1
Stanovení kyseliny acetylsalicylové v Acifeinu™
pomocí kapilární zónové elektroforézy
Obecný popis: Skripta - Jampílek et al., str. 46-47
Kapilární elektroforéza (Capillary electrophoresis, CE)
je moderní vysoce účinná analytická separační metoda. Principem je pohyb analytů
v kapalině mezi dvěma elektrodami vysokého napětí, obvykle realizovaný v kapiláře průměru
25-75 μm s on-column detekcí.
I. TEORIE
Elektricky nabitá částice se v elektrickém poli pohybuje ve směru daném znaménkem
náboje částice a orientací pole (kladně nabitá částice k zápornému pólu a naopak). V kapalině
je rychlost tohoto pohybu přímo úměrná náboji částice (F=q.E) a nepřímo úměrná
hydrodynamické (Stokesově) velikosti částice d (síla odporu prostředí F= - 3πηdv, kde η je
viskozita kapaliny). Tyto dvě síly se brzy po aplikaci elektrického pole vyrovnají a částice se
dále pohybuje konstantní rychlostí v. Pokud se tedy částice vzorku liší alespoň v efektivním
náboji či hydrodynamické velikosti, mohou se pohybovat rozdílnými rychlostmi, což je
nutnou podmínkou separace.
Při použití kapiláry (typicky křemenné, fused silica) jako separační kolony je prostá
elektromigrace nezanedbatelně snižována/zvyšována tokem nezávislým na náboji analytu
(elektroosmotický tok, electroosmotic flow = EOF), který může zcela znemožnit separaci
očekávanou podle nábojů a velikostí analytů.
Vysvětlení elektroosmotického toku v nemodifikované
křemenné kapiláře: povrch kapiláry nese
nepohyblivý negativní náboj (silanolové skupiny).
V důsledku zachování elektroneutrality se proto u
stěn nachází přebytek pozitivních iontů z roztoku,
které pak celou kapalinu unáší ke katodě.
2
Vyhodnocení elektroforeogramu
Jedním z módů CE je kapilární zónová elektroforéza, pro níž je charakteristické
použití jednoho pracovního elektrolytu (background electrolyte, BGE). V důsledku toho je v
celé separační kapiláře konstantní elektrické pole. Jednotlivé zóny putují různými
konstantními rychlostmi, jsou oddělené BGE a odezva detektoru na konci kapiláry (typicky
UV-VIS detektor) má gaussovský profil (=pík). Obdobně jako u chromatografie, retenční čas
píku tr charakterizuje analyt kvalitativně, kvantitativní charakteristikou elektroforeogramu je
výška píku v (nebo plocha - při nahrazení píku trojúhelníkem o výšce h a základně w platí
P=h.w/2).
Počet teoretických pater N je mírou účinnosti kolony
μ je mobilita, U napětí, D difúzní koeficient. (pozn. tr a w musí být vyjadřovány ve stejných
jednotkách např. sec nebo mm !!!). N je vysoké pro „úzké“ (základna píku w 0) a
zadržované (tr ∞) píky. Nejjednodušší odečtení w je nahrazení píku trojúhelníkem (viz
obrázek ↓)
Rozlišení Rs je mírou separace dvou píků. Např. hodnota Rs=1,00 udává, že dva
stejné píky vykazují jen 2 %-ní překryv, při Rs = 1,50 považujeme píky za kvantitativně
oddělené.
N
t
w
pro elektrofor
U
D
r
= =
⎛
⎝
⎜
⎜
⎞
⎠
⎟
⎟16
2
2
2 ézu také
μ
( )
R
t t
w w
s =
−
+
2 1
2 1 2/
t 1
t 2
w 2w 1s t a r t
v
h
3
II. INSTRUMENTACE
Kazeta (cartridge) = držák kapiláry s detekčním
okénkem, slouží i jako vzduchový chladič
Přístroj CE3D Agilent
Příslušenství přístroje
skleněné vialky 1,8 ml zátky vialek PP vialky 0,9 ml a 250 ul
 www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/CE_Main.html 
4
Experimentální uspořádání v CZE je prakticky stále stejné, liší se jen v
jednotlivostech. Zařízení vždy obsahuje nejméně: separační kapiláru, zdroj napětí,
(dávkovač vzorku), detektor a zařízení pro záznam analytického signálu (viz obrázek ↑).
Typické napětí je 5-30 kV, elektrolyt o koncentraci 5-200 mM.
Analýza se obvykle provádí v křemenných kapilárách, zřídka v kapilárách teflonových
nebo skleněných. Křemenné jsou z vnější strany chráněny tenkou vrstvou polyimidu, čímž se
omezí křehkost. Typický vnitřní průměr kapiláry je 50-75 μm, délka 40-70 cm, objem 1-3 μl.
Detekce se nejčastěji provádí UV-VIS detektorem, konduktometricky, fluorescenčně
(laserem indukovaná fluorescence), amperometricky, hmotovým spektrometrem (absolutní).
Dávkování (řádově nanolitry) se provádí buď hydrodynamicky (přetlakem na začátku
či podtlakem na konci kapiláry) nebo elektromigračně (po stanovenou dobu se aplikuje
dávkovací napětí).
III. ÚKOL
Kyselina acetylosalicylová (acetylsalicylic acid, Aspirin™, Acylpyrin™)
je široce používané léčivo s např. antipyretickými účinky. V této práci
bude stanovován její obsah v komerčně vyráběném léčivu ACIFEIN
(HERBACOS-BOFARMA, s.r.o) metodou CZE.
Kofein (caffeine) (podle rostliny Coffea arabica, česky kávovník) je alkaloid, který příznivě
stimuluje centrální nervovou soustavu a srdeční činnost. Kofein je
pravděpodobně nejrozšířenější stimulant na světě nacházející se
v mnoha nápojích, např. kávě, který se užíváním ve větším
množství stává drogou. Kofein patří do skupiny purinových,
methylových derivátů xanthinu, která zahrnuje theobromin (kakao)
a theofylin (bronchodilatans, látka uvolňující průduškové svalstvo).
Paracetamol je léčivo, jež působí proti bolestem a zvýšené tělesné
teplotě, není však protizánětlivé. Patří do indikačních skupin
analgetikum a antipyretikum.
5
pKa=3.5 pKa=9.9 pKa1=3.0 pKa2= 8.3
http://www.farmaceutika.info/acifein#spc
Popis systému:
CE systém CE3D Agilent (Agilent Technologies, Walbronn, Německo)
nemodifikovaná křemenná kapilára, vnitřní průměr 75 μm, L=33 cm, efektivní délka =
24,5 cm
borátový pufr (25 mM tetraboritan sodný), pH=9,25
napětí = + 10 kV, dávkování = 20 mbar / 3 s
teplota = 25 °C, detekce UV při 206/265/280 nm
Chemikálie:
Tetraboritan disodný (dekahydrát), kyselina boritá, NaOH, kyselina acetylsalicylová, kofein,
paracetamol, methanol
Správná laboratorní praxe (Good laboratory practise, GLP):
• detekce v UV oblasti s optickou celou 75 μm vyžaduje zcela transparentní roztoky. Každý
roztok pro CE musí být před použitím filtrován (výměnné filtry 0,02 μm)
• před odchodem zkontroluj přístroj a umyj veškeré nádobí, které jsi používal. Uvaž, že i
další kolegové budou se stejným vybavením chtít stanovovat velmi nízké koncentrace
látek.
6
PRACOVNÍ POSTUP:
Příprava roztoků
roztok pufrujícího elektrolytu (BGE):
100 ml: 25 mM tetraboritan sodný, pH= 9.25
Příprava vzorku:
Zvaž 10 tablet a spočítej průměrnou hmotnost jedné tablety. Vyber jednu tabletu, zvaž ji,
dokonale rozetři na prášek a 25 mg rozpusť v 5 ml methanolu a doplň na 50,00 ml vodou.
Přítomnost aditiv znemožňuje úplné rozpuštění tabletky. Všechny stanovované komponenty
(analyty) se však kvantitativně rozpustí do 10 minut. Do ampulky filtruj! (15 minut)
Zásobní roztok standardu (kyselina acetylsalicylová=ASA) připravíme do 25 ml odměrky,
koncentrace c≈2.4 mg/ml, v 10% methanolu. Z tohoto roztoku nařeď kalibrační roztoky
(10,00 ml) o následujících koncentracích:
ASA: 24, 120, 180, 240 μg/ml (30 minut)
◊ napiš si do pracovního sešitu tabulku, jak umístíš jednotlivé roztoky do karuselu (dodrž
alespoň následující pozice 8=odpad, 5 a 6=základní elektrolyt). Vyhraď také ampulky pro
čistící roztoky (2=0.1 M NaOH, 3=voda)
◊ naplň ampulky po hrdlo (plastové 0,90 ml, skleněné max. 1,80 ml) a označ je fixou
◊ oznam vedoucímu cvičení připravenost k analýze
7
Práce s přístrojem Agilent CE3D:
Vedoucí cvičení vysvětlí obsluhu přístroje určenému zodpovědnému studentovi. Před
posláním jakéhokoli příkazu (software Chemstation) zkontrolujte, zda nejsou ke kapiláře
zvednuté vialky a jejich pozice zároveň obsazeny v karuselu!!! Tato situace vyústí ve
zničení výtahů přístroje a vyžádá si opravu v ceně cca 100 000,- Kč! (obsazenost pozic a čísla
vialek vidíme na schématu přístroje)
…………….ikona na ploše
jako první je nutno spustit „SYSTEM INIT“ (viz příloha)
vlož do přístroje kazetu s kapilárou (a proveď kalibraci vlnových délek)
ověř funkčnost systému střídavým promýváním do vialky 8 (odpad) z
3=voda/2=hydroxid. Zkontroluj, zda po cca 6 sekundách dochází ke skokové změně
absorbance. Pokud ne, oznam to neprodleně vedoucími cvičení; bez nápravy tohoto stavu
by bylo další měření zbytečné
(15 minut)
• Podle přílohy zkontroluj parametry softwaru (metoda ACIFEIN.M)
25 °C, preconditioning =1 min BGE, polarity positive 10 kV, postconditioning = 1 min
hydroxid + 1 min voda, dávkování 5s / 25 mbar + oplach, stoptime 6 min, DAD: λ =
200/231/246nm (10 minut)
• 3x zanalyzuj vzorek (25 minut)
• za stejných podmínek proveď analýzu kalibračních roztoků (3x) (90 minut)
celkem 180 minut
• kterým látkám patří další pozorované signály? – můžete ověřite nástřikem SA a APAP,
kofeinu, p-aminofenolu
8
Vyhodnocení:
• Spočítejte průměrné retenční časy, průměrný počet teoretických pater a průměrné rozlišení
pro signály ASA a SA ve vzorku (hodnoty tr a w odečtěte ze softwaru Chemstation).
Vypočtěte celkovou přesnost přístroje (=RSD z odečteních ploch hlavních píků).
• Zkonstruujte 2 lineární kalibrační grafy: plocha vs. koncentrace a výška vs. koncentrace
(uvažte i bod [0,0]), vypočtěte korelační koeficient r. Z průměrné plochy píků odečtěte
koncentraci ASA (buď interpolací nebo použitím regresní kalibrační rovnice)
• Vypočítejte průměrnou hmotnost [mg] ASA v tabletě, kterou jste analyzovali. Spočítejte
také hmotnost ASA [mg] v průměrné tabletě.
9
PŘÍLOHA
diagram systému
systém INIT
10
nastavení metody:
1/ Home values
11
2/ Conditioning
12
3/ Injection (s oplachem inletu)
¨
10 mbar / 5s
13
4/ Electric
5/ Timetable
14
6/ Detector
diagram systému při měření:
15
typický elektroferogram
flush= promývání pufrem při 20°C
16
ASA 231 / 296 nm
SA 231 / 297 nm
APAP 246 nm
CAFF (206) 274 nm