10. Nádorové markery • Tumor, tumorové markery. • Základní charakteristika nádorové buňky. • Strategie laboratorních vyšetření. • Požadavky na ideální nádorový marker. • Používané tumorové markery. 10_narodové markery 2018 1 Nádory (tumory)  Nádor je patologický stav (nemoc) v důsledku porušené kontroly buněčného dělení – příčinou porušené regulace je genetická změna nejčastěji 1 somatické (ale i zárodečné) buňky – buňky vycházející z patologického klonu se nekontrolovaně množí (různě rychle) a posléze event. šíří i na další sekundární místa (metastázy)  podle rychlosti proliferace rozlišujeme nádory -benigní – většinou rostou jen v místě vzniku, nejsou agresivní, zachovávají si diferenciaci -maligní – rostou rychle, invazivně a šíří se na další místa, nediferencované  Všechny nádory jsou důsledkem genetické poruchy, a to klíčových genů kontroly buněčného cyklu - protoonkogenů – normálně podporují dělení a růst buněk, pokud mutovány dělění je nekontrolované - supresorových genů – normálně kontrolovaně potlačují dělení, pokud mutovány,umožňují nekontrolované dělení - DNA reparačních genů – normálně opravují DNA opravitelné změny, pokud mutovány neopravená změna může být přenesena do dceřinných bb. – pouze některé jsou ovšem zároveň dědičné (tzv. familiární) = mutace v zárodečné buňce – většina nádorů jsou náhodné, tzv. sporadické = mutace v somatické buňce 2 TEST 10_narodové markery Nádory – vznik  Genetická změna může vzniknout – chybou při DNA replikaci a dělení buňky – působením zevních faktorů (karcinogenů) --fyzikálních – např. UV a ionizující záření --chemických – organické látky, toxiny,těžké kovy --biologických – některé RNA a DNA viry  Nádor zpravidla původně vychází z mutací 1 buňky (monoklonální), – proces nádorové transformace je ovšem vícestupňový (tj. postupná kumulace několika mutací), takže se postupně stává geneticky heterogenní, --nádor přechází ze stadia prekancerózy, přes benigní až k malignímu --Histologicky – tj. podle toho z jaké tkáně pochází – rozlišujeme 3 sk. --– epiteliální --kůže, sliznice, výstelky vývodů (papilom, adenom (b.), karcinom (m.) –--- mesenchnymální --pojivo, endotel, sval. tkáň, hematopoetická a lymfatická tkáň, kosti (fibrom, hemangiom, myom (b.), sarkom, lymfom, leukemie (m.), –---- neuroektodermové -- CNS a periferní nervy, pigmentové névy (astrocytom, gliom, blastom, neurinom, melanom) 310_narodové markery Mutageny/karcinogeny  fyzikální – UV (karcinoma basalion kůže, melanom), – ionizující záření a RTG záření (leukemie, št. zláza, kosti, …)  chemické -polycyklické aromatické a chlorované uhlovodíky, - aromatické aminy, nitrosaminy -těžké kovy, -mykotoxiny, – některé jsou toxické až po metabolické transformaci v organizmu, popř. při tepelném zpracování (potrava) ---nádory GIT jako důsledek expozice karcinogenům v dietě, nádory plic jako důsledek kouření, alkoholická cirhóza  biologické = inkorporace virového genomu do hostitelského, opět v kritických místech – DNA viry herpes (EBV - lymfomy), hepdnaviry (HBV – hepatocelulární ca), papovaviry (papilomaviry – ca děložního čípku, hrtanu, ústní dutiny), adenoviry – RNA viry – retroviry (HIV - Kaposiho sarkom, B-lymfom, HTLV – T-buněčná leukemie) TEST 10_narodové markery 4 Které geny jsou změněny během kancerogeneze?  nádor není monogenní onemocnění odhaduje se, že pro vývoj nádoru je nezbytných 4- 7 událostí (zásahů) konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze změněny jsou desítky, obecně existuje šest základních vlastností plně maligního nádoru: 510_narodové markery Šest získaných vlastností maligního nádoru získaná schopnost příklad 1. Soběstačnost v produkci růstových signálů aktivace H-ras 2. Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB 3. Poškození apoptózy produkce IGF 4. Neomezený replikační potenciál aktivace telomerázy 5. Posílení angiogeneze produkce VEGF 6. Tvorba metastáz inaktivace E-kadherinu Nestabilita genomu jako podmínka akumulace všech nutných změn. 6 TEST 10_narodové markery Klasifikace nádorů 710_narodové markery Proces nádorové transformace 810_narodové markery Růst tumoru 910_narodové markery Růst tumoru: další faktory ovlivňující buněčný cyklus 1010_narodové markery Růst nádoru: další faktory ovlivňující buněčný cyklus 1110_narodové markery Imunitní systém vs. nádor 1210_narodové markery Hormonální stimulace 1310_narodové markery Invazivita nádoru 1410_narodové markery Metastázování 1510_narodové markery Některé následky nádorů 16 Hyperkalemie je zvýšení hladiny draslíku v krvi. Normální hodnoty jsou 3,8–5,0 mmol/l.[1Vzhledem k tomu, že kalemie závisí na stavu acidobazické rovnováhy, je třeba ji posuzovat ve vztahu k hodnotě pH Nádorová kachexie je syndrom progresivní ztráty tělesné hmoty, který způsobuje významnou morbiditu i mortalitu onkologických nemocných. Metabolické změny podmíněné aktivitou prozánětlivých cytokinů, vedoucí v konečném důsledku k vyčerpání svalové a tukové hmoty, jsou nezřídka přítomné již na počátku choroby, a proto je třeba považovat nádorovou kachexii za časný fenomén. 10_narodové markery 1710_narodové markery • Diagnostika nádorů • Vzhledem k tomu, že rakovina je v naší společnosti častým a obávaným onemocněním, je velká snaha ji pochopit a zdokonalovat diagnostiku a léčbu. • Léčba rakoviny závisí zejména na včasné diagnóze a rakovinné onemocnění diagnostikovat není vždy snadné. • klinická diagnóza bývá určena většinou až u nádoru velikosti asi 1cm - 1g, který obsahuje asi 109 buněk. • histologické vyšetření, zobrazovací metody (UZ, CT, NMR, PET, scintigrafii ) • Nádory často žádné příznaky nemají a dají se objevit jen drahými a zatěžujícími vyšetřeními, které nelze dělat každému pacientovi. • Zákonitě se objevila otázka: Dala by se zjistit přítomnost nádoru nějakým běžným vyšetřením, nejlépe z krve? • A lékaři zjistili, že u řady nádorů to do jisté míry opravdu lze. Prokázalo se, že přítomnost nádoru v těle bývá spojena se zvýšením koncentrace určitých látek, které umíme laboratorně vyšetřit ze vzorku krve. • Tyto látky byly nazvány tumor markery., nádorové markery 1810_narodové markery Vývoj maligního nádoru a jeho zachycení 1 µg 1 mg 1 g 10-100 g 1 kg HMOTNOST NÁDORU 103 106 109 1010-1011 1012 POČET NÁDOROVÝCH BUNĚK Preklinické stadium Diagnostický práh Včasná diagnóza Pozdní diagnóza NÁDOROVÉ MARKERY • Nádorové markery jsou molekuly převážně proteinového charakteru, které jsou přítomny v organismu v důsledku vzniku a vývoje maligního procesu. • Nazývají se též tumorové markery (TM), případně onkomarkery Rozlišovací schopnost nádorových markerů umožňuje v příznivých případech odhalit nádor o hmotnosti 1 mg, tedy asi 106 maligních buněk, zatímco klinická diagnóza bývá určena většinou až u nádoru velikosti asi 1cm -1g, který obsahuje asi 109 buněk. TEST 10_narodové markery 20 Tumorové markery jsou produkovány buď • samotným nádorem (pak se nazývají antigeny sdružené/asociované s nádorem) nebo • jinými tkáněmi jako odpověď na maligní proces v organismu (pak jde o indukované nádorové markery, např. proteiny akutní fáze). Lze rozlišit tumorové markery • celulární (vyskytují se v tkáni zhoubného nádoru) • humorální (vyskytují se v tělních tekutinách). Koncentrace tumorových markerů v séru má obvykle přímý vztah k typu a rozsahu onemocnění. 10_narodové markery 21 Klasifikace nádorových markerů 10_narodové markery 22 Ideální tumor marker by měl splňovat tato kritéria: • je produkován pouze u maligních onemocnění • je orgánově specifický • v biologických tekutinách je přítomen ve vysokých koncentracích (dostatečná senzitivita) • jeho hladina koreluje s velikostí tumoru • se stadiem choroby • s prognózou • s efektem léčby • umožňuje průkaz zbytkové nádorové tkáně • V současné době takovýto ideální marker není znám. 23 Doposud nebyl objeven žádný univerzální tumorový marker, ani specifita či senzitivita metod nedosahuje 100%. Znamená to tedy, že nezvýšená koncentrace nádorového markeru není ještě důkazem nepřítomnosti maligního onemocnění, a naopak pozitivní výsledek nemusí nutně znamenat zhoubný nádor. 10_narodové markery Dají se definovat i jako laboratorně prokazatelné známky v biologických tekutinách, tkáních nebo buňkách, pomocí kterých je možno prokázat: • riziko vzniku • přítomnost • prognózu • účinnost (škodlivost) terapie • vznik metastáz nebo reziduální choroby nádorového onemocnění. • Hlavní rolí nádorových markerů (v medicíně, i laboratorní) je • sledování průběhu choroby • sledování účinnosti terapie. TEST 10_narodové markery 24 Klasifikace nádorových markerů 10_narodové markery 25 TŘÍDĚNÍ NÁDOROVÝCH MARKERŮ • podle průkazu • podle chemické struktury • podle funkce • podle orgánové specifity 2610_narodové markery • podle průkazu • humorální - průkaz v tělních tekutinách • celulární - průkaz imunohistochemicky přímo v nádorové tkáni 27 TŘÍDĚNÍ NÁDOROVÝCH MARKERŮ Metodika stanovení solubilních markerů imunoenzymatická analýza pomocí komerčních setů 10_narodové markery • glykoproteiny • cukerné determinanty glykoproteinů • sacharidy • glykolipidy • polypeptidy • imunoglobuliny • polyaminy 28 Nádorové markery podle chemické struktury 10_narodové markery TEST • onkofetální antigeny • onkoplacentární antigeny • enzymy • hormony • sérové bílkoviny • receptory • ostatní 29 Nádorové markery podle funkce 10_narodové markery TEST 1) Onkofetální antigeny • látky vyskytující se ve vysokých koncentracích u plodu (na povrchu diferencujících se buněk) a při přítomnosti nádorového onemocnění u dospělých • u zdravých dospělých osob hladina velmi nízká • hladina koreluje s velikostí nádorové masy • stanovení má význam hlavně pro určení prognózy a kontrolu léčby • př.: CEA, AFP, CA, CYFRA 21-1, SCC, MCA, MSA, TATI 3010_narodové markery 2) Onkoplacentární antigeny • produkovány trofoblastickými buňkami placenty v těhotenství i za patologických podmínek a také některými germinativními (zárodečnými) Tu jako známka nádorové dediferenciace. • ↑ hladina svědčí o ↑ malignitě Tu a potenciálu tvořit metastázy • př.: hCG, SP-1 3110_narodové markery 3) Enzymy • můžeme je rozdělit na dvě skupiny: 1. enzymy uplatňující se hlavně při buněčném dělení Jejich hladina je při nadměrné proliferaci výrazně zvýšená, proto se uplatňují při určování prognózy a stadia choroby. 2. enzymy vyskytující se i ve zdravé tkáni, kde plní své biologické funkce Jsou většinou vysoce orgánově specifické, proto je používáme k určení primární lokalizace nádoru. • př: 1) TK (thymidinkinasa), 2) PSA, NSE (neuronspecifická enolasa), isoenzymy LD, ALP 3210_narodové markery 4) Hormony 1. produkovány endokrinními buňkami samotnými (např. kalcitonin u medulárního Ca štítné žlázy) nebo 2. ektopicky (ACTH u malobuněčného Ca plic) • používáme ke kontrole účinnosti léčby • př.: ACTH, ADH, PTH, kalcitonin, prolaktin 3310_narodové markery 5) Sérové bílkoviny • produkovány buď přímo nádorovými bb. nebo organismem ve zvýšené nebo snížené míře jako odpověď na nádorové bujení • nespecifické • využití hlavně pro monitoring • př.: β2-mikroglobulin, feritin, paraprotein 3410_narodové markery 6) Receptory • celulární markery • stanovení u hormonálně aktivních nádorů • důležité pro volbu a kontrolu léčby a pro určení prognózy • př.: estrogenové, progesteronové rec., Her2/neu, EGFR 3510_narodové markery 7) Ostatní a cirkulující buněčné elementy • tkáněmi produkované látky, které nelze zařadit do žádné z předchozích skupin • př.: TPA, TPS, CgA, neuropeptid Y, 5-HIOK, S-100b • cirkulující buněčné elementy (cirkulující nádorové buňky, cirkulující endotelové buňky a cirkulující endotelové prekursory). 3610_narodové markery 8) genetické abnormality Mimo obvyklé aplikace klasických (solubilních) nádorových markerů se zdají být klinicky užitečné jako nádorové markery i některé genetické abnormality a to především pro specifikaci abnormality nádorových buněk určující způsob léčby. Jde jednak o přímou detekci mutací v DNA, proteinové produkty onkogenů (např. c-myc, c-fos, kras, src), změny v jejich posttranslačních modifikacích v maligní tkáni nebo o "nové" genetické změny v maligní buňce (např. chromosomální rearrangement bcr-abl) nebo detekci mutací v tumor supresorových genech (BRCA1,BRCA2, p53). 10_narodové markery 37 Biologická povaha nádorových markerů-souhrn Nádorovým markerem rozumíme substanci přítomnou v nádoru nebo produkovanou nádorem nebo hostitelem jako odpověď na přítomnost tumoru. Tuto substanci lze využít k diferenciaci nádoru od normální tkáně, nebo uvažovat o přítomnosti tumoru na základě analýzy tělesných tekutin. Substanci lze měřit kvalitativně nebo kvantitativně metodami chemickými, imunologickými nebo metodami molekulární biologie. Mezi markery produkované tumorem patří: enzymy (např. LD, NSE, PSA,thymidinkinasa, prostatická kyselá fosfatasa), imunoglobuliny nebo jejich fragmenty či podjednotky (monoklonální imunoglobuliny, tzv. "paraproteiny"), hormony (např. hCG, PTH, ACTH, kalcitonin, gastrin, prolaktin, norepinefrin, epinefrin), fragmenty komplexních glykoproteinů, (např. CA19-9, CA15-3, CA125), fragmenty cytokeratinů (TPA, TPS, CYFRA21-1), onkofetální antigeny (AFP, CEA), molekuly receptorové povahy (estrogenový a progesteronový receptor, receptor pro interleukin 2, HER2/neu a EGF) a cirkulující buněčné elementy (cirkulující nádorové buňky, cirkulující endotelové buňky a cirkulující endotelové prekursory). Mimo obvyklé aplikace klasických (solubilních) nádorových markerů se zdají být klinicky užitečné jako nádorové markery i některé genetické abnormality a to především pro specifikaci abnormality nádorových buněk určující způsob léčby. Jde jednak o přímou detekci mutací v DNA, proteinové produkty onkogenů (např. c-myc, c-fos, k-ras, src), změny v jejich posttranslačních modifikacích v maligní tkáni nebo o "nové" genetické změny v maligní buňce (např. chromosomální rearrangement bcr-abl) nebo detekci mutací v tumor supresorových genech (BRCA1,BRCA2, p53). 10_narodové markery 38 • dobrá: kalcitonin - medulární Ca tyroidey PSA - Ca prostaty NSE - malobuněčný Ca plic hCG - Tu ze zárodečných buněk AFP - primární Ca jater, Tu ze zárodečných buněk • relativně dobrá: CA 19-9 - Ca pankreatu CA 125 - ovariální Ca CA 15-3 - mammární Ca • relativně malá: CEA, TPA 39 Nádorové markery podle orgánové specifity 10_narodové markery INDIKACE K VYŠETŘENÍ NÁDOROVÝCH MARKERŮ • screening , přítomnost • primární diagnostika a dif. diagnostika • staging (vznik metastáz..) • monitoring • prognóza • sledování účinnosti protinádorové léčby • Hlavní rolí nádorových markerů (v medicíně, i laboratorní) je • sledování průběhu choroby • sledování účinnosti terapie TEST 10_narodové markery 40 •screening - většina Tu markerů nevhodná. Omezeně lze použít u rizikových skupin: • AFP u jaterní cirhózy • kalcitonin, příp. RET onkogen v rodinách s MEN sy a u příbuzných pacienta s medulárním Ca thyroidey • PSA u mužů nad 50 let pro vyloučení Ca prostaty •primární diagnostika a dif. dg. – doplnění jiných vyš. 4110_narodové markery •staging – většinou nevhodné. Vysoká hodnota může upozornit na špatně stanovené nižší stadium nemoci. •monitoring a sledování účinnosti protinádorové léčby – hlavní a zásadní uplatnění Tu markerů •prognóza – většinou nevhodné. Vysoké hodnoty ukazují pokročilé stadium choroby. 4210_narodové markery Marker • Charakteristika • Příklady zvýšení: *u „typické“ malignity *u „méně typické“ malignity *u nemaligních onemocnění *u jiných stavů • Indikace vyšetření (In) • cut off nebo ref. rozmezí 4310_narodové markery FREKVENCE VYŠETŘENÍ NÁDOROVÝCH MARKERŮ doporučovány (WHO) tyto intervaly: • před zahájením léčby • po ukončení léčby (větš. 3.-4. týden) • 1 měsíc v 1. ½roce po primární terapii • 2 měsíce ve 2. ½ 1. roku • 3 měsíce v 1. ½ následujícího roku (1-1,5 r.) • 6 měsíců po 1,5 roku a v dalších letech sledování • při změně léčby • při nejasném průběhu onemocnění Minimální odstup mezi dvěma stanoveními u jednoho pacienta je 14 dní. 4410_narodové markery Kinetika Tu markerů • zdvojovací čas = čas, za který marker zdvojnásobí svou hladinu. Čím kratší, tím agresivnější růst Tu. • biologický poločas: Marker Dny Hodiny Marker Dny Hodiny ACTH 0,2 FER 2 AFP 5 NSE 1 B2M 0,7 P-ACP 2 CA 125 4 PRL 0,3 CA 15-3 7 PSA 2 CA 19-9 5 SCCA 0,3 CEA 14 TG 2,5 CT 0,2 TK 2 CYFRA 21-1 3 TPA 7 45 (Klinická biochemie a metabolismus, 2009) 10_narodové markery Preanalytické aspekty V současnosti se většina používaných solubilních nádorových markerů stanovuje v séru. Doporučeným materiálem pro analýzu je sérum. Pro správnou interpretaci změn v hladinách markerů, zejména při dlouhodobém sledování nemocných s nádorovými chorobami, je třeba vyloučit možné rušivé faktory, které by mohly stanovení ovlivnit už ve fázi preanalytické. V určitých případech mohou být výsledky analýzy ovlivněny některými postupy klinického vyšetřování; např. pro stanovení prostatického specifického antigenu (PSA) má být odebrána krev nejdříve 48 hod po rektálním vyšetření prostaty, ovlivnit jeho hladinu může i jakákoliv manipulace s prostatou včetně jízdy na kole nebo sexuální aktivity. Kontaminace vzorku slinami nebo potem může znehodnotit stanovení antigenu skvamózních buněk (SCCA) nebo CA 19-9. Neuron-specifická enoláza (NSE) je při hemolýze významně uvolňována z erytrocytů, oddělení séra od krevních elementů je třeba provést nejpozději do 1 hod po odběru. Hemolýza nad 300 mg/l falešně zvyšuje výsledek stanovení NSE a LD. Příprava tkání k analýze tkáňových nádorových markerů se řídí standardními operačními postupy spádové bioptické laboratoře. Nádorovou tkáň určenou k vyšetření je třeba co nejrychleji doručit do laboratoře, aby se minimalizovala autolýza do okamžiku fixace materiálu. DNA pro účely vyšetření genetických markerů se izoluje dostupnými soupravami certifikovanými pro in vitro diagnostiku.10_narodové markery 46 Metody stanovení TM 1. Imunoanalytické metody 2. Stanovení enzymů 3. Metody chromatografické 4. Metody molekulární biologie Další metody používané pro diagnostiku nádorů • Patologie • Histologie • Cytologie • Imunohistochemie • Průtoková cytometrie • Biofyzikální (rtg, CT, Sono, PET) • Metody molekulární biologie • PCR, DNA mikroarray, proteomika Princip: FDG-PET • 2-deoxy-2-18Ffluor-D-glukóza 18F-deoxy-fluorglukóza Fluorodeoxyglukóza (FDG) FDG (značená radionuklidem, rozpadajícím se za vzniku pozitronu) • Pozitronová Emisní Tomografie (PET) • Nádorová buňka má při rychlém růstu velkou spotřebu glukózy • FDG je z injekční aplikaci do krve transportována do tkání jako glukóza, je fosforylována, ale nepodléhá následné defosforylaci a je tkáněmi vychytávána (fyziologicky akumulována mozkem, částečně vylučována do moči) • Obraz představuje spotřebu glukózy ve tkáních Obraz představuje spotřebu glukózy ve tkáních Vlastní laboratorní analýza Měření hladiny nádorového markeru je třeba provádět pomocí technologie určené k in vitro diagnostice, kalibrované dle pokynů dodavatele technologie. Metodika musí být v souladu s Nařízením vlády č. 453/2004 Sb. ze dne 7. července 2004 v platném znění, kterým se stanoví technické požadavky na diagnostické zdravotnické prostředky in vitro a pravidelně sledována vnitřní kontrolou kvality. Pracoviště by mělo disponovat příslušně kvalifikovaným personálem znalým problematiky a pravidelně se účastnit procesu externího hodnocení kvality. K vyšetření koncentrace nádorových markerů jsou obvykle používány metody imunoanalýzy, případně se měří enzymové aktivity (LD). Potřeba dlouhodobého sledování pacienta vyžaduje neměnící se technologii stanovení pro daný marker. Z tohoto důvodu by měla být laboratoř schopna zajistit dlouhodobě výsledek o pokud možno stejné analytické nejistotě a vysoké reprodukovatelnosti. Pokud je změnu technologie nutné v praxi realizovat, je třeba nejprve provést srovnávací sérii měření na dostatečném množství konkrétních pacientských vzorků pomocí obou souprav, aby laboratoř získala data o chování nové soupravy v konkrétních podmínkách (tzv. rebaselining). Analýza tkáňových nádorových markerů a DNA se řídí standardními operačními postupy příslušné histologické a genetické laboratoře. 10_narodové markery 49