1 UV-VIS fotometrie Spektrofotometrické stanovení mědi Chelatonem III s optimalizací podmínek Teorie Molekuly vzorku absorbují z dopadajícího záření fotony vhodné vlnové délky λ (tj. ty, které odpovídají jejich energetickým hladinám) a přecházejí do vyššího energetického stavu. V UV-VIS oblasti mají fotony energii dostatečnou k tomu, aby jejich absorpce způsobila přechod vnějších elektronů (200-600 kJ/mol). Skupiny, v kterých se realizuje takový elektronový přechod, se nazývají chromofory. U koordinačně kovalentních sloučenin (vazba donorakceptor) se jedná o energetické přechody v d a f orbitalech Obr. 1 Vlnové délky elektromagnetického záření Obr.2 Některé chromofory 2 Definice absorbance a Lambert-Beerův zákon (ČL 2009) 3 Optimalizace podmínek stanovení Význam pH pro tvorbu chelátů Komplexace kovových iontů je pro kvantitativní analýzu významná především u kyseliny ethylen-diamin-tetraoctové (EDTA), viz chelatometrie. Protože se jedná o čtyřsytnou karboxylovou (slabou) kyselinu, její stupeň disociace α je silně ovlivněn pH prostředí. U chelátů [kov-EDTA] je typické koordinační číslo 6 (viz obrázek), čili kov interaguje s činidlem na šesti místech: s dvěma volnými elektronovými páry na dusících a se čtyřmi kyslíky karboxylových skupin. Je tedy zřejmé, že stabilita komplexu roste se stupněm disociace kyseliny a tedy s rostoucím pH. Některé kovové ionty tvoří stabilní komplexy již v kyselém prostředí (Bi3+, Ti4+), většina kationtů v prostředí neutrálním a některé kationty k tomu potřebují pH až silně alkalické (Mg2+, Ca2+). Cu2+ +[H2Y]2= [CuY]2+ 2H+ V našem případě komplex [Cu-Y] absorbuje ve viditelné oblasti spektra (je modrý), a proto lze s výhodou měřit jeho absorbanci v oblasti kolem 700 nm, kde už neabsorbují ani ostatní složky roztoku (především činidla), ani samotný Cu(2+), protože je kvantitativně vázán. Absorpční maximum komplexu [Cu-EDTA] zjistíme z naměřených spekter (graficky). Zjištění vhodného pH a koncentrace činidel (Chelaton i pufr v nadbytku) je nezbytné pro kvantitativní vytvoření komplexu – v opačném případě bychom nemohli usuzovat z absorbance komplexu na koncentraci analytu (Cu). 4 Obr.3 Fotometr s diodovým polem HP 8453 Obr. 4 Popis fotometru Hewlett Packard 8453 http://www.p-forster.com/english/themes/Spectroscopy/BASICS/ 5 Obsluha přístroje Nejprve zkontrolujeme, zda je přístroj zapojen do elektrické sítě, a zapneme fotometr v levé spodní části spektrofotometru se nachází tlačítko. V pravém horním rohu fotometru začne blikat kontrolka. Po jejím ustalém na žluté barvě lze spustit počítač. Vyčkáme, až systém počítače připojí fotometr (komunikační CAG Bootp Server - okno zaregistruje zařízení uv8453) a pak teprve spustíme ovládací software Chemstation. Jedná se o ovládání jednopaprskového přístroje, a proto každá série měření začíná změřením „blanku“ – obvykle rozpouštědla, ve kterém budu provádět následující měření analytu (Tlačítko BLANK). Pak už můžeme měřit libovolný počet vzorků (SAMPLE). Pokud nám některé naměřené spektrum nevyhovuje, po označení (klepnutím myši) jej můžeme odstranit (Delete) a změřit znovu (z nového roztoku). Software Chemstation, modul UV-VIS Obsluha je velmi jednoduchá a umožňuje přehledně srovnávat více spekter, odečítat hodnoty maxim i absorbancí (kliknutím pravého tlačítka myši). Zapisujme do tabulky maximum informací o příslušném vzorku kvůli pozdější orientaci. Budeme pracovat v modu Standard. Můžeme exportovat spektrální data do excelovského sešitu a detailně je zpracovat doma na počítači. 6 Fotometrické stanovení mědi Chelatonem III pomocí kalibrační křivky s optimalizací podmínek (Skripta - úloha 2, str. 13-14, ROZDÍLY od Skript: měří se na fotometrech HP8453) Přístrojové vybavení Jednopaprskový fotometr HP8453 Chemikálie 0,05M CuSO4, 0,05M Chelaton III, tlumivé roztoky - pufry (pH 3,0; 4,6; 6,0; 9,2 a 10,2). Úkoly • změření absorpčního spektra komplexu Cu-EDTA (400-740 nm) – výběr λ(max) • změření závislosti absorbance na pH – výběr pH • změření závislosti absorbance na koncentraci Chelatonu3 – výběr c(Ch3) • změření kalibrační závislosti A vs. c(Cu) za optimálních podmínek • stanovení Cu2+ v neznámém vzorku fotometricky • srovnání se stanovením Cu přímou potenciometrií (ISE) pozn.: • měření absorbance vždy proti slepému vzorku (ne proti vodě)! • grafy vynášet na milimetrový papír nebo zpracovat v Excelu a vytisknout výsledek: mg mědi / 100 ml roztoku, který dostali Postup: 1. Závislost A = f(λ): do 50ml odměrné baňky odpipetujte 5,00 ml základního roztoku CuSO4, 10,00 ml roztoku Chelatonu III a baňku doplňte po rysku pufrem pH 6,0 a promíchejte. Porovnávací roztok (blank) připravte stejným způsobem, pouze místo 5,0 ml základního roztoku CuSO4 použijte 5,00 ml vody. Změřte absorbanci připraveného roztoku v oblasti 400-900 nm (absorpční spektrum). Vlnová délka (λmax), při které se nachází vrchol křivky (kolem 700 nm), udává absorpční maximum vytvořeného chelátu. 2. Závislost A = f(pH): do pěti 50ml odměrných baněk odpipetujte po 5,00 ml základního roztoku CuSO4 a 10,00 ml roztoku Chelatonu III. Odměrné baňky doplňte po rysku jednotlivými připravenými pufry a promíchejte. Ke každému vzorku připravte odpovídajícím způsobem i porovnávací roztok (blank). Změřte absorbanci všech pěti roztoků proti příslušným slepým vzorkům (blankům) při vlnové délce λmax. Naměřené hodnoty vyhodnoťte graficky. 7 3. Závislost A = f(cCh3):  do pěti 50ml odměrných baněk napipetujte po 5,00 ml základního roztoku CuSO4. Do první baňky přidejte pomocí byrety 2,00 ml roztoku Chelatonu III, do druhé 2,50 ml, do třetí 5,00 ml, do čtvrté 8,00 ml a do páté 10,00 ml. Odměrné baňky doplňte po rysku pufrem zvoleným podle výsledku předcházejícího měření a promíchejte. Ke každému vzorku připravte odpovídajícím způsobem porovnávací roztok (blank). Změřte absorbanci všech pěti roztoků proti příslušným slepým vzorkům při vlnové délce λ(max). Naměřené hodnoty vyhodnoťte graficky na milimetrový papír. 4. Závislost A = f(cCu) - kalibrační závislost: do pěti 50ml odměrných baněk odměřte byretou 1,00; 2,00; 3,00; 4,00 a 5,00 ml základního roztoku CuSO4 a přidejte dvojnásobek potřebného množství Chelatonu III zjištěného v předchozím měření. Odměrné baňky doplňte po rysku zvoleným pufrem a promíchejte. Porovnávací roztok připravte stejným způsobem, pouze místo 5,00 ml základního roztoku CuSO4 použijte 5,00 ml vody. Změřte absorbanci všech pěti roztoků proti slepému roztoku při vlnové délce λ(max). Naměřené hodnoty vyhodnoťte graficky na milimetrový papír. 5. Stanovení obsahu Cu2+ v neznámém vzorku: odpipetujte 5,00 ml z roztoku vzorku do 50-ml odměrné baňky, přidejte dvojnásobek potřebného množství Chelatonu III, doplňte po rysku zvoleným pufrem a promíchejte. Změřte absorbanci připraveného roztoku proti slepému roztoku při vlnové délce λ(max). Vyhodnocení: koncentraci roztoku vzorku mědi stanovte odečtením z kalibrační závislosti (pomocí rovnice lineární regrese). Stanovení Cu přímou potenciometrií (iontově selektivní elektrodou, ISE) 4. Podobně jako v bodě 4 připravte kalibrační roztoky CuSO4, ale doplňte do 50 ml vodou. Změřte potenciál všech kalibračních roztoků. Zkonstruujte kalibrační křivku: E (mV) vs. c(Cu) 5. Podobně jako v bodě 5 připravte 10 x zředěný vzorek, doplňte do 50 ml vodou. Změřte pomocí ISE potenciál a hledanou koncentraci odečtěte z kalibrační křivky. Přepočítejte na mg Cu ve 100 ml roztoku, který jste dostali k analýze. Porovnejte obě hodnoty. 8 Příloha Komunikační okno pro HP 8453 Úvodní obrazovka softwaru 9 Nastavení módu pro snímání spekter Načtení metody 10 Method setup: počet spektrálních maxim a minim k označení, rozsah měření Výběr vlnových délek k přímému měření absorbance Neshoda v použití zdrojů: pro UV oblast nutno použít Deuteriovou výbojku, pro měření nad 350 nm wolframovou žárovku (Tungsten lamp). 11 Schéma přístroje s oběma světel. zdroji zapnutými a při měření (blanku) Spektru blanku, které bude sloužit jako reference (pro každou vlnovou délku) Dialog pro zadání textového popisu při měření vzorku 12 spectrum/peaks fixed wavelengths dvojklik na spektrum Dialog před ukončením činnosti softwaru.