PATOBIOCHEMIE Trendlink, [online], [cit. 2014-08-18], Dostupné z: http://www.trendlink.conVaktien/Biochemie Ústav molekulární biologie a farmaceutické biotechnologie Mgr. Marie Brázdová, Ph.D. b raz d o va m @ vf u. cz Biofyzikálni ústav A V ČR. [online], [cit. 2014-08-18]. Dostupné z http://www.ibp.cz/cs/o-instituci/zakladni-informace/ Biofyzikálni ústav, Akademie věd České republiky, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno 1 Patobiochemie 2020 Patobiochemie Patobiochemie se zabývá poruchami biochemických dějů v organismu, biochemickými změnami v průběhu chorobných stavů a snaží se o jejich vysvětlení na molekulární úrovni. Přednášející: Mgr. Marie BRÁZDOVÁ, Ph.D., RNDr. Jiří Jelínek, Ph.D., Mgr. Soldanová, Mgr. Pařilová, Mgr. M. Petr, Dr.lng. Branislav Ruttkay-Nedecký Po: 45-135 7:15-8:45 Cvičící: Mgr. Marie BRÁZDOVÁ, Ph.D., Mgr. Soldanová, Mgr. R. Helma, Mgr. M. Petr, Dr.lng. Branislav Ruttkay-Nedecký, Mgr. Pařilová pracovníci centrálních laboratoří (laboratoř 45-221, 324,325, centrální laboratoře) 1 Patobiochemie 2020 2 Sylabus PatobiOChemie 2019/2020 (přednášky45-135 posluchárna, po 7:15-8:45) • 1. Úvod do předmětu, význam studia patobiochemie. Rozsah a požadavky k úspěšnému ukončení předmětu zkouškou, doporučená literatura. Příčiny a druhy poruch. Dědičné metabolické poruchy. (17.2.MB) • 2. Principy regulací metabolismu. Receptory. Biochemické komunikace. Enzymy, regulace metabolismu. Příčiny zvýšené aktivity buněčných enzymů v plasmě. Klinicky významné enzymy. (24.2.MB) • 3. Metabolismus aminokyselin a jeho poruchy. Druhy nemocí, terapie. (2.3.MB) • 4. Sacharidy, metabolismus glukosy a jeho poruchy. Regulace glykemie, poruchy. Patobiochemie diabetu mellitu, druhy DM. Poruchy metabolismu glykogenu, glykogenosy. (9.3.MB) • 5. Poruchy metabolismu lipidů. Cholesterol, lipoproteiny. Lipidosy, dyslipoproteinemie. (16.3.MB) • 6. Patobiochemie artériosklerózy. Ischemická porucha srdeční - srdeční markery. (23.3.CL) • 7. Krev, proteiny krevní plasmy. Srážení krve, koagulopatie. Dysproteinemie. Porfyriny. Biosyntéza, poruchy metabolismu. Porfyrie, hemoglobinopatie. (30.3. CL) • 8. Nukleové kyseliny poruchy metabolismu purinů a pirimidinů. Hyperurikemie, orotacidurie, terapie. (6.4.MB) • 9. Xenobiotika a jejich účinky na organismus. Detoxikace, mechanismus. Biologické oxidace. Účinky volných radikálů na organismy. Lipoperoxidace,antioxidanty. (20.4.MB) • 10. Tumor, tumorové markery. Základní charakteristika nádorové buňky. Strategie laboratorních vyšetření. Požadavky na ideální nádorový marker. Používané tumorové markery. (27.4.MB) • 11. Vztah patobiochemie a klinické biochemie. Klinicko-biochemická analytika a její specifické rysy. Terminologie klinické biochemie. Analyzovaný materiál. Odběr materiálu. (4.5.CL) • 12. Mechanizace a automatizace v klinické biochemii. Analyzátory, jejich rozdělení z různých hledisek. Diagnostické soupravy. Organizace práce v klinicko-biochemické laboratoři, laboratorní a nemocniční informační systémy. (11.5.CL) • 13. Analýza moče a močového sedimentu. Innijr^g^g^q^ metody. (18.5.CL) SYLABUS PRAKTICKÝCH CVIČENÍ: (□17-9:15,9:15-11:30,11:30-13:45) 1. Cvičení: STANOVENÍ KONCENTRACE CELKOVÝCH BÍLKOVIN VE VZORKU SÉRA POMOCÍ AUTOMATIZOVANÉHO FOTOMETRICKÉHO ANALYZÁTORU BS 200 (45-221, Laboratoře centrální, 324, šatna 3.patro, ZB, RN) 2. Cvičení: Analýza onkogenů pomoci imunodetekce na membráně. (ZB) (Laboratoře 324, šatna 3.patro) 3. Cvičení: Základní biochemická vyšetření. Seznámení s biochemickým analyzátorem Dimension. (centrální laboratoře, šatna suterén) 4. Cvičení: Imunochemické metody. Chemiluminiscenční metody. Využití imunoanalyzátoru Immulite. (centrální laboratoře, šatna suterén) 5. Cvičení: Hematologické metody. Využití automatických hematologických analyzátorů v klinické praxi. Koagulační metody (seminář, učebna ). Cvičení: Zápočtový test 1 Patobiochemie 2020 4 Studijní literatura: moodle- patobiochemie 2020, patobiochemie2015, patobiochemie • G.F.Hoffmann et al. Dědičné metabolické poruchy. Grada,, 2006. • J.Koolman, K.H.Rohm. Barevný atlas biochemie. Grada, 2012. • Ledvina a kol. Biochemie pro studující medicíny -1, a II.díl. Karolinum, 2005. • Murray et al. Harper's Illustrated Biochemistry. 29th Edition. Lange, 2012. • KARLSON, P.; GEROK, W.; GROSS, W. Pathobiochemie. Academia, Praha, 1987. • Laboratorní diagnostika. Edited by Tomáš Zima. 1. vyd. Praha: Galén, 2003. ISBN 80-7262-201-3. • Clinical biochemistry :metabolic and clinical aspects. Edited by S. K. Bangert -William J. Marshall. New York: Churchill Livingstone, 1995. ISBN 0-443-04341-8. MASOPUST, Jaroslav. Klinická biochemie. Požadování a hodnocení biochemických vyšetření. 1. vyd. Praha: Karolinum, 1998. část I. a část II. ISBN 80-7184-649-3. • Clinical guide to laboratory tests. Edited by Norbert W. Tietz. 3rd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1995. ISBN 0-7216-5035-X. • RACEK, Jaroslav. Klinická biochemie. Praha: Galén, 2006. ISBN 80-7262-324-9. • Slabý, O.: Molekulární medicína, Galén, 2015. ISBN 978-80-7492-121-6 • Masopust, J: Patobiochemie buňky, 2003, ISBN: 80-239-1011-0 1 Patobiochemie 2020 5 Požadavky ke zkoušce z patobiochemie Zkouška se skládá z části písemné části Test: min 60% (E), ....90-95% (A) Ke zkoušce se můžou přihlásit pouze ti studenti, kterým byl udělen zápočet z praktického cvičení. Praktická cvičení: 1) účast 100%, 2) protokoly, 3) zápočtový test 80%, 4) vypracovanou ppt prezentaci (1 list) na jednu metabolickou chorobu, seznam na moodle zasílat: helmar@vfu.cz 1 Patobiochemie 2020 6 1. Dědičné metabolické poruchy Příčiny a druhy poruch. Dědičné metabolické poruchy (DMP). Diagnostika. Léčba mutace mtONA postiženi 1 Patobiochemie 2020 7 2.1.Příčiny a druhy poruch. Dědičné metabolické poruchy (ĎMP). Dědičné metabolické poruchy (ĎMP) tvoří různorodou skupinu 700-1000 onemocnění, která jsou způsobena enzymovým deficitem, hyperaktivitou, dysfunkcí transportního proteinu či poruchou jiného proteinu souvisejícího s některou metabolickou dráhou. Typická je pro ně autozomálně recesivní, qonozomálně recesivní i dominantní, ale takě mitochondriální dědičnost. K nedostatečné tvorbě enzymu či potřebného proteinu dochází následkem mutací jaderné či mitochondriální DNA. Konzervativní odhady kumulativní incidence všech dědičných metabolických poruch jsou uváděny kolem 1:500 (frekvence heterozygotů 1:15); je velmi pravděpodobné, že ĎMP jsou v současné době podd iagnost ikovány. Každý praktický lékař má ve svém obvodu nejméně dva a více pacienta s ĎMP a že každý specialista se ve: gtybéh£r2q^i s těmito pacienty setkáv᧠Skupina dědičných metabolických poruch je značně heterogenní společné rysy. 1) Již z jejich podstaty vyplývá, že u pacienta budou detekovatelné biochemické a enzymatické odchylky. 2) Dále vzhledem k tomu, že většina metabolických drah je společná pro řadu buněk v organizmu, bývá časté multiorgánové postižení (např. postižení CNS, svalů, ledvin a jater u mitochondriálních onemocnění). 3) Klinické projevy ĎMP bývají velmi často nespecifické (neprospívání, nechutenství, porucha růstu, porucha psychomotorického vývoje, poruchy vědomí), 4) jen poměrně vzácně se vyskytují specifické známky svědčící s vysokou pravděpodobností pro některé ĎMP (např. zápach zpocených nohou u pacientů s izovalerovou acidurií nebo typická f aciální dysmorf ie u pacientů s mukopolysacharidozami či generalizovanými peroxizomálními onemocněními). 5) Postihují pacienty jakéhokohV^ktrbťí0prenatálního období až do stáří. • Historie • Počátky objevování dědičných metabolických poruch jsou spojeny se jménem Archibalda Garroda, Který jako první poukázal na souvislost lidských nemocí a Menaelových zákonu dedičnosti a formuloval koncept dědičných metabolických poruch (inborn errors of metabolism). • Garrod se zabýval studiem alkgptonurie a v roce 1902 publikoval knihu The Incidence of Alkaptonuria, a Study in Chemical Individuality, která je prvním ^ záznamem případu recesivní dedičnosti u lidí. V roce 1923 vyšla další jeho kniha s názvem Inborn Errors of Metabolism, v níž publikoval své studie o alkaptonurii. cvstinurii. pentosurii a albinismu. Právě překladem termínu inborn errors of metabolism vznikl u nás dlouho používaný nepřesný název vrozené metabolické poruchy (vrozené Phenylbrenztraubensäu metabolické vady) Sir Archibald Edward Garrod, Melanin 0 Phenylalanin Phenylketonurie —y < Albinismus Alkaptonurie 0 Tyrosín Homogentísinsäure 0 0 C02 + H20 Kreti nismus re Thyroxin 1 Patobiochemie 2020 10 Príčiny dedičných metabolických poruch a) PODSTATA METABOLICKÝCH CHOROB substrát mutace jaderné DNA ri.Lii e mtDNA multlůrgánavé postiženi Nejčastější příčinou dědičných metabolických poruch jsou mutace nukleární DNA v zárodečných buňkách (a tím i následně v somatických buňkách) s typickou monogenní mendelovskou dědičností — běžně autozomálně recesivní, gonozomálně recesivní i dominantní. Méně častou příčinou ĎMP jsou mutace mitochondriální DNA, které se přenášejí maternálním typem dědičnosti. Fenotypové projevy u dvou jedinců se stejným genotypem se mohou lišit v důsledku dalších faktoru jako je vliv prostředí (dieta, životní styl u nemocí malých molekul) či jako jsou např. epigenetické změny, epistáze (interakce s alelickými variantami v jiných genech). inaktivace X-chromozomu (lyonizace). Mutace mohou být typu bodových mutací (missense, nonsense, synonymní mutace), delecí a inzercí (s nebo bez posunu čtecího rámce), přičemž z typu mutace a její lokalizace nelze často přímo určit stupeň postižení funkce příslušného proteinu. Následek: defektní transkripce (úroveň mRNA) a translace, sestřih,.... 1 Patobiochemie 2020 Dědičné metabolické poruchy obvykle AR, GR | D -&t | obvykle enzym substrát produkt klinicky variabilní 1 Patobiochemie 2020 12 Důsledky mutace • změněné množství translatovaného proteinu (obvykle snížené č i vzácně zvýšené) změněné vlastnosti proteinů (změnou izolované funkce jedné domény, nebo globální změnou všech funkcí napr. při misfoldingu). mutace mohou vést i ke změnám funkce neproteinových genových produktů jako jsou například miRNA či siRNA, které regulují expresi řady cílových genů. Postižený protein: a) většinou enzym (ENZYMOPATIE) některé metabolické dráhy, jež potom vázne a nevzniká její produkt, který může chybět, neodčerpává se substrát, který se může hromadit, případně metabolizovat na vedlejší produkt. Od toho se pak odvíjí postižení různých orgánů do různé míry (př. Alkaptonurie). b) krevní bílkoviny neenzymové povahy: plazmatická bílkovina či hemoglobin (srpkovitá anémie) c) strukturní bílkoviny plazmatické membrány: změna tvaru buňky (např. sférocytoza) d) receptory, součásti iontových kanálu, regulační proteiny (př. nádorový supresor) 1 Patobiochemie 2020 13 Důsledky mutací • hromadění substrátu (malé molekuly-př. f enylalanin jsou difusně rozptýlené v tělesných tekutinách, přestup pres filtr, bariéru ledvin, exkrece močí. Velké molekuly -př. mukopolysachyridy hromadění v místě vzniku). Př = PKU - mutace genu pro PAH ( phenylalaninhydroxylasú), aktivita enzymu < 1% (postiž. 2 alely). Nízké procento PKU je způsobeno mutací 1 alely nebo v genu pro kofaktor PAH -tetrahyrdobiopterin (lehčí forma PKU). • chybění produktu • hromadění def ektního enzymu •tvorba nesprávného produktu - blok metabolické dráhy •ztráta mnohočetných enzymových aktivit 1 Patobiochemie 2020 14 Mutace TP53 Bodová mutace v TP53'způsobí ztrátu funkce p53 -jako nádorového supresoru i .1 UVIillli 248 175 245 diilllliliiilljiiiii I,liilII 273 li il 282 i il Cho et al. 1994 • Důsledky mutace pro funkce proteinu • Ztráta funkce PuPuPuC(A/r)(T/A)GPyPyPy • zesílení funkce - mutací zesílí některá z funkcí proteinu nebo intenzitu produkce proteinu /hromadění) • zisk nové funkce • nesprávná exprese proteinu ( v místě a čase) 15 1 Patobiochemie 2020 TEST Funkční dopad mutací TP53 a mechanizmy GOF Accumulation due to oncogenic events [Mutant I i Transcriptional regulation of Transcriptional regulation of genes that mediate growth- genes that mediate supression, apoptosis, DNA proliferation, drug-resistance, repair etc. survival, metastasis etc. Nature Reviews I Cancer Mechanismy l^^H ^^i) zahrnující vazbu na DNA p53- nádorová supresor, antionkgen, transkripční faktor, protein vázající se na DN/fV mutantní p53- onkogen 3atobiochemie 2020 TEST Incidence (výskyt) DMP • ĎMP patří do skupiny tzv. vzácných onemocnění (rare diseases). Incidence jednotlivých diagnostikovaných ĎMP je nízka, 1:103 až 1:106 i nižší, ale celková incidence všech ĎMP je relativně vysoká (udává se 1:1000 až 1:600). Skutečná incidence je pravděpodobně ještě vyŠŠí a řada pacientů tak diagnóze ĎMP uniká. Incidence ĎMP je v různých populacích odlišná. • Individuální výskyt poměrně vzácný (1:15 000 - 200 000) • Kolektivní výskyt vysoký (1: 1000), incidence pravděpodobně i vyŠŠí (kolem 1:500) • novorozenecký screening 1:1000-1:4000 • selektivní screening nejméně 1:500-1:1000 • frekvence heterozygotů pro ĎMP nejméně 1:15 • zastoupení se liší podle populací • vyŠŠí výskyt v imbredních populacích (PKU Turecko, organické acidurie Blízký Východ) • tyrosinemie I.typu Quebec, aspartylglykosaminurie Finsko, lysosomální nemoci Izrael Konzervativní odhady kumulativní incidence všech dědičných metabolických poruch jsou uváděny kolem 1:500 (frekvence heterozygotů 1:15); je velmi pravděpodobné, že ĎMP jsou v současné době poddiagnostikovány. Incidence, statistický ukazatel v epidemiologii, je podíl počtu nově hlášených nemocných jedinců za dané časové období (nových případů) a počtu všech jedinců ve sledované populaci. 1 Patobiochemie 2020 17 Výskyt DMPvČR incidence pro ČR ~ 1:1000 dosud -150 různých nosologických jednotek 1 Patobiochemie 2020 18 Způsoby přenosu DPM (dědičnost) JADERNÁ DNA • Autosomálně recesivní • Autosomálne dominantní •Gonosomálne dominantní mutace mtDNA postiženi •Gonosomálně reces\vr\'\ MIMOJADERNÁ DNA •Maternální typ dědičnosti ( mitochondriální DNA) 1 Patobiochemie 2020 19 Dědičnost AR (Autosomálně recesivní) • Dědí se tak naprostá většina DPM např. PKU • Onemocnění se projeví pouze u homozygota (nositel obou defektních alel pro daný znak) • Heterozygot je klinicky zdravý jedinec, je přenašečem defektního genu malka přcnaácčka oicc přenaicč vaiička spermie. N V — 5^ f /s F 1 Dy postižené dilč dilc dilč prenaseč pŕenašeč SCI P - <ŕžkýkiciniboxidace) • Hyperketóza (u některých org. acidurií) • Hypourikémie/hyperurikémie (porucha met.purinů) • Hypocholesterolémie/hypercholesterolémie (deficit 7-dehydrocholesterolu tzv. Smith-Lemli-Opitzův sy) 1 Patobiochemie 2020 28 1_1. Akutní metabolická onemocnění •Začátek: obvykle v Časném novorozeneckém či raném kojenecké období •Projevy: respirační selhání, sepse, křeče, poruchy vědomí, protrahovaná žloutenka, rozvíjející se RĎS či DIC atd. •Příklady: poruchy metabolismu AMK, galaktozy, ureageneze, organických kyselin, p> oxidace mastných kyselin 1 Patobiochemie 2020 29 1_2. Metabolická onemocnění s chronickým průběhem •Charakteristika: střídání bezpříznakových období s atakami, které se typicky objevují po zátěži např. změna výživy (bílkovinná zátěž), horečnaté období (zvýšená energetická potřeba organismu v průběhu katabolismu)... •Příklady: pozdní formy deficitu OTC (ornitinkarbamoyltransferáza -porucha mocovinového cyklu), některé poruchy ß oxidace MK 1 Patobiochemie 2020 30 1_3. Chronicky progredující metabolická onemocnění •Charakteristika: zpočátku normální psychomotorický vývoj se po určitém období zastavuje případně dochází k jeho regresi •Příklady: střádavá onemocnění (mukopolysacharidózy, neurodegenerativní onemocnění...) 1 Patobiochemie 2020 31 4) Dělení ĎMP podle projevu ĎMP Zásadní rozdíl v povaze metabolitů, které způsobují klinické projevy onemocnění, umožňuje dědičné metabolické poruchy rozdělit do dvou skupin: • nemocí malých molekul •nemoci komplexních molekul Fenotypové projevy u dvou jedinců se stejným genotypem se mohou lišit v důsledku dalších faktorů jako je vliv prostředí (dieta, životní styl u nemocí malých molekuh či jako jsou např. epigenetické změny, epistáze (interakce s alelickými variantami v jiných genech), inaktivace X-chromozomu (lyonizace). 1 Patobiochemie 2020 32 4_l_Nemoci malých molekul jsou způsobeny - hromaděním malých toxických molekul (amoniak, organické kyseliny) - nedostatkem žádoucích metabolitů (ketolátky, glukóza), které vznikají katabolismem látek přijímaných potravou (aminokyseliny bílkovin, sacharidy, mastné kyseliny). - l)Typicky se onemocnění manifestuje v novorozeneckém věku v průběhu několika hodin či dnů, k nevyvážené koncentraci toxických molekul dojde po zvýšeném přísunu zdroje v potravě či při horečnatých infektech,a to atakovitě, jako akutní stav se změnou chování až přechodem do komatu (např. hypoketotické kóma u deficituMCAĎ-Ďeficitacyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem (MCAĎ)). - Ataky se mohou dostavit opakovaně, ve spojení se specifickou situací, se kterou si ji pacient spojuje (dlouhé hladovění nebo naopak náhlé přejídaní). 2) Některá onemocnění se ovšem mohou od tohoto schématu lišit a mívají i subakutní či chronickou formu a postihují i jiné orgány než jen CNS. 1 Patobiochemie 2020 33 4_2_Nemoci komplexních molekul • Nemoci velkých molekul vznikají defektem v metabolizmu (porucha tvorby, transportu látek, ale také v jejich odbourávání) endogenně tvorených makromolekul (glykosaminoglykany, glykolipidy, glykoproteiny a jiné). • Některé tyto látky tvoří stavební části buněčných membrán, což se pak projeví defektem tohoto typu, jjne jsou odbourávány v peroxisomech a lysozomech, v nichž se pak mohou hromadit. To trvá řádově měsíce^ až roky, nemoc probíhá bez atak a zřejmých krátkodobých nutričních či infekčních souvislostí, má chronický charakter, který se manifestuje až po uběhnutí latentní fáze, během níž se nahromadilo dostatek makromolekul, aby se defekt projevil na úrovni funkce. • Nemoci, při nichž se hromadí makromolekuly v peroxisomech či lysosomech, mohou imitovat neurodegenerativní či nádorová onemocnění. • Nemoci, při nichž dochází k membránovým defektům, zase chromozómové aberace, a to příznaky jako organomegalie, dysmorfie hlavy a obličeje, postiženi cNS a jiných orgánů. 1 Patobiochemie 2020 34 Príklady nejznámějších DMP • Poruchy metabolismu AMK • Organické acidurie • Poruchy metabolismu sacharidu • Poruchy metabolismu lipoproteinu • Poruchy metabolismu purinů a pyrimidinu • Poruchy metabolismu vysokomol. látek 1 Patobiochemie 2020 35 Laboratorní diagnostika DMP - na několika úrovních: • Prenatální diagnostika - vyšetření ke zjištění, zda je plod postižen DMP, která byla prokázána v rodině-jen odůvodněné případy (AFP, vada v rodině) • Postnatální diagnostika - novorozenecký screening (PKU, hypothyreosa aj.) Většinu DMP lze diagnostikovat prenatálně - analýzou enzymové aktivity nebo mutací v choriových klcích či amniocytech, nebo vyšetřením metabolitů v plodové vodě. •Včasná diagnostika - léčba, kompenzace Metabolická příručka, Laboratorní příručka Diagnostických laboratoří Ústavu dědičných metabolických poruch VFN a 1. LF UK - udmpAflxuni.czme/5673/Metabolická%20příručka%20verze%2002.pdf ^ J J 1 Pírtobiocltemie 2020 ľ ^ J 36 Laboratorní diagnostika DMP DNA/RNA 1 Enzymologie 1 Metabolity 1. na úrovni metabolitů 2. na úrovni enzymů 3. na molekulární úrovni Příznaky specifické-např. zápach barva moči ipecifické-např. koma P MR dysmorfie hepato/myopathie další 2020 TEST 37 Diagnostika symptomatická DNA/RNA screening scanning Sekvenování NGS (celogenové Sekvenování) V diagnostice DM P sc stejně jako v jiných oblastech medicíny Lipla t ň ují nove biotechnológie založená na komplexní analýze biologického materiálu a generující pomerné značne množství heterogenních dat. Jedná se zejména o metody stanovení velkého sucktra metabolitů - mctabolomiky a sekvenováni nove generace. Zavaděním těchto iv.clod Je- klinkké jTlIxc vznikali etické problémy, jU^/ré neisou /celu nové ll by.y ľ.l> určité míry popsány již dříve* napr u genetických vyšetření či zobrazovacích metod. U metabolomických metod a sekvenováni nové generace je ov£cm unikátní rozsah, dany pravé značným objemem generovaných dat a jejich komplikovanou intcrpretací- Pro diagnostiku DM P se standardně po u živá rada profilových vyšetření, a jedná se tedy o dlenou mctabolomiku. Příkladem jsou vyšetření organických kyselin v moči pomocí plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (jednou analýzou jsou vyšetřeny stovky metabolitů)* vyšetření profilu aminokyselin (v séru, moci čilikvo-ru) detekující okolo šedesáti různých látek či vyšetřování desítek různých metabolitů pomoci vysoce citlivé tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS). Druhou progresivní metodou je sekvenováni nové generace (NGS), které umožňuje vyšetřit veškerou genetickou informaci jedince (sekvenováni celého genomu), informaci kódujících oblastí genomu (sek veno vání cjíomu) čí informací panel u předem vybraných genů (typicky desítky az stovky genů v jedné analýze). U NGS se ziskaná data v různé míre filtrují a množství interpretačních obtíží vzrůstá přímo úmerné s rozsahem vyšetřené oblasti. Při sekvenováni panelu genu se lze zaměřit pouze na relevantní výsledky, které mají vztah ke konkrétní diagnóze. Podstatné složitější situace nastávat jsou-li tyto metody užity u presymptomatických jedinců nebo při vy-Setřeních pacientu, u nichž je etiologie onemocnění neznámá a NGS se použije jako diagnostická metoda. V téchfco případech je jisté, žc budou generovány neočekávané nálezv neseruviseiící úhlavním důvodem vvšetření. Nlčkterr 7. neočekává nveh nálezů https://books.googlexz/books?id=J5dFCQAAQBAJ&pg=PA2^ FP4qCqcaY&sig=60JEak3HksAWKlVW2y8ibllI6wY&hl=cs&sa=X^v^=0ahUKEwiCh-Hu-ZvZAhUisKQKHe8_AZoQ6AEIVzAJ#v=onepage&q=incidence%20DMP&f=false Diagnostika presymptomatická vyšetření příbuzných s rizikem DMP prenatální diagnostika screening segmentu populace jedna nemoc nebo skup předem známych nemocí 2020 novorozenecký screening Základní situace s rozdílnou diagnostikou pro DMP •DMP malé molekuly • akutně nemocný novorozenec • (opakovaná) ataka dlouhotrvajícího bezvědomí • neprospívání kojence • hypoglykémie • DMP velké molekuly • progredující postižení CNS a svalstva • dysmorfie obličeje • organomegalie (játra, slezina, srdce) 1 Patobiochemie 2020 41 Abnormální zápach a barva moči •zápach (malé těkavé molekuly): • zpocené nohy-isovalerát • karamel/javorový sirup-oxokyseliny • vařené zelí-methionin oxid • rybina-trimethylamin • černý rybíz- některé organické kyseliny • myšina-fenylacetát •zbarvení • cervenooranzove-uraty • černohnědé při oxidaci-homogentisát • modré-indoxalové deriváty • zelené-4-OH-butyrát 1 Patobiochemie 2020 42 1.Diagnostika na úrovni metabolitů (biochemické vyšetření) •Charakteristika: prokazujeme změněnou koncentraci nějakého metabolitů ( substrát, produkt, abnormní metabolit). Nejstarší,nejjednodušší,nejrozšířenější. •Užití: všude tam, kde defektním proteinem je enzym či trasportní protein —► v místě metabolického bloku dochází k hromadění substrátu a nedostatku produktu, případně k tvorbě jiných metabolitů v důsledku aktivace alternativních metabolických drah •Materiál: sérum či plazma, moč, likvor, plná krev v podobě suché krevní skvrny na filtračním papírku 1 Patobiochemie 2020 43 prekursor substrát bqi=^> vedl.produkt produkt 1 Patobiochemie 2020 44 • amoniak • cystin u cystinosy • cystin u cystinurie • mukopolysacharidy 1 Patobiochemie 2020 45 Příklady: • glukosa u GSD • ketolátky u poruch beta.oxidace MK • plasmalogeny u peroxisom.poruch • cystein u deficitu CBS • AdoMet u RM • ATP u mitochondriálních nemocí 1 Patobiochemie 2020 DMP- diagnostika metabolitů 1 Patobiochemie 2020 1.Diagnostika na úrovni metabolitů -pokračování - vyšetřovací metody •Vyšetřované metabolity: AMK, sacharidy, oligosacharidy, glykosaminoglykany, puriny, pyrymidinyjipidy, steroidy atd. • Používané laboratorní techniky: chromatografie - papírová - tenko vrstva - kapalinová (iontoměničová, vysokoúčinná HPLC) - plynová (s hmotnostní spektrometrií GC/MS) elektromigrační techniky - elekrtroforéza - kapilární elektroforéza tandemová hmotnostní spektrometrie MS/MS 1 Patobiochemie 2020 48 Běžné laboratorní nálezy u Krev • glykemie • cholesterol •TG • kys. močová •MAc • hyperamonemie, RAIk • ALT, AST •CK anemie/pancytopenie Moč • ketolátky • kys. močová • krystal u rie • myoglobinurie 1 Patobiochemie 2020 MPS I - Hurlerova choroba (deficit a -iduronidasy) MPS I in a 6-year-olcl girl Electrophoresis of urinary GAGs (excretion of dermatan sulvhate/DS and heparan lPatobiochemie 2030 50 sulnhatpJHS ) Glykoproteinosy - HPTLC oligosacharidů v moči ORCINOL RESORCINOL KO Sial P1 GM1 P2 Fuc KO Sial P2 Sch P1 NANA KO 1 Patobiochemie 2020 51 Diagnostika DMP - enzymů enzym produkt 2. Diagnostika na úrovni enzymů •Charakteristika: prokazujeme sníženou aktivitu postiženého enzymu. Vyšetření je náročnější (ekonomicky nákladnější, často větší zátěž pro pacienta - odběr materiálu). •Užití: v prenatální diagnostice, pro potvrzení příslušné DPM, obvykle mu předchází vyšetření na úrovni metabolitů •Materiál: leukocyty, erytrocyty atrombocyty izolované z periferní krve, sérum nebo plazma, kultura kožních fibroblastů, tkáň ze svalové či jaterní biopsie 1 Patobiochemie 2020 53 Principy enzymologického vyšetření •separace substrátu a produktu •kvantifikace přírůstku či úbytku substrát kofaktor zmenený kofaktor •kvantifikace přírůstku či úbytku 1 Patobiochemie 2020 54 Stanovení enzymů u DMP •Obvykle nutné buňky •Leukocyty, fibroblasty •Tkáně plodu a obalů plodu •Techniky fluorimetrické a radiometrické (event. fotometrické) •Měřený parametr: úbytek substrátu nebo tvorba produktu 1 Patobiochemie 2020 55 Typické výsledky enzymologie Postižení homozygoti jasně deficitní Heterozygoti: překryv Zdraví homozygoti: obvykle normálni rozdělení aktivity v populaci nmol/mg/h 40 20 0 r •a* A A Za A 1 Patobiochemie 2020 KONTROLY PACIENTI HETEROZYGOTI 56 Množství enzymu katalytická koncentrace enzymu, enzymová aktivita Katal -množství enzymu, které katalizuje přeměnu 1 mol substrátu za 1s, za definovaných podmínek (T, pH, nasycení mol. EnzS) mkatal/l (na 1 L vyšetřované tekutiny) dříve mezinárodní jednotka U/l U ( přeměna 1mmol S za 1min) mkatal/l= 60 U/l Imunochemické stanovení enzymů Specifická protilátka, neměří aktivitu enzymu mg/l 1 Patobiochemie 2020 57 Molekulární diagnostika DMP 1 Patobiochemie 2020 produkt 3. Diagnostika na molekulární úrovni •Charakteristika: diagnostika na úrovni DNA prokazuje přímo defektní gen. Ekonomicky nejnákladnější, indikovat uvážlivě •Užití: k definitivnímu potvrzení diagnózy tam, kde tak nelze jednoznačně učinit na základě vyšetření metabolitů či enzymů, dále v genetickém poradenství •Materiál: leukocyty z periferní krve, buňky z plodové vody získané amniocentézou, buňky choriových klků získané biopsií placenty 1 Patobiochemie 2020 59 OTC: Mutace c. 829 OT (R277W) A G A A A A A GT/CGG C T C C AGG CT Normální sekvence AGC COGGGOC C A G GGAAAGAC GGC Heterozygotní delece XXAGGGOC C R K K tGGAfRGAOWGRC Z \ l_Patobiochemie 2020 61 * Novorozenecký laboratorní screening * Hyperfenylalaninémie, fenylketonurie Novorozenecký laboratorní screening (NLS) je aktivní vyhledávání chorob v jejich časném, preklinickém stadiu tak, aby se tyto choroby diagnostikovaly a léčily dříve, než se stačí projevit a způsobit nevratné poškození. NLS spočívá v diagnostice onemocnění na základě stanovení koncentrace specifické látky v suché kapce krve na tzv. novorozenecké screeningové kartičce. V ČR se od 1. 6. 2016 vyšetřuje 18 onemocnění: snížená funkce štítné žlázy (kongenitální hypotyreóza - CH) nedostatečnost tvorby hormonů v nadledvinách (kongenitální adrenální hyperplazie - CAH) porucha tvorby hlenu (cystická fibróza - CF) poruchy látkové výměny aminokyselin • vrozená porucha látkové výměny aminokyselinyfenylalaninu (fenylketonurie - PKU, hyperfenylalaninemie- HPA) • argininémie (ARG); citrulinémie I. typu (CIT); porucha látkové výměny větvených aminokyselin (leucinóza, nemoc javorového sirupu - MSUD); homocystinurie z deficitu cystathionin beta-syntázy (CBS), pyridoxin non-responzivní forma; homocystinurie z deficitu methylentetrahydrofolátreduktázy (MTHFR); glutarová acidurie typ I (GA I); izovalerová acidurie (IVA) dědičné poruchy látkové výměny mastných kyselin • deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem (deficit MCAD); deficit 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin s dlouhým řetězcem (deficit LCHAD); deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin s velmi dlouhým řetězcem (deficit VLCAD); deficit karnitinpalmitoyltransferázy I (deficit CPT I); deficit karnitinpalmitoyltransferázy II (deficit CPT II); deficit karnitinacylkarnitintranslokázy (deficit CACT) dědičná porucha přeměny vitamínů • deficit biotinidázy (BTD) 1 Patobiochemie 2020 63 http://www.novorozeneckyscreening.cz/ Výsledky novorozeneckého laboratorního screeningu v ČR v roce 2015: • V roce 2015 se narodilo 110 800 živých novorozenců. • NLS bylo zachyceno 87 novorozenců s některou ze 13 vyšetřovaných nemocí Onemocnění Počet zachycených Prevalence Počet pacientů od r. 2010 Prevalence (kumulativní) CH 36 1 :3078 248 1:2 669 CAH 10 1 :11080 50 1:13 236 HPA/PKU 21 1 :5276 125 1:5 295 MSUD 0 - 1 1:661823 MCADD 4 1 : 27700 32 1:20 682 LCHADD 0 - 10 1:66182 VLCADD 0 - 4 1:165 456 CPTI 0 - 0 - CPTII /CACT 0 - 0 - GA 1 1 1 :110 800 4 1:165 456 IVA 0 - 3 1:220 608 CF 15 1 :7387 95 1:6 967 CELKEM 87 lřMTiáchemie 202( 572 1:1157 Léčba DMP 1 Patobiochemie 2020 65 Léčba 1-kauzální Cystická fíbróza (CF) neboli mukoviscidóza je multisystémové geneticky podmíněné onemocnění Pro pacienty s cystickou fibrózou (CF), kteří mají mutaci třídy III G551D, je od roku 2012 k dispozici kauzální léčba. Mechanismus účinku léku ivacaftor spočívá v opravě funkce chloridového kanálu CFTR, poškozeného touto mutací. Potvrzená účinnost nového léčebného postupu, reprezentovaného právě lékem ivacaftor, přináší reálnou naději, že bude časem možné řešit základní příčinu onemocnění i u pacientů s dalšími typy mutací v genu CFTR. tére se v klasické foMiě projevuje chronickým progredující onemocnění dýchacích ciest a plic insuficiencí zevní sekrece pankreatu, vysokou Koncentrací elektrolytu v potu a poruchoi/ reprodukce mužů. substrát transplantace gen promotor enzym vitamin chaperon 1 Patobiochemie 2020 66 Léčba 2- ovlivnění dráhy potrava V. toxicky prekursor substrát ■■ toxický vedl. produkt netoxický produkt produkt 4 1 Patobiochemie 2020 67 Léčba 3- systémová Hydratace Léčba infekce Atd. 1 Patobiochemie 2020 68 Léčba DPM 1. Na úrovni metabolitu 2. Na úrovni enzymu 3. Na buněčné úrovni • Jediná kauzální léčba - na buněčné úrovni. • Léčba symptomatická a podpůrná - zmírňuje projevy, neodstraňuje příčinu. 1 Patobiochemie 2020 69 1. Léčba na úrovni metabolitu a) Omezení příjmu či vzniku toxických metabolitu (např. dieta u PKU, galaktosémie, prevence katabolismu u aminoacidopatií, org.acidurií) b) Odstranění toxických metabolitu ( peritoneální dialýza, hemodialyza,výměnná transfúze) a využití alternativních metabolických drah (např. podávání benzoátu u hyperamonémií) c) Podávání metabolických inhibitorů ( např. allopurinol při hyperurikémii ) d) Náhrada deficitních produktů ( např. argininu u poruch močovinového cyklu, tyrosinu u PKU) 1 Patobiochemie 2020 70 2. Léčba na úrovni enzymu a) Aktivace enzymu dodávkou koenzymů ve farmakologických dávkách ( např. pyridoxinu u deficitu cystathionin (3-synázy) b) Dodávka deficitního enzymu přímo -enzymoterapie ( např. u Gaucherovy či Fabryho choroby, některých typů mukopolysachyridóz či glykogenóz) 1 Patobiochemie 2020 71 3. Léčba na buněčné úrovni • Genová terapie s virovými či nevirovými vektory • Zvláštní postavení v léčbě pak zaujímá transplantace orgánů a tkání ( např. jater u tyrosinémie, ledvin u cystinózy, kostní dřeně u adrenaleukodystrofie) 1 Patobiochemie 2020 72 Choroby potenciálne léčitelné genovou terapií Chybějící sérové proteiny Hemoniie-fekiorVlII, IX Wilsonova choroba- Certiloplasmln HEtabolic-ké choroby Deficienre omilin dekarboxylázy Svalová dystroflo Poruchy imunitního systému SCID-ADAdefcienoe, X=linked.,. Další choroby s Mendclovskou dftdlinostF Cyslicka fibrúza » k c > v o li Malignity Solídni nádory Leukémie, Lymfumy Neurodtgeneratlvni choroby Alzhůlrrwř- agregace Ta u H untingtonova choroba Parkinsonova choroba 4 Hyperfenylalaninémie(HPA), fenylketonurie (PKU) Autosomálně recesivní onemocnění Porucha metabolismu aminokyseliny fenylalaninu (Phe) Mutace v genu PAH (fenylalaninhydroxyláza), Chromosom 12q23.2 PAH metabolizujefenylalanin (Phe) za vzniku tyrozinu (Tyr), jako kofaktor je vyžadován tetrahydrobiopterin (BH4). NAD dihydrobiopterin reductase NADH H A H O H 7 6 H II CH—CH—CH3 I I OH OH 5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin HN ^,N.H.K HN Y^N^CH-CH-CH3 A. OH OH 7 (8-Dihydrobiopterin (quinoid form) U-^~\-CH2— Íh-COO 02 phenylalanine hydroxylase H20 Phenylalanine HO \ / NH3 CH2-CH-COO Tyrosine 1 Patobiochemie 2020 74 Hyperfenylalaninémie(HPA), fenylketonurie (PKU), http://www.novorozeneckyscreening.cz/ Klasifikace: Porucha metabolismu aminokyselin Dědičnost: Autosomálně recesivní Incidence: 1:13 000 (v ČR 1: 6 500) Etnicita: Severní Evropa, Irsko (1:4 500), Turecko (1:3 000) Enzym a lokalizace: fenylalaninhydroxyláza, játra; Gen a lokalizace: PAH, 12q24.1 Informace o onemocnění Průběh onemocnění bez léčby: Pozvolná mentální retardace (patrná od 6 měsíců věku). Ostatnísymptomy-ekzém, zápach moče, křeče, světlejší pigmentace, zvláštnosti chůze a držení těla. Rozsah klinických příznaků je závislý na stupni enzymového deficitu. Léčba: Standardní péče je léčba všech osob s hladinou fenylalaninu nad 350-400 fimol/l, spočívá v nízkobílkovinné dietě s omezením fenylalaninu a podáváním směsi aminokyselin bez fenylalaninu. Dieta je doporučována po celý život a její dodržování je považováno za nejdůležitější faktor normálního vývoje mozku. Průběh onemocněnís léčbou: Není mentální retardace, mohou být specifické poruchy učení. Při přerušení diety se sníženým obsahem fenylalaninu dochází k poklesu IQ, poruchám chování a soustředění, objevuje se ekzém, zápach a mohou se objevit křeče. Ženy s PKU/HPA mají vysokou pravděpodobnost narození postiženého dítěte (mikrocefalie a postižení mozku plodu, vrozené srdeční vady), jestliže nedrží přísnou dietu před plánovaným otěhotněním a během těhotenství. Nález při novorozeneckém screenin^i5fž1v^Sfi^(1ŕénylalanin a poměr Phe/Tyr Fenylalaninhydroxyláza (PAH) Fenylalaninhydroxyláza - enzym obsahující tři funkční domény: • N-koncová regulační doména • katalytická doména • C-koncová oligomerizační doména Katalytická doména - vazba fenylalaninu, kofaktoru (tetrahydrobiopterin, BH4), iontu železa Oligomerizační doména - tvorba homotetrameru (aktivní forma enzymu) Phenylalanine hydroxylase Phenylalanine hydroxylase protein consisting of 4 subunits U.S. National Library of Medicine ■ * Fa 264 .•' -.290 HCTQYIRHGSKPMYTPEPDICHELLGH 285 Ser 16 N Regulatory domain BHj binding site B Catalytic domain Subunit binding domain C 142 1 Patobiochettfle 2020 453 Single phenylalanine hydroxylase subunit Regulatory domain Catalytic domain Tetramerization domain HPA/PKU • 98% způsobeno mutacemi v genu PAH • 2% mutacemi v genech kódujících enzymy podílejících se na syntéze a regeneraci kofaktoru (tetrahydrobiopterin, BH4) GTP . GTPCH Lancet2010; 376: 1417-27 : ptps ' sr NADH During the hydroxy lation of phenylalanine by PAH (02, Fe+3), tetrahydrobiopterin (BH4) is oxidised to 4a-hydroxy-BH4 intermediate, which is subsequently regenerated back to BH4 by the enzymescarbinolamine-4a-dehydratase (PCD) and by the NADH-dependentdihydropteridine reductase (DHPR). BH4 is synthesisedfrom guanosine triphosphate (GTP) by three additional enzymes GTP cyclohydrolase I (GTPCH), 6-p^^^^gh}(^i(ppterin synthase (PTPS), and sepiapterin reductase (SR). Mutations in genes coding for PCD, DHPR, GTPCH, PTPS, and SR result in BH4 deficiency. Tři milníky spojené s diagnostikou a léčbou HPA/PKU: ~ 1930, Asbjorn Folling (norský lékař a biochemik) identifikoval u části pacientů s mentální retardací zvýšenou hladinu Phe v krvi ~ 1950, Horst Bickel (německý lékař) zavedl dietu s nízkým obsahem Phe pro pacienty se zvýšenou hladinou Phe v krvi. ~ 1960, Robert Guthrie (americký mikrobiológ) zavedl diagnostický test vhodný pro screening HPA/PKU. Současný novorozenecký laboratorní screening HPA/PKU-tandemová hmotnostní spektrometrie - analýza hladiny fenylalaninu a poměru fenylalanin/tyrosin. 1 Patobiochemie 2020 Guthriho test • Semikvantitativnítest určený pro detekci zvýšené hladiny Phe využívající schopnosti Phe usnadnit růst bakterií v kultivačním médiu s inhibitorem. • Malý disk filtračního papíru se zaschlou krví se umístí na agarovýgel obsahující bakterii Bacillussubtilis a inhibitor B-2-thienylalanin. Agarovýgel je schopen podporovat růst bakterií, ale B-2-thienylalanin teto růst inhibuje. • V přítomnosti zvýšeného množství Phe je inhibice překonána a bakterie rostou. Intenzita růstu bakterií je přímo úměrná množství Phe v krvi, který se vyluhuje z HPA/PKU, molekulární patologie onemocnění PAH - enzym fungující v jaterních buňkách x mentální retardace jako klinický projev HPA/PKU Hematoencefalická bariéra - aminokyselinový transportér LATI - transport Phe a dalších velkých neutrálních aminokyselin (LNAA: Tyr, Trp) z krve do mozku. Phe má vyšší afinitu k LATI než Tyr, Trp -> vysokou koncentrací v krvi Phe snižuje příjem dalších LNAA do mozku; tj tyrosinu a tryptofanu (prekurzory dopaminu a serotoninu; neurotransmitery). > Terapie -nízkobílkoviná dieta s omezením fenylalaninu a podáváním směsi aminokyselin bez fenylalaninu + podávání velkých neutrálních aminokyselin (LNAA). T nh2 hn"" i r""^nh2 r1 'nh2 r ho^J rii 1 2 > ri 3 > ri 4 ■ n i * i L 1 L IJ L 1 "V ho^V ho^V ho^V ho^V oh oh oh oh oh l-tyrosine l-DOPA Dopamine Norepinephrine Epinephrine y oh nh2 ^ nh2 5 2 ho^ r h h h Tryptophan 5-Hydroxytryptophan Serotonin 1 Patobiochemie 2020 80 HPA/PKU, therapie pomocí PAL • Enzymová substituční terapie pomocí fenylalanin amonium-lyázy (PAL) • PAL - konvertuje Phe na kyselinu skořicovou (řrans-cinnamic acid) a amoniak (rostliny, houby, kvasinky) • Terapie: i) orální podání je komplikováno proteolytickou degradací enzymu; ii) injektovaná PAL je imunogenní, konjugace PAL a polyethylenglykolu (PEG-PAL) snižuje imunitní odpověď. • Byly provedeny klinické studie hodnotící bezpečnost a účinnost opakovaně podávaných injekci PEG-PAL.....podkožní podávání PEG-PAL bylo bezpečné a dobře tolerované a zdá se účinné při snižování krevního Phe...... \ ŕ" PAH L-Phe ) HaN* H L-Tyr 1 *————r | + NH3 1 H L-Phe lPatobiochemie 20^a/TS-cinnamic acid HPA/PKU, terapie pomocí tetrahydrobiopterinu (BH4) • Bylo zjištěno, že zvýšená hladina Phe může být redukována podáním BH4. • Klinické zkoušky ukázaly, že BH4 (Sapropterin dihydrochlorid, Kuvan) je bezpečný a efektivní v terapii pacientů s mírnou HPA a mírnou PKU. Hladina Phe v krvi: > Norma: 50- 110 umol/L > Mírná HPA: 120 - 600 jimol/L > Mírná PKU: 600 - 1200 ^mol/L > Klasická PKU: > 1200 umol/L Phenylalanine hydroxylase Phenylalanine hydroxylase protein consisting of t subunits US. N jlrionjl Libijry of Madirin* Single phenylalanine hydroxylase subumt ÍI NAD dihydrobiopterin reductase NADH + H+ I TN. N O H ¥ H 7 HCH—CH—CH3 I 1 ÜII OH 5,6,7,8-Tetra hyd robiopterin H H H HN X. ,^ ^T"N H CH-CH-CH3 OII OH 1 Patobiochemie 20ftPa«rdF?íioptfrin Cquinoid form) phenylalanine hydroxylase HM0 NH3 H-f VCH2-CH-Phenylalanine COO NH3 H£ }-CK2—CH— COO" Tyrosine 82 Protein folding The surface free-energy changes of proteins during their moving towards the native state. fibrils -*-* Intramolaculsr contacts Interrnolacular contacts 1 Patobiochemie 2020 NATURE I VOL 475 | 21 JULY 2011 - Partially folded states are problematic - proteins tend to aggregatein concentration dependent manner. - Aggregation primarily results in amorphous structures, oligomers, and amyloid fibrils. Formation of these structures is strongly restricted by chaperones. - Molecular chaperone interact with, stabilize,and help proteins to acquire its functionally active conformation, without being present in its final structure. - Different classes of structurally unrelated chaperones exist in cells. HPA/PKU Molekulární chaperony - zabraňují „misfoldingu" proteinu, pomáhají proteinu získat funkční konformaci, nejsou přítomny v konečné struktuře proteinu. Mutace v PAH genu mohou vést ke změnám ve výsledné struktuře proteinu („protein misfolding"), které následně vedou k jeho degradaci event. agregaci. Tetrahydrobiopterin, BH4 -molekulární chaperon pro PAH. Odpověď na terapii BH4 závisí u pacienta s HPA/PKU na typu mutací v PAH genu - pacienti s mutací zachovávající zbytkovou aktivitu PAH (tj. pacienti s mírnějšími fenotypy) reagují na léčbu BH4. °9 IK protein function \ 1 Patdbiocheime 2020 -M- J Inherit Metab Dis (2010) 33:649-658 HPA/PKU, terapie pomocí tetrahydrobiopterinu (BH4) 54 24 10 10 All patients GOO—899 900—1199 >1200 Blood phenylalanine at baseline (^rnol/L) Efficacy of BH4 therapy in the management of HPA/PKU. (A) Response rates (%) accordingto blood phenylalanine levels after sapropterin treatment (10 mg/kg/day) over a period of 8 days. Molecular Genetics and Metabolism 96 (2009) 158-163 Hladina Phe v krvi: > Mírná HPA: 120 - 600 ^mol/L > Mírná PKU: 600-1200 ^mol/L > Klasická PKU: > 1200 ^mol/L 1 Patobiochemie 2020 85 Amyloid fibrils - elongated nanoscale structures Amyloid fibril formation by proteins and polypeptides: • Well-known amyloid-associated disease - Alzheimer's disease, in which the (3-amyloid polypeptide aggregates and learning and memory is affected; Parkinson's disease, in which a-synuclein protein aggregates and motor function is affected; and type 2 diabetes, in which the islet amyloid polypeptide (IAPP, or amylin) aggregates and pancreatic (3-cell function is affected. It was determined that the single amino acid could form amyloid-like assemblies. The formed assemblies had the same typical ultrastructural morphology as protein amyloids when visualized using electron microscopy. The ability of phenylalanine to form amyloid assemblies was demonstrate in the brains of PKU-mice and PKU human patients, in which Phe is accumulated due malfunction of PAH. The mechanism of degeneration appears to be the induction of apoptotic cell death in various organs and tissues in which assemblies are being accumulatqdpatoblochemie 2020 Ehud GazitJ Inherit Metab Dis (2016) 39:483-488 86 HPA/PKU, DNA diagnostika * Detekce sekvenčních změn malého rozsahu: PCR + sekvenční analýza exonů a přilehlých intronových oblastí * Detekce rozsáhlých delecí/duplikací: MLPA Iff |T1_B Th» PAH 9*m^^^^^ Exon 1 2 3 4 5 6 7 8 91011 1213 Wild type N167Y Mutant ,Ca2bj Ca2b^ Celkový počet pacientů: 758 • Počet pacientů kompletním genotypem (2 mutace): 751(99,1%) • Počet pacientů s jednou mutací: 7 Wild type D229G Mutant • 77% mutací je typu missense. • Nejčastější mutace: C.12220T, p.(Arg408Trp) -42% mutantních alel Wild type 1 Patobiochemie 2020 L333 K. Réblová et alv Clinica Chimica Acta 419 (2013) 1-10 HPA/PKU - functional analysisof mutant protein PAH mutations can lead to impaired tetramer assembly Oligomerization profiles of wild-type and variant PAH were determined by size-exclusion chromatography. Arrows mark the elution volumes of soluble aggregates, tetramers, dimers, and monomers. (A) Profiles of variants arising from mutations located in the regulatory domain (R). I65S showed increased amounts of dimers. (B) Profiles of variants arising from mutations located in the catalytic domain (C). S310Yand R408W eluted as high-molecular-weight aggregates without any detectable tetramers. (C) Profiles of variants arising from mutations mapping to the dimerization motif of the oligomerization domain (0). Y417H showed significant amounts of monomers and increased amounts of dimers. lPatobiochemie 2020 S.W. Gersting, The American Journal of Human Genetics 83, 5-17, July 2008 Aggregates Tetramers Dimers V V V V B c u a> N "5j E o Elution volume (ml) Aggregates Tetramers Dimers V V V V A • J 45 50 55 60 65 Elution volume (ml) R • R408W 70 75 Aggregates Tetramers Dimers V V V V Monomers V O T5 m N E Elution volume ^ml1 Analýza DNA - poznámka • Laboratoř provádí molekulárně genetickou diagnostiku vybraných DMP a jiných genetických chorob. V současné době pracoviště může analyzovat více než 60 genů pro potřeby postnatální i prenatální diagnostiky (Tabulka 23 - metodická příručka). Základními technikami je sekvenování Sangerovou metodou, • fragmentační analýza a MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). • Při vyšetření genomové DNA je metodou sekvenování analyzována celá kódující sekvence genu • spolu s přiléhajícími intronovými oblastmi. Pokud byly v rodině mutace již identifikovány, u • příbuzných se obvykle vyšetřují pouze tyto mutace. 1 Patobiochemie 2020 89 • Gene Therapy has made important medical advances in less than two decades. Within this short time span, it has moved from the conceptual stage to technology development and laboratory research to clinical translational trials for a variety of deadly diseases. Among the most notable advancements are the following: • Gene Therapy for Genetic Disorders • Severe Combined Immune Deficiency (ADA-SCID) ADA-SCID is also known as the bubble boy disease. Affected children are born without an effective immune system and will succumb to infections outside of the bubble without bone marrow transplantation from matched donors. A landmark study representing a first case of gene therapy "cure,"or at leasta long-term correction, for patients with deadly genetic disorderwas conducted by investigators in Italy. The therapeutic gene called ADA was introduced into the bone marrow cells of such patients in the laboratory, followed by transplantation of the genetically corrected cells back to the same patients. The immune system was reconstituted in all six treated patients without noticeableside effects, who now live normal lives with their families withoutthe need for further treatment. Chronic Granulomatus Disorder (CGD) CGD is a genetic disease in the immune system that leads to the patients' inability to fight off bacterial and fungal infections that can be fatal. Using similar technologies as in the ADA-SCID trial, investigators in Germany treated two patients with this disease, whose reconstituted immune systems have since been able to provide them with full protection against microbial infections for at least two years. • Hemophilia Patients born with Hemophilia are not able to induce blood clots and suffer from external and internal bleeding that can be life threatening. In a clinical trial conducted in the United States , the therapeutic gene was introduced into the liver of patients, who then acquired the ability to have normal blood clotting time. The therapeutic effect however, was transient because the genetically corrected liver cells were recognized as foreign and rejected by the healthy immune system in the patients. This is the same problem faced by patients after organ transplantation, and curative outcome by gene therapy might be achievable with immune-suppression or alternative gene delivery strategies currently being tested in preclinical animal models of this disease. • Other genetic disorders After many years of laboratory and preclinical research in appropriate animal models of disease, a number of clinical trials will soon be launched for various genetic disorders that include congenital blindness, lysosomal storage disease and muscular dystrophy, among others. 1 Patobiochemie 2020 90 Gene Therapy for Acquired Diseases • Cancer Multiple gene therapy strategies have been developed to treat a wide variety of cancers, including suicide gene therapy, oncolytic virotherapy, anti-angiogenesis and therapeutic gene vaccines. Two-thirds of all gene therapy trials are for cancer and many of these are entering the advanced stage, including a Phase III trial of Ad.p53 for head and neck cancer and two different Phase III gene vaccine trials for prostate cancer and pancreas cancer. Additionally, numerous Phase I and Phase II clinical trials for cancers in the brain, skin, liver, colon, breast and kidney among others, are being conducted in academic medical centers and biotechnology companies, using novel technologies and therapeutics developed on-site. • Neurodegenerative Diseases Recent progress in gene therapy has allowed for novel treatments of neurodegenerative diseases such as Parkinson's Disease and Huntington's Disease, for which exciting treatment results have been obtained in appropriate animal models of the corresponding human diseases. Phase I clinical trials for these neurodegenerative disorders have been, or will soon be, launched. • Other acquired diseases The same gene therapeutic techniques have been applied to treat other acquired disorders such as viral infections (e.g. influenza, HIV, hepatitis), heart disease and diabetes, among others. Some of these have entered, or will soon be entering, into early phase clinical trials. • www.asact.ora/about aene therapv/diseases.php • http://www.asgct.org/about_gene_therapy/diseases.php 1 Patobiochemie 2020 91