntéze nedochází k
racemizaci meziproduktu (produktu)
➢ lokalizace příp. změny chirality u molekul s více
chirálními centry
➢ určení absolutní konfigurace v případě kdy ji lze určit
jen velmi obtížně z NMR (např. z důvodu oddělení
spinových systémů heteroatomy)
Určení absolutní chirality z RTG difrakčních dat
Nečistota fluticasonu furoátu - dvě možnosti:
(O)-ester nebo(S)-ester thiokyseliny?
Intermediát syntézy steroidních léčiv
O
F
H
CH3
HO
CH3
H
H
CH3
O
H
O
F
S
O
H
F
O
O
F
H
CH3
HO
CH3
H
H
CH3
S
H
O
F
O
O
H
F
O
(O)-ester
Terricolin FeL3.2MeOH – nežádoucí pigmentová nečistota Cs A
HL = (1S,2R,4S,6R)-3-(2‘,4‘-dimethyl-6‘-vinylcyklohexyl)-1,4-dihydroxy-2(1H)-pyridon
stanovení absolutní chirality z RTG difrakčních dat
-cis R=0,057 x=0.97(4) -cis R=0,052 x=0.03(4)
správně
a = 20,27(3) Å (MoK) = 0,7107 Å
b = 19,35(4) Dc =1,141 g.cm-3
c = 13,43(4) PG P 21212
V = 5268(2) Å3 Z = 4
Krystalografická data terricolinu:
Imunosupresivum – cyklosporin A (Cs A)
Léčivý přípravek Equoral
Cyklosporin A a konformace jeho molekuly
Měkké želatinové tobolky
uzavírající průzračnou substanci
Identifikace krystalické fáze v tobolce Equoralu metodou
monokrystalové RTG difrakce
Dimethylisorbid (DMI) – uvažovaná
komponenta do mikroemulze
Změna konformace molekuly CsA.DMI proti CsA
Nežádoucí krystalická fáze v tobolce
Krystalický Cs A . DMI solvát
Rozložení kavit ve strukturách cyklosporinů a modelování
jejich možného zaplnění molekulami solventů
Vyplnění kavity molekulou
di-n-butyletheru
Kooperace práškové RTG difrakce a ss-NMR
NH2
F
F
F N
N
NN
F
F
F
O
32.8
49.3
40.5
173.2
123.0
159.1
104.2
148.0
144.8
118.5
163.7
43.5
49.6
34.8
163.7
115.1
(C16H15F6N5O)2 SO4
020406080100120140160180
PPM
Na spektru 13C ssNMR
je vidět pouze
jednu molekulu
sitagliptinu v
asymetrické části
el. buňky
sitagliptin, Januvia (Merck)
DOF = 30
řešeno ve spolupráci s J. Brusem
sitagliptin sulfát
(sitagliptin fosfát monohydrát)
Léčba cukrovky
Struktura sitagliptinu sulfátu monohydrátu
Indexace práškových dat vede k: a = 28,298; b = 6,033; c = 11,946 Å;
 = 97,36o ; grupa C2; Z = 2
Řešení struktury v grupě C2 snižuje DOF = 30 na DOF = 16 (pozice S je
fixovaná na 2 četné ose) – strukturu lze řešit i z dat rutinního
práškového difraktometru:
Pakování struktury zobrazené programem Mercury včetně systému
H-vazeb (analýzou kavit ve struktuře byla ještě lokalizována
přítomnost hydrátové vody)
(C16H15F6N5O)2 SO4 .H2O
Polymorfismus a polymorfy ve farmacii
Polymorfismus je schopnost API, ale i excipientů, tvořit různé pevné fáze (polymorfy),
které se liší krystal.strukturou. Mezi polymorfy jedné entity existují polymorfní
přechody. Polymorfy jedné entity se liší svými vlastnostmi (rozpouštěcí rychlostí,
stabilitou, sorpcí vlhkosti, technolog. parametry atd.)
sulfapyridin
pakovací polymorfismuspolymorf I polymorf II
polymorf  polymorf 
L – glutamová kyselina
konformační polymorfismus
Detekce polymorfního systému metodou RTG práškové
a monokrystalové difrakce
Me2N
O
S
H
N NHMe
NO2
HCl
Polymorf I Polymorf II
Ranitidin hydrochlorid (antiulcerosum)
Polymorfismus – molekuly jednoho druhu se mohou složit do více krystalových
struktur neboli polymorfů. Polymorfy se ve farmacii liší svojí rozpouštěcí rychlostí
Polymorf I Polymorf II
Řešení polymorfismu substance trans-D-terguridu
Námel (paličkovice nachová,
Claviceps purpurea)
Trans-D-tergurid
Tergurid (forma C) – požadovaná fáze
Tergurid . 2/3 H2O (forma A ) - nečistota
Tergurid . H2O (forma B) - nečistota
Polymorfismus substance trans-D-terguridu
Stabilní (nejstabilnější) formou v
systému je B:
➢ formy A a C, za určitých
podmínek, přechází na formu B
➢ o tom, která forma bude z
roztoku krystalovat, rozhoduje
velmi přísně obsah H2O ve
finálním rozpouštědle
Fázové transformace v systému
trans-D-terguridu
E: tergurid . EtOH A: tergurid . 2/3 H2O M: tergurid . MeOH
T> 40o C suspenze ve vodě 1 hodina na vzduchu
nebo 3 dny při 75% RH
B: tergurid . H2O 6 hod, 70o C
suspenze ve vodě několik měsíců při 75% RH suspenze ve vodě
C: tergurid D: tergurid . H2O F: tergurid . 2/3 H2O
Stabilní fází v systému je monohydrát. Obecně ale neplatí, že solváty
jsou stabilnější než ansolváty !!!
dimorfní kyselina
acetylsalycilová
Příklady polymorfních systémů – teoreticky zajímavé
a prakticky důležité
Forma I Forma II
Wishweshwar P. et al.:JACS 127, 16802 (2005).
Prakticky důležité a teoreticky zajímavé polymorfní systémy
Teoreticky zajímavé
Nízkoteplotní polymorfy simvastatinu:
261 K 223 K
„ Room Temp.“ fáze nízkoteplotní fáze I nízkoteplotní fáze II
O
O
H
OOH
O
Hušák M., Kratochvíl B., Jegorov A.: Acta Crystallogr. A64, C211 (2008).
P 212121 P 212121 P 21
Kombinace polymorfního složení
Léčivou látkou je cabergolinum 0,5 mg v jedné tabletě. Excipienty jsou laktosa (plnivo, pojivo) a leucin
(ochucovadlo)
3 polymorfy
(I, II, VII)
2 polymorfy
(, )
Dostinex, Pfizer (příbalová informace, PIL – neuvádí polymorfy):
Pro polymorfní složení
Dostinexu připadá v úvahu
6 kombinací !
Cabergolin
Laktosa
Lék pro regulaci tvorby mléka u žen
Reverzní inženýrství - identifikace polymorfů atorvastatinu
vápenatého v tabletách konkurence
Difraktogram atorvastatinu: čistá forma I a forma I v tabletě (+ excipienty):
• uhličitan vápenatý
• mikrokrystalická celulosa
• laktosa
• sodná sůl karboxymethylcelulosy
• polysorbát
• hydroxypropylcelulosa
• stearan hořečnatý)
difraktogram tablety
Lipitorumdifraktogram
atorvastatinu I
Farmaceutický kokrystal je stechiometrická multikomponentní sloučenina typu hostitel
(aktivní molekula) : host (kokrystalizační partner), vytvořená ze dvou nebo více
složek, které jsou v čistém stavu a za pokojové teploty pevné - uznávaná definice
C.B. Aakeröye. Stechiometrický poměr hostitel : host je většinou jednoduchý (1:1,
2:1, 3:1, 4:1, resp. 1:4)
Aktivní molekula ve formě kokrystalu může výrazně zlepšit funkční a
technologické parametry API
kokrystal karbamazepin:sacharin (1:1)
Farmaceutický kokrystal
Predikce krystalových struktur - alaptid
Alaptid je spirocyklický dipeptid [(8S)-8-methyl-6,9diazaspiro[4,5]dekan-7,10-dion],
C9H14N2O2, tvořený spojením
pětičlenného a šestičlenného kruhu. Teplota tání 243-245 °C
Vlastnosti: rozpustnost: 1 mg alaptidu v 1 ml vody, 10 mg v 1 ml MeOH
Použití: ve formě veterinární masti na léčbu kožních a slizničních
poranění, popálenin, odřenin, omrzlin, proleženin atd., potenciálně pro
léčbu Alzheimerovy choroby a žaludečních vředů – nízká rozpustnost
ve vodě !
Predikce krystalových struktur - alaptid
Pořadí dle
energie
Celková
energie dle
pole
COMPASS
(kcal/mol)
Hustota
(g/cm3)
Prostorová
grupa
V(Å3) a(Å) b(Å) c(Å) β(˚)
1 15,97 1,388 P2
1
2
1
2
1
871,94 21,08268 6,24113 6,62667 90
2 16,70 1,366 P2
1
442,96 6,24871 6,60183 11,63131 112,6
05
3 16,76 1,371 P2
1
2
1
2
1
882,58 16,01046 8,75008 6,300000 90
4 16,97 1,379 P2
1
438,97 6,16103 7,04354 10,21912 98,16
3
5 17,04 1,377 P2
1
2
1
2
1
879,22 20,19003 6,16983 7,05811 90
Exp. [40] 1,469 P2
1
2
1
2
1
938,41(1) 21,14118(7) 6,14610(3) 7,22207(2) 90
červeně - predikce,
zeleně - experiment
1) Každá fáze poskytuje charakteristický difraktogram (hodnoty , resp.d a I )
2) Difraktogram směsi je superpozicí difraktogramů čistých fází
3) Intenzita difrakčních píků je úměrná množství fáze ve směsi
Např. u fázové polymorfní směsi je RTG difrakční analýza
nejdůležitější metodou identifikace a stanovení
Aplikace v práškové RTG difrakční analýze
- kvalitativní a kvantitativní fázová analýza
Převzato od Fiala, Kolega: Mat. Struct. 18, 81 (2011).
- kvalitativní analýza:
- referenční databáze PDF IV (asi 750 000 fází)
- identifikační algoritmy a vyhledávací software
- kvantitativní analýza:
- bezstandardové metody
- standardové metody
- teoretický RTG práškový difraktogram
- Rietveldova metoda
RTG fázová (prášková) analýza – experiment
Přístrojová technika:
• práškový RTG
difraktometr
• doba měření řádově
min. až desítky min.
(několik 10 - 100 reflexí
z jedné dimenze)
Vstupní materiál :
• prášek o zrnitosti 10-3 -10-5 mm
• plíšek, plocha, vrstva , plíšek,
kapilára…
RTG fázová (prášková) analýza –
výsledek experimentu
Dvojí možná škála na ose x:
d:nezávisí na hodnotě 
2: závisí na hodnotě 
(hkl)
RTG práškový difraktogram (difrakční obraz),
na kterém lze odečíst:
polohy , intenzity, profily a šířky difrakčních linií
=2dhkl sin hkl
Zkreslení intenzit – přednostní orientace (textura) !
Analogie přednostního uspořádání šupinovitých
krystalitů ve vzorku podle preferenčního tvaru
K potlačení se používá kapilární technika !
Dva difraktogramy sulfathiazolu III (Bernstein, 2002):
S potlačením přednostní orientace (a),
bez potlačení přednostní orientace (b).
b
a
Monitorování fázové čistoty a reprodukovatelnosti výrobních
šarží (QC) léčivých látek metodou RTG práškové difrakce
Prazosin hydrochlorid (antihypertensivum)
RTG práškové difraktogramy výrobních šarží prazosinu hydrochloridu
Detekce polymorfní nečistoty u raniditinu hydrochloridu
metodou RTG práškové difrakce
RTG práškový difraktogram polymorfu I RTG práškový difraktogram polymorfu II
II I II
RTG práškový difraktogram směsi polymorfů I + II
Potvrzení strukturně-fázové čistoty výrobních šarží
simvastatin (hypolipidemikum)
Krystalová struktura simvastatinu Naměřený (obs) a vypočtený (calc) RTG práškový
difraktogram simvastatinu
Mikrostruktura pevných lékových forem – technika RTG mikrodifrakce
Mapping mikrostruktury tobolky (Ramanova spektroskopie)
léčivo („modrá“)
Excipient 1(„červený“)
Excipient 2(„zelený“)
Mezifázové
rozhraní
Mapping mikrostruktury pelety
(infračervená spektroskopie)
Identifikace nečistoty na tabletě
léčivo
(„žlutá“)
cukr
(„zelená“)
obal
(„modrá“) nečistota
Difrakce na látkách krystalických, semikrystalických a amorfních
simvastatin
atorvastatin V
atorvastatin
amorf
sertralin. HCl
amorf
a b c
Patenty a vědecká pravda – semikrystalické fáze
Difraktogram amorfního atorvastatinu
Patent firmy Warner-Lambert Co.
Difraktogram amorfního atorvastatinu (forma E)
Patent firmy Ciba Specialty Chemicals Holding Inc.
Difraktogram semikrystalické formy
atorvastatinu (V Teva)
Přechodové fáze atorvastatinu mezi
amorfní a semikrystalickou formou
Patenty a atorvastatin
(v současnosti zapatentováno asi 70 pevných forem atorvastatinu)
U atorvastatinu I připadá na škálu do 36o 2-theta 47 píků,
u 70 forem atorvastatinu 70 x 47 = 3200 píků…
koincidence pozic píků vyvolají patentové spory !
Závěry
• RTG difrakční metodika je nejdůležitější analytickou technikou pro
monitorování krystalických a v menší míře i amorfních fází ve farmacii
• RTG difrakce zahrnuje dvě hlavní analytické metodiky:
- strukturní analýzu (z monokrystalu a z prášku)
- fázovou analýzu (identifikaci a stanovení kryst. a amorfních fází)
• RTG difrakční metodika především monitoruje:
- strukturně-fázovou čistotu výrobních šarží
- polymorfismus
- stabilitu, degradační produkty, meziprodukty
- farmaceutické fáze (anhydráty, hydráty, solváty, soli, kokrystaly)
• Výsledky RTG difrakčních metodik jsou důležité ve vývoji, kontrole
kvality výroby, reverzním inženýrství a v patentových sporech
• RTG difrakční metodika úzce kooperuje s ostatními pevnolátkovými
metodami (především NMR, IČ, Raman, teplotní metody)
• Pro registrační autority je u pevných fází RTG difrakční metodika
metodou první volby