Přístupy k analýze buněčných proteinů Metody pro studium buněčných proteinů Stanovení fyzické přítomnosti buněčných proteinů: - polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) - westernový přenos - ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) - imunoprecipitace - imunohistochemie - izoelektrická fokusace - dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu 2 3 Elektroforetické techniky - založeny na schopnosti pohybu elektricky nabitých molekul v elektrickém poli - proteiny se obvykle rozdělují vertikální polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (PAGE) - polymerovaný gel se vloží mezi dvě nádoby naplněné pufrem, do kterých se ponoří elektrody - u deskové varianty se vzorky nanesou do jamek na horní straně gelu - používají se alkalické pufry, které proteinům udílejí negativní náboj - v elektrickém poli se pohybují směrem k anodě 4 5 Faktory ovlivňující pohyblivost proteinů v gelu - velikost: se vzrůstající velikostí molekuly se snižuje pohyblivost proteinů v gelu (efekt molekulárního síta) - tvar: globulární proteiny se pohybují rychleji než vláknité - hustota náboje (náboj/jednotka hmoty): čím vyšší hustota náboje tím vyšší pohyblivost v gelu - koncentrace akrylamidu: se vzrůstající koncentrací pohyblivost klesá 6 SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) - proteiny běžně zaujímají různé tvary a disponují různými náboji (na rozdíl od molekul DNA, které jsou uniformní z hlediska tvaru a rozdělení náboje) - interpretace elektroforetogramu v nativní podobě je obtížná - pro separaci proteinů se běžně používá denaturační varianta PAGE zvaná SDS-PAGE: - proteiny se rozpouštějí v roztoku obsahujícím negativně nabité molekuly SDS - disulfidové vazby v proteinech se eliminují redukčním činidlem (β-merkaptoetanolem) - proteinů je dokončena varem 7 SDS-PAGE Negativní náboj SDS a jeho vazba k proteinům způsobí: - zamaskování vlastního náboje proteinu - natažení proteinu (denaturaci) a eliminuje tak vliv tvaru proteinu na pohyblivost (díky elektrostatickému odpuzování molekul SDS) - počet molekul SDS navázaných na protein je zhruba úměrný jeho molekulové hmotnosti; proto má každý protein, bez ohledu na svou velikost, ekvivalentní hustotu náboje - větším proteinům bude kladen v gelu větší odpor a jejich pohyb bude pomalejší (efekt molekulárního síta). Proteiny se při SDS-PAGE separují pouze podle jediné vlastnosti: molekulové hmotnosti. Ulrich K. Laemmli University of Geneva 8 Zviditelnění proteinů separovaných PAGE - nespecificky: obarvení všech proteinů v gelu proteinovými barvivy - stříbrem, „coomassie brilliant blue“ 9 specificky: - westernový přenos (=„immonoblotting“), tj. detekce proteinů rozdělených elektroforézou protilátkami - přenos rozdělených proteinů z gelu na pevný filtr - navázání protilátky na příslušný antigen při promývání filtru roztokem specifické primární protilátky (protilátka musí rozeznat lineární epitop – protein je obvykle denaturován) - zviditelnění protilátky na filtru např. radioaktivní sondou nebo sekundární protilátkou konjugovanou s určitým enzymem Zviditelnění proteinů separovaných PAGE 10 Zviditelnění proteinů westernovým přenosem 11 - konkrétní epitopy proteinů se detekují pomocí specifických protilátek, které slouží jako sondy - protilátky mohou být: Monoklonální - získávají se z hybridomů Polyklonální - získávají se z krve imunizovaných zvířat Základem jsou protilátky (Ab) 12 Příprava monoklonálních Ab Produkuje se pomocí hybridomů - hybridom vzniká fůzí: - nádorové leukemické buňky → nesmrtelnost - B-lymfocytu imunizovaného zvířete → produkce Ab - drahá příprava, ale na konci téměř neomezený zdroj Ab - specifické pouze k jednomu epitopu 13 Příprava polyklonálních Ab Získávají se ze séra imunizovaných laboratorních zvířat - relativně levná a rychlé příprava - reagují s více epitopy 14 Sendvičové uspořádání Ab - primární Ab se váže na specifický epitop antigenu - značená sekundární Ab se váže na primární protilátku - výhoda – výroba drahých značených Ab pouze proti malému počtu primárních Ab (anti-myší IgG, anti-králičí IgG,…) Primary antibody Antigen 15 - radioaktivně - křenová peroxidáza (horseradish peroxidase – HRP) - alkalická fosfatáza - biotin - fluorescenční značka Typy značení sekundární Ab 16 - kolorimetrické metody - chemiluminiscence - bioluminiscence - chemifluorescence - fluorescence / autoradiografie - zlatem značené Ab Detekční metody 17 - rozdělení proteinů daného vzorku gelovou elektroforézou - přenos proteinů na membránu („westernblotting“ - přesávka) - inkubace membrány se specifickou protilátkou - inkubace membrány se sekundární značenou protilátkou - detekce navázané protilátky Imunobloting 18 - kapilární přenos - elektroforetický přenos - vakuový přenos Způsoby přenosu („blotingu“) 19 Výsledek Westernova přenosu Sample: HeLa cell lysate. Antibody: Specific for human CDK7 protein 20 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Využívá 2 Ab proti jednomu proteinu (2 různé epitopy), jedna Ab je vázaná na nosiči – nejčastěji na stěně reakční nádoby 21 - vysoká citlivost – pg/ml => potřeba malého množství vzorků - možnost využití poloautomatických systémů ELISA 22 Provedení ELISA Vazba proteinu na 1. Ab Promytí a vazba 2. Ab na protein Promytí a detekce 2. Ab 23 - modifikace ELISA - „ELISA v roztoku“ AlphaLISA 24 Imunoprecipitace - technika izolace specifických proteinů z proteinových směsí prostřednictvím protilátek - protilátky jsou v komplexu se svými antigeny odděleny od ostatních molekul pomocí proteinů A nebo G (zdroj bakterie), které vážou imunoglobuliny a současně jsou imobilizovány na pevném podkladu („beads“) - proteiny A a G se vážou na oblast Fc těžkých řetězců - oblast Fab je stále k dispozici pro vazbu antigenu 25 Využití imunoprecipitace Přímá - protilátka je imobilizována na pevném podkladu (např. paramagnetických nebo agarózových/nemagnetických kuličkách), váže antigen a vysráží jej ze směsi Nepřímá - protilátka je volně rozpustná, váže antigen ze směsi, následně jsou přidány kuličky pokryté proteinem A nebo G a dojde k vysrážení antigenu Postup: - lýze buněk - inkubace buněčných extraktů s protilátkou - precipitace - varem se cílové proteiny oddělí od imunoglobulinů a kuliček - elektroforéza, western 26 (např. ChIP = Chromatin Immunoprecipitation) Detekce DNA/RNA vazebných míst 27 Izolace specifických proteinů (tzv. pull-down) 28 Měření aktivity specifických proteinů (např. kinázové assaye) 29 Použití imunoprecipitace pro studium meziproteinových interakcí technika kombinující imunoprecipitaci za nativních podmínek a westernový přenos („co-immunoprecipitation“) Postup: - precipitace cílového proteinu z buněčných extraktů protilátkou za takových podmínek, které neničí vazby mezi proteiny - cílový protein se precipituje v komplexu se svými přirozenými partnery - purifikované komplexy se denaturují a podrobí SDS-PAGE - přítomnost současně precipitovaných partnerských proteinů se stanoví westernovým přenosem IP co-IP 30 Imunohistochemie - určuje, ve kterých buňkách je daný protein přítomen (obdoba hybridizace nukleových kyselin in situ) - určuje, ve které části buňky je daný protein přítomen (membránový, cytoplazmatický, jaderný) – lokalizace naznačuje funkci - buňky se fixují, penetruje se membrána a inkubují se s konkrétní Ab 31 Izoelektrická fokusace - varianta elektroforézy, kde je podpůrným médiem polyakrylamidový gel obsahující směs amfolytů Amfolyty: - polymery o nízké molekulové hmotnosti, které mají různé poměry pozitivně nabitých aminoskupin a negativně nabitých karboxylových skupin - při elektroforéze se amfolyty rovnoměrně rozdělují v gelu podle náboje a tak v něm vytvářejí gradient pH Princip: - proteiny se pohybují gelem s velkými póry (nenastává efekt síta) a jsou vystaveny gradientu pH - změnou pH se mění iontový náboj, který proteiny nesou - protein se dostane do oblasti takového pH, při kterém nemá žádný náboj (je v izoelektrickém bodu) a jeho pohyb se zastaví - protein je soustředěn do velmi ostrého proužku - používá se jako první krok dvourozměrné elektroforézy 32 33 Dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu - pro dělení komplexních směsí proteinů, které nelze řádně rozdělit jednorozměrnou elektroforézou - možno srovnat úplný proteom buněk vystavených různým podmínkám, buněk zdravých a nemocných, zjistit změny proteomu v průběhu buněčné diferenciace, apod. 34 Dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu Postup: - nativní proteiny se dělí v úzkém pásu gelu podle elektrického náboje izoelektrickou fokusací - pruh gelu s proteiny se umístí na desku gelu a zapojí se elektrické pole jako u SDS-PAGE ve směru kolmém ke směru fokusace - každý protein má na ploše gelu jedinečné místo Výhoda: vysoká rozlišovací schopnost - více než 1000 proteinů/gel 35 Dvourozměrná elektroforéza proteinů 36 37 Interpretace 2D-elektroforetogramů - obtížná - výsledky nepřehledné - nutné opakování - analýza obrazu, software Hlavní proteomické přístupy dvourozměrná elektroforéza definování proteinů rozdělených v gelu: - určení sekvence aminokyselin - westernový přenos - štěpení eluovaných proteinů proteolytickým enzymem a stanovení molekulové hmotnosti vzniklých peptidů hmotnostní spektrometrií, srovnání hmotnostních spekter s databázemi 38 Hmotnostní spektrometrie umožňuje kvalitativní a kvantitativní analýzu látek principem je tvorba pozitivně či negativně nabitých částic (iontů), které se rozliší na základě poměrů jejich hmotnosti a náboje (m/z) a poté jsou zaznamenány detektorem výsledkem je hmotnostní spektrum, které graficky znázorňuje četnost iontů na hodnotě m/z 39 Hmotnostní spektrometr obsahuje iontový zdroj, ve kterém dochází k ionizaci a převodu vzorku do plynné fáze hmotnostního analyzátoru, kde probíhá separace iontů na základě poměru m/z detektoru vyhodnocovacího zařízení 40 Využití hmotnostní spektrometrie hlavní výhoda - vysoký stupeň analytické spolehlivosti - využití základní výzkum/medicína diagnostika identifikace metabolických onemocnění (analýza obsahu metabolitů a malých molekul v moči a krvi) identifikace alergenů v potravě identifikace infekčních agens (např. bakteriálních ribozomových proteinů) analýza bioaktivních peptidů a malých regulačních molekul (např. hormonů) analýza toxických látek (pesticidů, bakteriálních toxinů, kontaminantů) léčiv a drog v biologických tekutinách, potravinách a životním prostředí expresní profilování