1_3 Enzymy v diagnostice 1_Patobiochemie 2018 108 Plazma tvoří 55% naší krve a sestává se 91% z vody. Obsahuje více než 120 různých proteinů, které přebírají životně důležité funkce, jakými jsou např. obranyschopnost organismu před infekcemi a srážlivost krve při poraněních. 1_Patobiochemie 2018 109 TEST 1_3 ENZYMY V KLINICKÉ DIAGNOSTICE Druhy enzymů v plasmě: normálně fyziologicky přítomny v plasmě pouze enzymy kaskády krevního srážení nebo cholinestersa (fyziologická funkce) přítomny v plasmě (jsou uvolňované z buněk), ale nemají zde funkci, v plasmě v nízké, nepatrné koncentraci Buněčné a sekreční enzymy: Buněčné enzymy -enzymy metabolických dějů, lok. v cytoplasmě nebo organelách – mitochondriích, při poškození buněk se uvolňují do krevního oběhu, většina enzymů v klinicko-biochemické diagnostice (AST, ALT, CK, LD, GMT) Sekreční enzymy – jsou sekretovány buňkami žláz (slinné žlázy, pankreas) do extracelulárního prostoru, NE do plasmy! (typicky –trávicí enzymy), při onemocnění orgánu se tyto enzymy dostávají do krevního oběhu… (amylása, pankreatická lipáza) V krvi zdr. člověka – koncentrace obou typů enzymů velmi nízká X v buňce asi 103 -10⁴x vyšší - malé množství enzymů v plasmě je důsledkem přirozené obměny buněk. 1_Patobiochemie 2018 110 Příčiny zvýšené aktivity, koncentrace enzymů v plasmě 1. Patologické ↑ konc. enzymů v plasmě – důsledek zvýšené permeability buněčné stěny - poškozena chemickými látkami, anoxií, hypoxií, viry, zánětem. Může vést k degradaci buňky. Při odumírání, zániku buňky → zvyš.aktivity fosfolipas, ty odbourávání fosfolipidů cytopl.membrány → perforace → uvolnění obsahu + enzymy do extracelulárního prostoru → plasmy 2. Příčinou zvýšené hladiny E, zvýšená syntéza E – není patol., ale souvisí se stavem v org : Př. růst kostí ↑ aktivitu osteoblastů ↑ v krvi alkalická fosfatasa U dětí ALP 3x-7x vyšší než dospělých Léky, alkohol ↑ aktivitu enzymů (jaterních) – ALP, GMT apod. 1_Patobiochemie 2018 111 Příčiny zvýšené koncentrace enzymů v plasmě 3. Uvolňování z buněk nesouvisející s smrtí buňky nebo zvýš. syntézou – Př. ethanol uvolňuje expresi mitochondriální AST v hepatocytech, její přesun na povrch hepatoctů → uvolnění do krve. Př. Příjem potravy → uvolnění střevní ALP →do lymfy, ↑ v krvi . Př. Jaterní enzymy jsou vázány na povrch hepatocytů, mohou být uvolňovány do krve…. 4. Některé případy zvýš.hodnot – nedostatečné odstraňování z cirkulace. Př. malé enzymy – amylasa, lipasa – odstraňovány z cirkulace glomerulární filtrací. Porucha fce ledvin, renální selhání ↑ jejich hodnoty v krvi. Tvorba komplexů E-Ab (tzv. makroenzym), poločas rozpadu Ig- 3týdny 1_Patobiochemie 2018 112 Časový průběh nárůstu a poklesu enzymové aktivity v plasmě Časový průběh – ovlivněn řadou faktorů: Při apoptose se defekty buněč. membrány prohlubují s časem. Důsledek- z buňky se uvolňují nejdříve malé molekuly E, později velké E. Př. při infarktu myokardu(IM) – nejdříve v plasmě AST a CK (malé molekuly), později LD (větší). Při IM – koncentrace CK v plasmě je úměrná velikosti ložiska zasaženého IM. Když příčina poškození buněk vymizí, koncentrace enzymu přetrvává nějakou dobu, poté klesá. Př. akutní hepatitida se dá odlišit od toxického poškození jater. Při vir. hepatitidě – imunologické poškození buněk, delší setrvávání zvyš. koncentrace enzymu, tox. poškození – rychlejší návrat hladiny enzymu k normálu (GGT,AST, ALT). 1_Patobiochemie 2018 113 Aktivita enzymů v plasmě Gradient koncentrace enzymů mezi buňkou a plasmou – uvnitř hepatocytu v cytoplasmě = vyšší koncentrace AST než ALT , LD zde minimálně. • Př. při poškození hepatocytu - nejrychlejší nárůst AST, ale LD minimálně. • Př. myokard – vysoká konc.CK, nízká LD, poškození→ rychlý vzestup CK v plasmě Koncentraci enzymu v plasmě určuje rychlost jeho odstraňování. nízkomolekulární –glomerul. filtrace ostatní (většina) - inaktivovány v plasmě, odstraněny buňkami RES přes receptory, endocytóza 1_Patobiochemie 2018 114 Definice - biologický poločas enzymu Dobu, po kterou je enzym v plasmě zvýšen určuje jeho biologický poločas . Biologický poločas enzymu – doba, za kterou by množství enzymu kleslo na polovinu, pokud by nebyl enzym ze tkání doplněn Enzymy Biol.poločas ALP 3-7 dny AMS 9-18 hod ALT 2 dny AST 12-14 hod CHS 10 dní CK 10 hod GMT 3-4 dny LDH1(HHHH) 4-5 dní LDH5(MMMM) 10 hod 1_Patobiochemie 2018 115 Subcelulární lokalizace některých enzymů v jaterní buňce Hlavní diagnostické enzymy jaterní buňky jsou lokalizovány v různých oblastech hepatocytu. ALT a cytoplazmatický isoenzym AST se nachází v cytoplazmě. • Při membránovém poškození (např. virovém, nebo chemickou látkou) jsou tyto enzymy uvolněny a dostávají se do sinusoidů. Důsledkem je zvýšení hladiny v plazmě. • Mitochondriální AST je primárně uvolněna při poškození mitochondríí, např. při působení alkoholu. • ALP a GGT se nachází na kanalikulárním povrchu hepatocytů a uvolňují se zejména při cholestáze v důsledku působení žlučových kyselin na membránu. • GGT se nachází rovněž v mikrosomech, kde je indukována některými léky. Podávání těchto léků pak zvyšuje hladinu GGT v plazmě. 1_Patobiochemie 2018 116 TEST Využití enzymů v klinické diagnostice Detekce poškození tkáně Identifikace počátku poškození tkáně Stanovení rozsahu poškození Odhad závažnosti poškození buněk Diagnóza základních onemocnění Specifikace diagnózy v rámci poškozeného orgánu 1_Patobiochemie 2018 117 TEST Upřesnění diagnózy • Informace vhodná pro upřesnění diagnózy se získá: • - z hodnoty katalytické koncentrace enzymu v tělní tekutině (přímá úměra mezi stupněm poškození orgánu a zvýšenou aktivitou enzymy v krvi). • - s přítomného spektra enzymů v krvi (např. při těžkém poškození jaterního parenchymu doprovázeném nekrózou buněk je zvýšení aktivity enzymů v krvi následné: LD > AST > ALT). • - z výpočtu poměru aktivit enzymů (např. dle poměru aktivit AST/ALT v séru lze odlišit počáteční obstrukční ikterus (AST/ALT < 1) od aktivní chronické hepatitidy (AST/ALT > 1). U akutních onemocnění lze z poměru aktivit enzymů s krátkým a dlouhým biologickým poločasem určit fázi onemocnění nebo předpovědět průběh onemocnění, např. u akutní hepatitidy pokles poměru AST (poločas 12 h)/ALT (poločas 2 dny) napomáhá rozlišení typu hepatitidy. • - z monitorování enzymové aktivity (mechanismus uvolňování enzymů do krve z poškozené tkáně a jejich clearance je charakteristický typickými kinetickými křivkami aktivity, z jejichž průběhu je možné odvodit časový úsek, během kterého je onemocnění přítomné nebo lze určit fázi onemocnění) • - ze stanovení isoenzymů. 1_Patobiochemie 2018 118 Makroenzymy • Makroenzymy jsou komplexy tvořené enzymem navázaným imunoglobulin, některý lipoprotein, protein nebo fragment buněčné membrány. • Obecně mají makroenzymy větší molekulovou hmotnost a delší poločas v krvi. Přítomnost makroenzymu v séru může ovlivnit jeho analytické stanovení nebo způsobit chybnou interpretaci výsledku stanovení. • Známým příkladem je makroamylasemie, kdy amylasa tvoří komplex jinými makromolekulami a není tudíž filtrovatelná do moče. V důsledku toho se akumuluje v krvi. Hladina amylasy je pak v krvi zvýšená, aniž by docházelo k jejímu zvýšenému uvolňování z poškozené tkáně (asi 1-3% pacientů se zvýšenou hladinou sérové amylasy). • Protože makroamylasa neprostupuje do moče, hladina amylasy moči je v tomto případě normální nebo snížená, na rozdíl od situace při např. pankreatitidě, kdy zvýšená hladina amylasy v séru je provázena i zvýšením amylasy v moči. 1_Patobiochemie 2018 119 Makrolipáza (makroforma enzymu) • byla prokázána u 2 ze 20 pankreatitid se zvýšenou hodnotou lipázy a tvořila 10–18 % celkové aktivity. Poprvé byla popsána v roce 1987 u nonHodgkin lymfomu, kdy katalytická aktivita lipázy byla zvýšena v séru 7×. Výskyt makrolipázy je v mnoha případech provázen i makroamylázou či onemocněními autoimunitního charakteru, např. céliakií. 1_Patobiochemie 2018 120 Tkáňová distribuce diagnosticky významných enzymů • Poškozená tkáň může být diagnosticky nepřímo lokalizována buď ze stanovení aktivity tkáňově specifických enzymů, nebo isoenzymů v krvi. • Tkáňově specifické enzymy se vyskytují přednostně v určité tkáni nebo mají v dané tkáni vysokou aktivitu. Příklady tkáňově specifických enzymů jsou uvedeny v následující tabulce. • Exprese isoenzymů je většinou pro každou tkáni určena geneticky. Proto stanovení isoenzymů v krvi umožňuje identifikovat poškozenou tkáň, z které pocházejí (např. pankreatická lipasa, CKMB, LD1). 1_Patobiochemie 2018 121 Klinicky významné enzymy TEST Aminotransferasy zajišťují konverzi aminokyselin a -ketokyselin přenosem aminoskupiny, donor a akceptor aminoskupiny je 2-oxoglutarát/ L-glutamát • Alaninaminotransferasa, ALT – donorem –NH2 Ala za vzniku pyruvátu, marker- játra (virová hepatitida, alkohol, hepatopatie …) • Aspartátaminotransferasa, AST – donorem – NH2 Asp za vzniku oxalacetátu, marker poškození - játra, srdce, infarkt myokardu, svalová poškození 1_Patobiochemie 2018 122 ALT alaninaminotransferasa hepatopatie;srdeční onemocnění;poměr AST / ALT > 1 alkoholické jaterní choroby, infarkt myokardu, AST / ALT < 1 virová hepatitida AST aspartátaminotransferasa infarkt myokardu; hepatopatie; krevní choroby; svalová poškození Klinicky významné enzymy -amylasa, AMS syntetizována ve slinivce, štěpí -1,4-glykosidickou vazbu glykogenu a škrobu za vzniku oligosacharidů, produkovaná slin.žlázami a slinivkou břišní, liší se cukernou složkou, izoenzymy S/P, příčiny –poškození žlaz (např. akutní pankreatitida), snížené vylučování enzymu ledvinami alkalická fosfatasa, ALP hydrolýza monoesterů kyseliny fosforečné s alkoholem, fenolem, glycinem – nespecifická - štěpí vazbu P-O-C, P-O-P, P-S, P-N, má několik izoforem podle tkáně syntézy – kostní, jaterní, placentární, střevní, optimum v alkalické oblasti, marker - poškození kostí, jater kyselá fosfatasa, ACP • vlastnosti ALP, optimum v kyselé oblasti, marker- prostata 1_Patobiochemie 2018 123 Další klinicky významné enzymy kreatinkinasa , CK katalyzuje reverzibilní fosforylaci kreatinu na kreatinfosfát za spotřeby ATP, marker poškození svalů, srdce Laktátdehydrogenasa, LDH isoformy (tkáň) srdce, játra, katalysuje reakci: laktát + NAD+ ↔ pyruvát + NADH + H+ (reversibilní), není specifická, poškození tkáně dle isoformy – elektroforeticky (plicní embolie LDH3,infarkt myokardu LDH1,2, hepatopatie + nemoci koster.svalstva LD4,5). 1_Patobiochemie 2018 124 LD (S; konc. katal. akt. [µkat/l] abs. spektrofotometrie) Výpovědní hodnota •LD se vyskytuje v cytoplasmě všech buněk, koncentrace ve tkáních je asi 500x vyšší oproti koncentraci v séru. Proto i při minimálním poškození buněčné mebrány dochází k elevaci LD v séru. •Je nespecifickým ale velmi citlivým markerem poškození buněk (především hepatocytů, myocytů, kardiomyocytů, erytrocytů, leukocytů), lze ji použít jako obecný screeningový marker buněčné lýzy. •Dříve používané elektroforetické vyšetření izoenzymů LD k rozlišení etiologie je v současné době nahrazeno specifičtějšími vyšetřeními (haptoglobin, troponiny, jaterní enzymy atd.). https://www.ikem.cz/plm_lp/_LP_02290-L0000006.htm Klinicky významné enzymy • Příčiny zvýšené aktivity v séru • AST aspartátaminotransferasa infarkt myokardu; hepatopatie; krevní choroby; svalová poškození • ALT alaninaminotransferasa hepatopatie;srdeční onemocnění;poměr AST / ALT > 1 alkoholické jaterní choroby, infarkt myokardu, AST / ALT < 1 virová hepatitida • LD laktátdehydrogenasa LD1,2 – infarkt myokardu, hemolytické anemie;LD3 – plicní embolie;LD4,5 – hepatopatie, nemoci kosterního svalstva • HBD hydroxybutyrátdehydrogenasa aktivita podjednotek H (LD1,2), infarkt myokardu • GGT gama-glutamyltransferasa hepatopatie (zánět, alkohol, léky);test chronické konzumace alkoholu;cholestáza • ALP alkalická fosfatasa jaterní isoenzym – nemoci žlučových cest;kostní isoenzym – nemoci kostí (Pagetova choroba, rachitis, nádory), fyziologicky zvýšen v období růstu • ACP kyselá fosfatasa prostatický isoenzym – tumory prostaty;kostní isoenzym – metastázy tumorů do kostí,marker osteoporózy • CK kreatinkinasa CK-MB – především infarkt myokardu;ale též při regeneraci kosterních svalů, chronických svalových onemocnění a akutním renálním selhání; • CK-MM – nemoci kosterního svalstva,intramuskulární injekce, tělesná aktivita • AMS amylasa (Mr ~ 50 000) pankreatický isoenzym – akutní pankreatitida;slinný isoenzym – parotitida • LPS lipasa akutní pankreatitida;akutní zvrat chronické pankreatitidy • PSA prostatický specifický antigen karcinom prostaty • Příčiny snížené aktivity v séru • CHE cholinesterasa chronické hepatopatie,alkoholicko-toxická hepatitida (intoxikace organofosfáty);ukazatel jaterní proteosyntézy 1_Patobiochemie 2018 125 TEST 1_Patobiochemie 2018 126 Screening • Screening = metoda vyhledávání časných forem nemocí nebo odchylek od normy v dané populaci formou testů • provádí se u všech novorozenců narozených na území ČR • rychlá diagnostika a hlavně včasná léčba dědičných metabolických poruch • potvrzení / vyvrácení onemocnění ještě před jeho projevy a poškozením dítěte Metoda odběru kapky krve z patičky na novorozeneckou screeningovou kartičku 1_Patobiochemie 2018 127 Novorozenecký screening (NS) je aktivní a celoplošné (=celostátní) vyhledávání chorob v jejich časném, preklinickém stadiu tak, aby se tyto choroby diagnostikovaly a léčily dříve, než se stačí projevit a způsobit dítěti nevratné poškození zdraví. Pod pojem novorozenecký screening lze v širším slova smyslu zahrnout i pravidelné klinické vyšetření dětským lékařem při pátrání po vrozených vývojových vadách různých orgánů či vrozených infekcích, vyšetření ortopedem při vyhledávání vrozené poruchy vývoje kyčlí (dysplazie), vyšetření očním lékařem při vyhledávání vrozeného očního zákalu (katarakty), vyšetření sluchu při vyhledávání vrozené hluchoty či ultrazvukové vyšetření ledvin k časnému záchytu vrozených vývojových vad močového ústrojí. VÝVOJ NOVOROZENECKÉHO SCREENINGU 1962 -zakladatel - prof. Robert Guthrie – zavedl bakteriální test pro včasné rozpoznání PKU a hyperfenylalaninemie v USA (využití kmene bakterií Bacillus subtilis, množí se v prostředí v vysokou koncentrací fenylalaninu) •od r. 1969 Guthrieho metoda i u nás, celoplošný screening až od r. 1975 • od r. 1985 - rozšíření screeningu o vyšetření kongenitální hypotyreózy (CH) –jodový deficit plodu, těžké pošk.vývoje mozku dítěte • od r. 2006 - přibývá vyšetření kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) – dříve tzv. adrenogenitální syndrom • 2009 – změny a rozšíření screeningu (dle Věstníku MZ ČR) - screening rozšířen o screening cystické fibrózy 1_Patobiochemie 2018 128 • V užším slova smyslu se novorozeneckým screeningem rozumí tzv. novorozenecký laboratorní screening (NLS), který je předmětem těchto webových stránek. Spočívá v diagnostice screenovaných onemocnění na základě stanovení koncentrace specifické látky (event. i průkazu genové mutace) v suché kapce krve na filtračním papírku – tzv. novorozenecké screeningové kartičce, která je odebírána všem novorozencům na území státu. • Pravděpodobnost, že právě jeden konkrétní vyšetřovaný novorozenec bude trpět některým z výše uvedených onemocnění, je velmi malá. Stane se tak pouze u jednoho dítěte z přibližně 1150 narozených. Právě jemu ale novorozenecký screening pomůže uchránit zdraví, někdy i život, a z hlediska ekonomie zdravotnictví sníží náklady na jeho léčbu, protože náklady na léčbu komplikací vzniklých z pozdě diagnostikované choroby bývají mnohem vyšší. • 1_Patobiochemie 2018 129 http://www.novorozeneckyscreenin g.cz/historie-ns-cr Metabolická příručka, Laboratorní příručka Diagnostických laboratoří Ústavu dědičných metabolických poruch VFN a 1. LF UK - udmp.lf1.cuni.cz/file/5673/Metabolická%20příručka%20verze%2002.pdf Novorozenecký screening (NS) = aktivní celoplošné vyhledávání choroby v jejím preklinickém stadiu. Analýza suché kapky krve na filtračním papírku odebrané standardním způsobem z patičky všem novorozencům. Definice: 1_Patobiochemie 2018 130 Hyperfenylalaninémie/ fenylketonurie • Charakteristika: nedostatečná přeměna Phe na Tyr • Příčina: 1) Deficit fenylalaninhydroxylázy 2) Porucha metabolismu koenzymu tetrahydrobiopterinu • Výskyt: asi 1:10 000, patří mezi nejčastější DPM • Existuje novorozenecký screening- u nás od r. 1975 celoplošně – Guthrieho test • Tandemová hmotnostní spektrometrie 1_Patobiochemie 2018 131 Odběr krve na novorozenecký screening 1_Patobiochemie 2018 132 1_Patobiochemie 2018 133 Předpoklady pro provádění celoplošného screeningu jsou shrnuty v následujících bodech: • Vyšetřovaná choroba musí být jasně definována, tj. diagnostikovatelná. • Choroba představuje významný zdravotně sociální problém. • Choroba je častá, má v dané populaci určitou incidenci. Hranice incidence je však relativní a je ovlivněna především faktory ekonomickými. Ve vyspělých zemích lze v současné době spatřovat tuto hranici v incidenci 1:50 000 – 1:100 000. • Zachycení choroby v jejím časném, presymptomatickém stadiu umožňuje taková léčebná opatření, která zásadním způsobem pozitivně ovlivní průběh choroby či dokonce sníží úmrtnost na ni. Léčebná opatření musí být běžně dostupná a zajistitelná pro všechny zachycené jedince. Péče o pacienty je většinou soustřeďována do specializovaných center s cílem dosažení maximální efektivity a kvality léčby. • Existuje obecně uznaný screeningový test, tj. choroba je v preklinickém stadiu detekovatelná obecně uznaným laboratorním testem v suché kapce krve s obecně přijatou hranicí negativity (tzv. "cut-off" limit) a obecně akceptovatelnou zátěží zdravé populace (frekvence opakování odběru NS pro nejasný výsledek - tzv. "recall-rate“ a falešná pozitivita, vyjádřená pozitivně prediktivní hodnotou - PPV).Pozn.: Parametry hodnoty "cut-off" limitu, „recall-rate“, falešné pozitivity a falešné negativity jsou hlavními měřítky věrohodnosti screeningu. • Společnost je schopna zajistit provádění laboratorního testu u všech svých novorozenců po stránce organizační a ekonomické. • Efektivita a účinnost NS je předmětem průběžného vyhodnocování. • Díky vědeckému a technologickému pokroku se počet onemocnění, která je možno diagnostikovat z nepatrného množství krve v suché kapce krve na filtračním papírku, navýšil na několik desítek. 1_Patobiochemie 2018 134 V České republice se od 1. 6. 2016 vyšetřuje 18 onemocnění: 1. vrozená snížená funkce štítné žlázy (kongenitální hypotyreóza - CH) 2. vrozená nedostatečnost tvorby hormonů v nadledvinách (kongenitální adrenální hyperplazie - CAH) 3. vrozená porucha tvorby hlenu (cystická fibróza - CF) 4. dědičné poruchy látkové výměny aminokyselin* 1. vrozená porucha látkové výměny aminokyseliny fenylalaninu (fenylketonurie - PKU a hyperfenylalaninemie - HPA) 2. argininémie (ARG) 3. citrulinémie I. typu (CIT) 4. vrozená porucha látkové výměny větvených aminokyselin (leucinóza, nemoc javorového sirupu - MSUD) 5. homocystinurie z deficitu cystathionin beta-syntázy (CBS), pyridoxin non-responzivní forma 6. homocystinurie z deficitu methylentetrahydrofolátreduktázy (MTHFR) 7. glutarová acidurie typ I (GA I) 8. izovalerová acidurie (IVA) 5. dědičné poruchy látkové výměny mastných kyselin* 1. deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem (deficit MCAD) 2. deficit 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin s dlouhým řetězcem (deficit LCHAD) 3. deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin s velmi dlouhým řetězcem (deficit VLCAD) 4. deficit karnitinpalmitoyltransferázy I (deficit CPT I) 5. deficit karnitinpalmitoyltransferázy II (deficit CPT II) 6. deficit karnitinacylkarnitintranslokázy (deficit CACT) 6. dědičná porucha přeměny vitamínů* 1. deficit biotinidázy (BTD) *Metodika tandemové hmotnostní spektrometrie použitá pro vyšetřování dědičných metabolických poruch může zachytit dalších přibližně 20 onemocnění. 1_Patobiochemie 2018 135