NIR a jeho využití ve farmacii Josef Jampílek 2020 • Charakterizace a principy metody • Techniky měření • Doporučení a předpisy • Aplikace • Výhody a nevýhody techniky NIR Osnova • Rychlá nedestruktivní, neinvasivní analytická metoda, která nabízí široké spektrum využití. • Nahrazuje pracnější, náročnější postupy analytické chemie. • Rychlá kontrola vstupních surovin, meziproduktů a produktů. • Lze aplikovat on-line analýzy a PAT (v procesní kontrole QC/AC). NIR – charakterizace • 60. léta – kvantitativní stanovení vlhkosti v semenech olejnin. • 70. léta – analyzátory krmiv a potravin (fy Dickey-John, Neotec, Technicon). • Koncem 80. let a začátkem 90. let vývoj přístrojů FT-NIR  širší využití techniky NIR. • Rozvoj počítačové techniky a zlepšení kvality měřeného spektra akceleroval vývoj statistického softwaru. • Vzrůstá počet publikovaných aplikací. Historie a trendy vývoje USP 26NF21, kapitola 1119 a její aktualizace. PASG NIR SubGroup (An Association of Analytical Chemists within the research based Pharmaceutical Industry): Guidelines for the Development and Validation of Near Infrared (NIR) Spectroscopic Methods, 2001. Moffat A.C. et al. Analyst, 2000, 125, 1341–1351. US FDA Guidance for Industry: PAT – a framework for innovative pharmaceutical manufacturing and quality assurance, 2004. NIR – předpisy, doporučení Guidelines for the Development and Validation of Near-infrared Spectroscopic Methods in the Pharmaceutical Industry, 2002. 10 10 10 10 10 10 10 10 9 7 5 3 1 -1 -3 -5 vlnočet RTG UV VIS near-IR mid-IR far-IR mikrovlny radiové vlny Elektromagnetické spektrum • NIR - 13000 (12800) – 4000 cm-1 (vlnočet) - 800 – 2500 nm (vlnová délka) • MIR - 4000 – 400 cm-1 (vlnočet) - 2500 – 25000 nm (vlnová délka) Regiony IR spektroskopie Stejný základní fyzikální princip v obou oblastech. Absorbce fotonů o stejných frekvencích jako jsou frekvence vibrací příslušných vazeb. MIR: fundamentální absorbční mody 0 → 1 overtony – svrchní tóny ( 0 → 2, 0 → 3) a kombinační absorbční mody funkčních skupin, jejichž základní vibrace je <2000 cm-1. NIR: overtony ( 0 → 2, 0 → 3) a kombinační absorbční mody funkčních skupin, jejichž základní vibrace je >2000 cm-1. Fyzikální princip vzniku spekter MIR / NIR NIR spektra složena z kombinačních pásů a pásů vyšších harmonických vibrací. (projevují se při vyšších frekvencích) 1000200040006000800010000 3. Overton 1. Overton Fundamentální vibrace (Mid IR) 1 0.5 Absorbance Wavenumbers Oblast NIR Kombinační 2. Overton 3000 Absorpční pásy NIR NIR spektrum Combination 1st Overtone 2nd Overtone 3rd Overtone 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Log(1/R) 5000600070008000900010000 Wavenumbers (cm-1) Vzhledem k odlišným frekvencím záření, které se v NIR uplatňuje, nejsou NIR spektrometry tolik náročné na použité materiály jako přístroje pracující ve střední oblasti IČ záření. Blízké IČ záření prochází křemenným sklem, a proto může být veškerá optika z křemenných vláken, např. kyvety mohou být ze stejného skla, jaké se užívá v UV-VIS spektrometrii. Konstrukce FT-NIR spektrometrů je zcela totožná jako pro střední oblast. Všechny NIR spektrometry se skládají ze tří základních součástí: • zdroje záření • detektoru • interferometru Konstrukce spektrometru Základní konstrukční schéma spektrometru s Fourierovou transformací pro oblasti MIR a NIR je obdobné. He-Ne laser detektor IR zdroj fixní zrcadlo x 0 -x dělič paprsků laserová dioda vzorek pohyblivé zrcadlo Konstrukce spektrometru Zdroje záření MIR: odporový NiCr drát, žhavená keramická tyčinka NIR: halogenová žárovka Děliče paprsků MIR: KBr, CsI NIR: křemen, CaF2 Rozdíly v konstrukci FT-MIR a FT-NIR spektrometru Detektory MIR: DTGS/KBr, MCT, fotoakustický NIR: InGaAs, PbSe, PbS, Si Vláknová optika MIR: KBr NIR: křemen Materiál příslušenství MIR: KBr, NaCl, CsI, ZnSe, diamant, Si NIR: sklo, křemen Rozdíly v konstrukci FT-MIR a FT-NIR spektrometru NIR spektrum vzdušného pozadí Spektrum polystyrenu v MIR a NIR oblasti Polystyren NIR Polystyrene measured as a film 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 Absorbance 200040006000800010000 Wavenumbers (cm-1) Polystyren - spektrum ve střední oblasti (MIR) Polystyren – spektrum v NIR oblasti Interakce záření s pevným vzorkem transmise Interakce záření s pevným vzorkem Vliv velikosti částic. • Transmisní měření – zeslabení zářivého toku po průchodu záření vzorkem. • Reflexní měření – zeslabení zářivého toku po odrazu záření. Transmise (průchod záření vzorkem) Reflektance (odraz záření od vzorku) Techniky měření Reflexní měření • Difúzní reflexe (DRIFT) - pro pevné látky Dopadající záření se odráží od povrchu jednotlivých malých částic. Nástavec UpDrift s úpravou pro rotaci vzorku Techniky měření Princip difúzní reflexe (DRIFT). • Difúzní reflexe (DRIFT) - pro pevné látky V rámci reflexních technik se nejčastěji uplatňuje princip difúzní reflexe s Fourierovou transformací (Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform, DRIFT), kdy se dopadající záření odráží od povrchu jednotlivých malých částic práškovitého vzorku. Tento přístup se nejčastěji používá při analýzách ve farmaceutickém průmyslu. Techniky měření Reflexní měření Petriho miska Vzorek Zrcadlo Drážka pro odstranění vzduchu Definovaná optická dráha • Transflektance - pro kapaliny a suspenze Dopadající záření se odráží od zrcadla transflektanční kyvety. Techniky měření Vliv tloušťky vrstvy vzorku v kyvetě na odezvu v NIR spektru. NIR-Multiplexer systém s různými typy sond. FT-IR spektrometr Vzorkovací techniky Ruční pistolová sonda s vláknovou optikou. FT-IR spektrometr Vzorkovací techniky FT-IR spektrometr Vzorkovací techniky FT-IR spektrometr Vzorkovací techniky Zvláštní postavení mají NIR techniky v PAT (procesní analytické technologii). NIR spektrometry lze připevnit na další zařízení a přímo jimi sledovat výrobní proces a kontrolovat tak on-line jeho průběh, lze tak např. sledovat celý průběh výroby tabletoviny. Toto uspořádání představuje bezkontaktní analýzu, možnost sledování směrodatných odchylek jak u jednotlivých složek, tak u celé finální směsi. FT-IR spektrometr Vzorkovací techniky Chemický mapping/imaging – technika kombinující prostorovou a chemickou informaci. mapping: měřeno bod po bodu spektrum v prostorově blízkých bodech imaging: využíváno plošného detektoru k zobrazení obrazu zkoumaného vzorku Benefity – jak v práškových směsích, ale i v lékových formách je možno určit velikost a distribuci jednotlivých složek, polymorfní distribuci, stupeň hydratace, detegovat cizorodé částice nebo určit typ a tlouštku potahu. Lze dosáhnout prostorového rozlišení až řádu mikrometrů. Lze měřit minimální množství vzorku. Tyto znalosti mohou být využity v pochopení a optimalizaci technologie a procesů. NIR Imaging Využívání NIR spektrometrie se rozšiřuje od 90. let 20. století spolu s vývojem nových IČ spektrometrů pro blízkou oblast s Fourierovou transformací. FT-NIR spektrometrie je rychlá nedestruktivní, neinvazivní analytická metoda, která v současnosti nabízí široké spektrum využití. Lze ji využít k testování hotových výrobků, kontrole uniformity produktů a verifikaci vstupních surovin. Umožňuje on-line sledování výroby a má široké uplatnění v PAT. NIR – aplikace ANALÝZA POTRAVIN, FARMAK, PLASTŮ atd. stanovení alkoholu a cukru v nápojích analýza sýrů - obsah tuků, cukrů, proteinů, obsah vody stanovení aktivní látek v tabletách stanovení oktanového čísla a obsahu aromátů - petrochemie stanovení aditiv v plastech stanovení obsahu celulosy - papírenský průmysl Ve farmacii se NIR spektrometrie využívá pro kvalitativní i kvantitativní aplikace. Je třeba zdůraznit, že pro všechny aplikace je třeba, aby byl změřen standard, resp. série standardů. Měřením vzorků bez standardů lze pouze konstatovat, zda konkrétní vzorky vykazují odlišnost od předchozích, ale pouze na základě NIR spektra není možno říci, o jaký vzorek se jedná, resp. v čem se vzorky liší. NIR – aplikace • Identifikace (vstupní analýza surovin, obalů) • Velikost částic • Obsah vody • Pevnost • Polymorfie • Obsah API v lékové formě • Obsahová stejnoměrnost dávkových jednotek • Disoluce • Kvalitativní • Kvantitativní NUTNÉ MULTIVARIAČNÍ KALIBRAČNÍ MODELY METODA - automatizovatelná NIR – aplikace Ve spektrech nelze určit charakteristické skupiny  porovnávají se celá spektra. kys. ftalová kys. adipová kys. štavelová Nicodom NIR kys. benzoová kys. stearová -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Absorbance 500060007000800090001000011000 Wavenumbers (cm-1) NIR – kvalitativní aplikace MIR: využití komerčních nebo vlastních knihoven použití různých vyhledávacích algoritmů interpretace spekter za použití tabulek pásů NIR: využití komerčních nebo vlastních knihoven použití různých vyhledávacích algoritmů použití projekční DA (Discriminant Analysis) Kvalitativní vyhodnocení spekter 0.2 0.4 Kyselina L+vinna 0.2 0.4 0.6 0.8 Abs Kyselina jablecna 0.2 0.4 0.6 0.8 Abs 5000600070008000900010000 Wavenumbers (cm-1) Princip Lambert-Beerova zákona není splněn vzhledem k charakteru spektra  porovnávají se celá spektra. • nutné kalibrační modely • mnoho kalibračních vzorků jako standardů • chemometrické algoritmy (vícenásobná lineární regrese, regrese hlavních komponent, částečné nejmenší čtverce) NIR – kvantitativní aplikace MIR: klasická jednokomponentní kalibrace s vyhodnocením výšky nebo plochy vhodného pásu pomocí Lambert – Beerova zákona možnost použití chemometrických algoritmů. NIR: nelze použít Lambertův - Beerův zákon nutnost použití chemometrických algoritmů. Kvantitativní vyhodnocení spekter Identifikace (metoda standardu) • API • jednotlivé excipienty • finální výrobek Velikost částic, Obsah vody (metoda kalibrační přímky) • API • jednotlivé excipienty • finální výrobek Pevnost (metoda kalibrační přímky) • tablet NIR – aplikace 38 NIR spektra kyseliny vinné a jejích solí. NIR – aplikace Strukturně blízké molekuly 39 NIR spektra hexos. glu c os e 0.2 0.4 0.6 Abs ma nnos e 0.2 0.4 Abs galac tos e 0.1 0.2 0.3 Abs allo s e 0.1 0.2 0.3 Abs 5000600070008000900010000 W avenumbers (cm-1) O H HO H HO H OH OHH H OH -D-glucopyranose O O H H HO H OH OHH H OHH -D-galactopyranose O H HO H HO OH OH HH H OH -D-mannopyranose O H HO OH H H H OHH OH OH -D-allopyranose NIR – aplikace Strukturně blízké molekuly Lactosa bezvoda 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Abs Lactosa monohydrydrat 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Abs 5000600070008000900010000 Wavenumbers (cm-1) NIR – aplikace Vliv vody / vlhkosti NIR spektra sacharosy slisované do tablety velkým tlakem, dále sacharosy krystalické a jemně rozetřené. Rozdíly patrny ve výšce jednotlivých pásů. NIR – aplikace Vliv velikosti částic NIR spektra různých šarží API s rozdílnou velikostí částic. Rozdíly patrny ve výšce jednotlivých pásů. NIR – aplikace Vliv velikosti částic Tibolon_OF7A-1390 Tibolon_OF7A-1690 Tibolon_OF7A-1710 Tibolon_OF7A-0020 -0.12 -0.10 -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24 Absorbance 50006000700080009000 Wavenumbers (cm-1) Na základě NIR spekter provedena kalibrace. Hodnocení vzorků založeno na rozdílech ve výšce jednotlivých pásů versus hodnoty z laserové difrakce. Zpracováno chemometrikou; plocha nejmenších čtverců (partial least square, PLS). NIR – aplikace Vliv velikosti částic NIR spektra různých šarží tablet bez potahu, s požadovanou tloušťkou potahu a s 2 % a 4 % tloušťkou potahu. Rozdíly patrny ve výšce jednotlivých pásů. NIR – aplikace Tloušťka potahové vrstvy Na základě NIR spekter provedena kalibrace. Hodnocení vzorků založeno na rozdílech ve výšce jednotlivých pásů versus skutečná tloušťka potahu zjištěná mikroskopem. Zpracováno chemometrikou, plocha nejmenších čtverců (partial least square, PLS). NIR – aplikace Tloušťka potahové vrstvy NIR spektra různých šarží tablet vyrobených za různého lisovacího tlaku. NIR – aplikace Pevnost tablet Na základě NIR spekter provedena kalibrace. Hodnocení vzorků založeno na rozdílech ve výšce jednotlivých pásů versus skutečná pevnost. Zpracováno analýzou hlavních komponent (principal component analysis, PCA). NIR – aplikace Pevnost tablet Na základě NIR spekter provedena kalibrace. Hodnocení vzorků založeno na rozdílech ve výšce jednotlivých pásů versus skutečná pevnost. Zpracováno chemometrikou, plocha nejmenších čtverců (partial least square, PLS). NIR – aplikace Pevnost tablet Polymorfie (metoda standardu) • API • jednotlivých excipientů • finální výrobek Metoda srovnatelná s ostatními technikami pevné fáze. Lze užít u jakékoli API, excipientu a lékové formy v závislosti na aktuálním složení. Vždy je nutnost porovnat se standardy a výchozími látkami (ideálně, které také podstoupily stejný proces jako vzorek). NIR – aplikace cholateNa_novy Cholat Na 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 Absorbance 50006000700080009000100001100012000 Wavenumbers (cm-1) NIR – aplikace Polymorfie Polymorfie pomocných látek. 51 Změna NIR spektra po vytvoření aduktu se sacharidem. NIR – aplikace Polymorfie R is edron ate.N a_s em i-c ry s tallin e 0.0 0.2 Abs allo s e 0.2 Abs R SN +allo s e_1 :1+Me OH pr ec ipitate 0.2 0.4 Abs R SN +allo s e_1 :2+Me OH pr ec ipitate 0.0 0.2 0.4 Abs R SN +allo s e_1 :3+Me OH pr ec ipitate -0.0 0.2 Abs R is edron ate.N a_poly morp h A 0.5 Abs R is edron ate.N a_poly morp h H 0.5 Abs 5000600070008000900010000 W avenumbers (cm-1) vzorek-3 forma A sacharid vzorek-1 forma B vzorek-2 forma C NIR spektra pevných forem API a cukru – kalibrace a hodnocení vzorků založeno na rozdílech v jednotlivých spektrech. Zpracováno pomocí diskriminantní analýzy. NIR – aplikace Polymorfie forma B forma A cukr prostá směs 1:1 forma C vzorek 1:3 vzorek 1:2 NIR aplikace Obsah / Obsahová stejnoměrnost dávkových jednotek (CU) (metoda kalibrační přímky) • API • finální výrobek Lze užít u jakékoli API, resp. lékové formy (v závislosti na aktuálním složení a množství API v tabletě, min. 5 % w/w). Lze využívat rovněž pro stanovení obsahu látek v rostlinných extraktech. Metody nutno cross-validovat s HPLC metodou. NIR – aplikace NIR – aplikace Obsah API Hodnocení obsahu API v tabletách. NIR – aplikace Obsah API Hodnocení obsahu léčivých látek v suchých rostlinných extraktech (gingo, žeň-šen, látky z vinných listů pocházejících z odlišných sklizní a regionů). Využití clustrové analýzy. Je nutné, aby všechny clustry byly navzájem dobře rozlišeny. NIR – aplikace Obsah zbytkových rozpouštědel Hodnocení obsahu zbytkového ethanolu v API. NIR – aplikace Obsah zbytkových rozpouštědel Hodnocení obsahu zbytkového ethanolu v API. Kalibrace a hodnocení vzorků je založeno na rozdílech v jednotlivých spektrech versus GC. Zpracováno diskriminantní analýzou. Všechny metody je nutno korelovat s disolucí při prvotní tvorbě závislosti mezi NIR-spektrem a sledovaným disolučním parametrem (% uvolněné API). 1. sledování kvality disoluce a vlivu vlhkosti 2. sledování vlivu potahu jádra na kvalitu disoluce 3. sledování velikosti částic na kvalitu disoluce NIR – aplikace Disoluce NIR aplikace 1. sledování kvality disoluce a vlivu vlhkosti: • změří se NIR-spektra a provede se disoluce s nezatíženým vzorkem • vzorky se vloží do komory s definovaným stupněm vlhkosti • v definovaných časových intervalech se měří NIR-spektra a provádějí disoluce zatížených vzorků • provede se korelace změny vybraného disolučního parametru a změny v NIR-spektru • po vytvoření závislosti lze pro další experimenty užít NIR spektroskopii NIR – aplikace Disoluce • připraví se série tbl.flm. s definovanou tloušťkou potahu • změří se NIR-spektra a provede se disoluce s nepotaženou tabletou • postupně se měří NIR-spektra a provádí se disoluce s potaženými tabletami • provede se korelace změny vybraného disolučního parametru a změny v NIR-spektru • po vytvoření závislosti lze pro další experimenty užít NIR spektroskopii 2. sledování vlivu potahu jádra na kvalitu disoluce: NIR – aplikace Disoluce NIR – aplikace Disoluce 3. sledování závislosti velikosti částic API na disoluci finální lékové formy vyrobené standardním procesem s konstantním složením. Kalibrace a hodnocení vzorků založeno na rozdílech ve výšce jednotlivých pásů. Zpracováno chemometricky, plocha nejmenších čtverců (partial least square, PLS). NIR aplikace Homogenita smísení API s excipienty. Lze užít u jakékoli API (homogenita granulátu), resp. lékové formy (homogenita tablet). Lze rovněž využívat pro on-line monitorování procesu, viz PAT. Lze využívat: NIR reflektanci (upDrift) NIR imaging. NIR – aplikace NIR – aplikace Homogenita Užití tradiční NIR reflexe (nástavec UpDrift). Měří se tablety na několika místech a hodnotí se rozptyl jednotlivých spekter z jedné tablety a více tablet. homogenní vzorky NEhomogenní vzorky NIR – aplikace Homogenita homogenní vzorky NIR imaging. Proměřování povrchu vzorku pomocí mikroskopu spřaženého s NIR spektrometrem a následné chemometrické zpracování získaných dat (PLS). NIR – aplikace Homogenita částečně homogenní vzorky NIR imaging. Proměřování povrchu vzorku pomocí mikroskopu spřaženého s NIR spektrometrem a následné chemometrické zpracování získaných dat (PLS). NIR – aplikace Homogenita NIR imaging. Proměřování povrchu vzorku pomocí mikroskopu spřaženého s NIR spektrometrem a následné chemometrické zpracování získaných dat (PLS). NEhomogenní vzorky Využití v PAT: • sledování homogenity v průběhu výroby • bezkontaktní analýza • sledování směrodatných odchylek • jednotlivé složky • celkové složení Využití na: granulované přípravky přímé tabletování Sledované parametry: - homogenita API - homogenita pomocných látek Aplikace v PAT Vlastní měření – odchylka celkového složení tabletoviny. Aplikace v PAT talek celá tabletovina API NIR spektrum Vlastní měření – odchylka jednotlivých složek. Aplikace v PAT Vlastní měření – přídavek stearanu hořečnatého na konci homogenizace. celá tabletovina Mg stearát placebo API NIR spektrum Aplikace v PAT Vlastní měření – přídavek stearanu hořečnatého. API celá kapslovina placebo NIR spektrum Aplikace v PAT Excesy simulované u problémové homogenizace. Aplikace v PAT Výhody a využití: • Homogenita tabletoviny při validacích (po kalibraci lze zjistit i kvantitativní obsah). • Kontrola homogenity tabletoviny u „rizikových přípravků“. Nevýhody: • Správné určení píku sledované suroviny. • Nalezení / nenalezení hledaného spektra – sledovaná surovina musí mít obvykle min. 2% obsah ve směsi. Aplikace v PAT MIR: nutnost vzorkování (nelze měřit přes obal) přípravy vzorku před analýzou omezené použití rozpouštědel použití tenkých vrstev vzorků NIR: široké absorpční pásy nemožnost interpretace konkrétních pásů menší citlivost na změny koncentrace stanovovaného analytu velká citlivost na fyzikální změny analytu (teplota, vlhkost, homogenita, distribuce velikosti částic) nutnost použití chemometrie k vyhodnocení Nevýhody analýz v MIR a NIR oblasti MIR: ostré pásy interpretovatelná spektra větší citlivost a selektivita NIR: eliminace přípravy vzorku před analýzou možnost měření silnější optické vrstvy v křemenných kyvetách (1-50 mm) možnost měření přes obal nedestruktivní měření cenově dostupná vláknová optika Výhody analýz v MIR a NIR oblasti Děkuji za pozornost