1
1. Biologické oxidace.
Účinky volných radikálů na organismy.
Lipoperoxidace,antioxidanty.
2. Xenobiotika a jejich účinky na
organismus. Detoxikace,
mechanismus.
Patobiochemie 2016
• Oxidační stres vzniká při velkém nahromadění
vznikajících reaktivních forem kyslíku/dusíku, kdy
organizmus není schopen je likvidovat.
• Oxidační stres poškozuje buňky (zejména buněčné
membrány, proteiny), enzymy, genetický materiál a
přispívá ke vzniku infekčních i degenerativních
onemocnění.
• Přisuzuje se mu role při vzniku např. aterosklerózy,
cukrovky, nádorových onemocnění, degenerativních
nervových onemocnění, stárnutí aj.
• Nemají jen nepříznivý účinek - pod dozorem bílých
krvinek slouží k zabíjení bakterií, parazitů, virů,
nádorových buněk…
Oxidační stres
2
Volné radikály
Jakákoliv molekula/atom schopná samostatné
existence, který obsahuje 1/více nespárovaných
elektronů
Atom: proton, neutron, elektronový obal (orbital)
Radikál: obsahuje volný nepárový elektron v zevním
orbitalu (může to být atom i molekula, neutrál či ion)
-homolytické štěpení kovalentní vazby ( energeticky
náročné, není časté v biolog. systémech)
- redukcí, oxidacé
• většina biomolekul nejsou radikály
3
Radikálová reakce
Radikál: snaha o spárování elektronů,
většinou značná reaktivita
Obecně tři stadia
• iniciace
• propagace
• terminace
4
Reaktivní formy kyslíku a dusíku
• Souhrnné označení pro volné radikály a některé
neradikálové sloučeniny (RONS)
• významné fyziologické funkce v organismu
• Za určitých podmínek toxické
• Přeměny katalyzovány ionty přechodných kovů
• Fentonova reakce: H2oO2 + Fe2+ …. HO. + HO- + Fe3+
• Regenerace Fe2+: O2-. …
• Haber-weissova reakce
• Přechodné kovy: první řada d-prvků má nepárové elektrony a lze je tedy
považovat za volné radikály, kromě Zn
• Nejvýznamnější Fe, Cu, Mn a Zn
• v organizmu vázány v depontních formách, inaktivní,
Fransferin, feritin, ceruloplasmin 5
ROS (reactive oxygen
species)
volné radikály
superoxid, O2
· hydroxylový
radikál,
OH ·
peroxyl, ROO ·
alkoxyl, RO ·
hydroperoxyl, HO2
·
nejsou volnými radikály
peroxid vodíku, H2O2
(Fentonova reakce)
kyselina chlorná, HClO
ozon, O3
singletový kyslík, 1O2
6
RNS (reactive nitrogen species)
volné radikály
oxid dusnatý, NO .
oxid dusičitý, NO2
.
nejsou volnými radikály
nitrosyl, NO+
kyselina dusitá, HONO
oxid dusitý, N2O3
oxid dusičitý, N2O4
peroxynitrit, ONOO alkylperoxinitrit,
ROONO
kyselina chlorná, HOCl
Chloran ClO-
7
8
Hlavní zdroje volných radikálů
Dýchací řetězec v mitochondriích
• 1 - 4 % O2 při oxidativní fosforilaci přeměněno na superoxid a H2O2
Biotransformace v endoplazmatickém retikulu
• reakce katalyzované Cyt P450 vedoucí ke vzniku volných radikálů
Bílé krvinky
• ROS jako ochrana při napadení bakteriemi (enzym NADPH - oxidáza)
Fentonova reakce přechodových kovů
Fe++ + H2O2Fe+++ + HO– + HO.
Fyzikální faktory
• UV a X-ray záření
Vznik volných radikálů
Metabolismus
Mitochondrie
Zánět - imunitní reakce
Bílé krvinky
UV záření
Ionizační
záření Kouření
Znečištění
ŽP
Poškození
DNA
9
Oxidativní stres
• antioxidační procesy nestačí eliminovat nadbytek volných radikálů
Oxidační
procesy Antioxidanty
Oxidativní
stres
Ochrana proti OS
Ochrana
proti OS
Oxidativní
stres
Odkud se volné radikály berou?
hlavní producenti ROS : membránově vázané
enzymy popř. koenzymy flavinové struktury,
hemové koenzymy, enzymy s Cu v aktivním centru
1. respirační řetězec mitochondrií : především
superoxid a následně H2O2
• cca 1- 4% O2 vstupujícího do resp. řetězce (hlavně
komplexy I a III)
10
11
Odkud se volné radikály berou?
2. endoplazmatické retikulum
vznik superoxidu (cytochrom P- 450)
3. specializované buňky (leukocyty, makrofágy)
produkce superoxidu NADP-oxidasou
4. oxidace hemoglobinu na methemoglobin
(erytrocyt je „nabit“ antioxidanty)
12
13
Dýchací řetězec
~
Reaktivní formy kyslíku
14
Živiny jsou redukované formy uhlíku
protože v nich převažují nízká oxidační čísla uhlíku
O
OH
OH
OH
OH
CH2OH
I
0
0
0
0
-I
H3C
COOH
-II
-III
III
H3C CH
NH2
COOH
-III III0
glukosa: 6,7 % H
Průměrné ox.č. C = 0,0
alanin: 7,9 % H
Průměrné ox. č. C = 0,0
stearová kyselina: 12,8 % H
Průměrné ox. č. C = -1,8  uhlík je nejvíce redukovaný
15
Dva způsoby vzniku ATP v buňce
95 % ATP vzniká aerobní fosforylací (za přítomnosti O2):
ADP + Pi + energie H+ gradientu  ATP
5 % vzniká substrátovou fosforylací:
ADP + makroergní fosfát ⇄ ATP + druhý produkt
ADP + 1,3-bisPglycerát ⇄ ATP + 3-P-glycerát (glykolýza)
ADP + fosfoenolpyruvát  ATP + pyruvát (glykolýza)
GDP + [sukcinyl-CoA + Pi ⇄ sukcinylfosfát] ⇄ GTP + sukcinát + CoA (citrát. cyklus)
ADP + kreatin-P ⇄ ATP + kreatin (sval, směr reakce je ovlivněn aktuální koncentrací)
vyšší / srovnatelný energetický obsah jako ATP
16
DŘ je soustava redoxních dějů ve vnitřní mitochondriální membráně,
která začíná oxidací NADH a končí redukcí O2 na vodu.
Transfer elektronů ve vnitřní mitochondriální membráně je spojen s
transferem protonů přes membránu do mezimembránového prostoru.
Protonový gradient je využit na syntézu ATP.
H+
H+
H+
H+
– – –
+ + +
ADP + Pi
ATP
NADH+H+ O2 2H2ONAD+
H+
H+ H+
H+
H+H+
H+
H+ H+
H+
H+H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
e–
protonový gradient
Matrix (negativní)
MMP (pozitivní)
17
Komponenty dýchacího řetězce
• substráty (NADH+H+, FADH2)
• enzymové komplexy (I – IV)
• kofaktory vázané na enzymy komplexů (FMN, FAD, Fe-S, hem)
• samostatné složky mezi komplexy (ubichinon, cytochrom c)
Rozlišujte:
hem (cyklický tetrapyrrol chelatující iont Fe) × cytochrom (hemový protein)
18
Sběrná místa pro redukční ekvivalenty
CC
-oxidace
Q
I.
II.
člunek
NADH + H
NAD
+
matrix
cytoplazma
FAD
FAD FAD
glycerol-P DHAP
sukcinát
fumarát
alkanoyl-CoA
alkenoyl-CoA
I.
acyl-CoA
enoyl-CoA
pyruvát, CC, ketolátky
19
Enzymové komplexy v DŘ
Název Kofaktory Oxidace Redukce
I. NADH-Q oxidoreduktasa* FMN, Fe-S NADH  NAD+ Q  QH2
II. sukcinát-Q reduktasa FAD, Fe-S, cyt b FADH2  FAD Q  QH2
III. Q-cytochrom-c-reduktasa Fe-S, cyt b, c1
QH2  Q cyt cox  cyt cred
IV. cytochrom-c-oxidasa cyt a, a3, Cu cyt cred  cyt cox O2  2 H2O
* také zvaný NADH dehydrogenasa
20
• cca 98 % O2 je spotřebováno v DŘ (cytochrom-c-oxidasa)
• kromě vody vznikají také reaktivní formy kyslíku (ROS, reactive oxygen species)
• hlavním zdrojem ROS jsou komplexy I a III (vzniká superoxid)
• produkce superoxidu se zvýší pokud se tok elektronů v DŘ zpomalí n.
otočí
• mitochondrie obsahují řadu antioxidantů (GSH, QH2, superoxiddismutasa)
Mitochondrie a oxidační stres
dýchací řetězec
cyt cROS
mitochondriální
dysfunkce apoptóza
nekróza
lipoperoxidace VMM
nemoci, stárnutí
mutace
mtDNA
defektní
proteiny uvolnění cytochromu c
TEST
21
Mitochondrie a apoptosa
• apoptóza je kontrolovaný proces zániku buňky s minimální odezvou na
okolní tkáň,
• apoptóza je významná pro přirozenou obnovu tkání
• regulační proteiny apoptózy tvoří rodinu Bcl-2 (B-cell lymphoma 2),
• některé jsou anti-apoptotické (Bcl-xl), jiné pro-apoptotické (Bax, Bak)
• Bax a Bak proteiny oligomerují a vytvoří pór v zevní mitochondriální
membráně,
• cytochrom c se uvolní do cytosolu, naváže se na neaktivní kaspásy a
další proapoptotické faktory – vytvoří se apoptosom – a tím se spustí
exekuční fáze apoptosy (kaspásová kaskáda)
22
Reaktivní formy kyslíku v organismu
Radikály Neutrální, anionty, kationty
Superoxid ·O2
Hydroxylový
radikál ·OH
Peroxylový radikál* ROO·
Alkoxylový radikál RO·
Hydroperoxylový radikál HOO·
Oxid dusnatý NO·
Peroxid vodíku HOOH
Hydroperoxidy* ROOH
Kyselina chlorná HClO
Singletový kyslík 1O2
Peroxynitrit ONOONitronium
NO2
+
* Deriváty fosfolipidů během lipoperoxidace: PUFA-OO·, PUFA-OOH
23
Hydroxylový radikál HO·
• Nejreaktivnější volný radikál, reaguje okamžitě s
molekulami v místě vzniku
• Reaguje se všemi molekulami přítomnými v
živých organizmech
• Extrémně silné oxidační činidlo
• Vznik: Fentonova reakce, homolytické štěpení
vazby O-O v H2O2, ionizačním zářením, reakci
HOCl s O2-., ultrazvukem, při lithotripsii a
lyofilizaci
24
Vysoce reaktivní hydroxylový radikál
•OH vzniká Fentonovou reakcí
H2O2 + Fe2+  •OH + OH- + Fe3+
H2O2 + •O2
-  •OH + O2 + OHnebo
z peroxidu vodíku a superoxidu, za katalýzy Fe2+ ionty:
25
Superoxidový anion-radikál ·O2
•
vzniká jednoelektronovou redukcí dikyslíku
• relativně málo reaktivní
• působí jako oxidační a redukční činidlo (redukce cytoch. C
x oxidace askorbátu)
• Přímé poškození biomolekul vysoce selektivní
• Nepřímé usnadňuje vznik HO.
• Tvorba peroxynitrili po reakci s NO.
O2 + e-  ·O2
[toto
není reakce, pouze jeden redoxní pár]
26
Vznik superoxidu v organismu
• tzv. respirační vzplanutí (NADPH oxidasa,
fagocytující leukocyty)
2 O2 + NADPH  2 ·O2
- + NADP+ + H+
• spontánní oxidace hemoproteinů
hem-Fe2+ + O2  hem-Fe3+ + ·O2
[toto
jsou reakce, tedy kombinace dvou redoxních párů]
27
Singletový kyslík 1O2
• excitovaný stav tripletového dikyslíku, molekulový O2 s spárovanými
spiny, reaktivnější než běžný O2,
• vzniká při fotochemických rekcích, mj. po absorpci světla některými
pigmenty (porfyriny)
• Způsobuje biologické poškození (poškození sítnice, porfyrie)
• Léčba novorozenecké žloutenky, psoriázy
• Interakce s jinými molekulami
• Chemické reakce (vznik hydroperoxidů, endoperoxidů z látek s jednou či
více dvojných vazeb/konjugovaných systémů
• Vznik karbonylových sloučeniz z tryptofanu
• Přenos exitační energie (quenching, zhášení)
3O2  1O2
28
Peroxid vodíku H2O2
• in vitro poměrně nestálá sloučenina, snadno se
rozkládá se na vodu a kyslík
• v organismu vzniká při deaminaci AK/aminů
• také při xathinoxidasové reakci
• dvouelektronová redukce O2
• může oxidovat -SH skupiny enzymů, produkovat
hydroxylový radikál aj.
• Málo reaktivní, ve vysokých koncentracích toxický
29
Oxidační deaminace aminokyselin poskytne
amoniak, oxokyselinu a peroxid vodíku
R CH
NH2
COOH
FAD FADH2
R C COOH
NH
O2H2O2
katalasa
H2O + O2
H2O
R C COOH
O
NH3
iminokyselina
H2O + ½ O2
30
Xanthinoxidasa produkuje peroxid vodíku
hypoxanthin + O2 + H2O  xanthin + H2O2
xanthin + O2 + H2O  močová kyselina + H2O2
většina tkání, hlavně játra
31
Srovnejte: redukce dikyslíku
Typ redukce Dílčí reakce (redoxní pár)
Čtyřelektronová O2 + 4 e- + 4 H+  2 H2O
Jednoelektronová O2 + e-  ·O2
Dvouelektronová
O2 + 2 e- + 2 H+  H2O2
32
Kyselina chlorná HClO
• vzniká v neutrofilních granulocytech z
peroxidu vodíku a chloridového aniontu
• reakci katalyzuje myeloperoxidasa
• HClO má silné oxidační a baktericidní účinky
• Poškození biomolekul:
• Poškození proteinů (převádí Met na Met sulfoxid,
Chlorace Tyr za vzniku 3-chlortyrosinu, poškození SH
skupin membrán. Proteinů
• Chlorace bazí DNA (hlavně pyrimidinů)
• Oxidace thiolů, askorbátu a NADPH
H2O2 + Cl- + H+  HClO + H2O
33
Oxid dusnatý NO· vzniká z argininu
má 1volný elektron, volný radikál
• Volná difúze mezi bunkami 1-10s, v krvy vychytán erytrocyty, produkován NO
syntasy: nNOS, eNOS, iNOS
• exogenní zdroje: léčiva, vazodilatancia
• Fyz. funkce (vasodilatace, neurotransmiter, makrofágy-baktericidní účinek
• NO· se váže na guanylátcyklasu  cGMP  relaxace hladké svaloviny
(hlavně cév) a další účinky …
• NO· je radikál a poskytuje další reaktivní metabolity: tvorba peroxynitritu a
dalších RNS a nitrosothiolů
NO· + ·O2
-  O=N-O-O-  O=N-O-O-H (kys. peroxodusitá)
H+
NO2
+ + OH- ·NO2 + ·OH
nitrace tyrosinu NO3
- (plazma, moč)
peroxonitrit
nitrosylace
34
Sloučeniny uvolňující NO
CH2 O NO2
CH
CH2
O NO2
O NO2
O
OO
O NO2
O2N
CH CH2 CH2
H3C
H3C
O N O
Na2[Fe(CN)5NO]
nitroprusid sodný (natrii nitroprussias)
pentakyanonitrosylželezitan disodný
rubínově červené krystaly
extrémně účinný, i.v. infuze
glycerol trinitrát (glyceroli trinitras)
nažloutlá olejovitá kapalina
klasické léčivo, působí rychle
sublinguální tablety, sprej, náplast
isosorbid dinitrát (isosorbidi dinitras)
výhodnější farmakokinetické vlastnosti
amyl-nitrit (amylis nitris)
těkavá kapalina, inhalační aplikace
CH
H3C
H3C
CH2 O N O
isobutyl-nitrit
těkavá kapalina, nová droga
poppers, rush, liquid aroma …
Peroxynitrit ONOO•
Silné cytotoxické oxidační činidlo
• Toxické účinky:
• Deplexe –SH skupin a dalších antioxidantů
• Oxidace lipidů
• Zlomy DNA , nitrace a deaminace DNA bazí (G)
• Nitrace aromatických AK (Tyr, Phe, Trp) 3-nitrotyrosin (inaktivace
enzymů, interference se signální transdukcí)
• Oxidace Met na sulfoxid
NO· + ·O2
-  O=N-O-O-
peroxonitrit
nitrosylace
35
Sirné radikály
• In vivo –SH –antioxidanty, ale thioly mohou být
zdrojem volnýc radikálů
• Tvorba thiolových radikálů GS.
• Vznik potenciálních cytotoxických radikálů
36
Exogenní příčiny vzniku volných radikálů
• Ultrafialové nebo ionizační záření (UV světlo,
g záření, X- záření)
• Kouření
• Znečištění ovzduší
• Intoxikace (PCB, CL4, chloroform, alkohol
• Potrava (tepelná úprava, drcení, vliv světla)
37
TEST
Endogenní příčiny vzniku volných
radikálů
• Reakce katalyzované XOD (úrazy,
nekrózy)
• Rozpad fagocytů a makrofágů (záněty,
sepse, popáleniny)
• Syntéza prostaglandinů
• Hyperglykmie
• Reperfúze po předchozí ischemii
(kyslíkový druh)
38
Funkce volných radikálů ve zdravém organismu
I Nástroj oxidas a oxygenas
• cytochromoxidasa (toxické meziprodukty, H2O2 a
superoxid, vázány na enzymu)
(mitochondriální dýchací řetěze)
• monoxygenasy (oxygenasy se smíšenou funkcí) aktivují
O2 v ER jater nebo v mitochondriích nadlevin;
hydroxylace
(cytochrom P450, oxidace širokého spektra substrátů
zaspotřeby O2, jaterní P450- metabolismus xenobiotik)
39
I Nástroj oxidas a oxygenas
• Xanthinoxidáza (XOD) –oxidace xanthinu na
kys. močovou
• Prolin a lysinhydroxylasy (hydroxylují Pro a
Lys při syntéze kolagenu)
• Tyrosinhydroxylasa (hydroxyluje Tyr,
zahájení syntézy dopaminu, adrenalinu,
noradrenalinu)
Syntéza hormonů štítné žlázy
-Thyreoperoxidasa
Oxidace I- na I2 peroxidem vodíku---mono a
dijodotyrosin, thyroxin T4, trijodthyronin T3
40
Oplodnění vajíčka
Spermie
narušení membrány vajíčka při průniku –
produkce O2-.
Vajíčko
Zabránění průniku dalších spermií –
produkce H2O2 ..tvorba příčných vazeb v
membraně
41
Funkce volných radikálů ve zdravém
organismu II
ROS a RNS proti bakteriím, fagocytoza
Forma obrany proti cizorodým částicím a mikroorganizmům
Makrofágy, neutrofily, NK buňky
Enzymy podílející se na zneškodnění pohlcených
mikroorganizmů ve fagocytu
• enzymový komplex NADPH-oxidasa leukocytů
a makrofágů (respirační vzplanutí)
• myeloperoxidasa - katalýza reakce
H2O2 + Cl- + H+ = HClO + H2O
• iNOS: závislá na NADPH (Arg-Citrulin..NO)42
Funkce volných radikálů ve zdravém
organismu III
• signální molekuly
primární posel  sekundární posel  info síť
• redoxní stav buňky ovlivňuje funkci této sítě
• redoxní stav: kapacita antioxidačního systému,
dostupnost redukčních ekvivalentů, intenzita
oxidační zátěže (RONS)
ROS: sekundární poslové
NO (neurotransmiter, cévní endotel-relaxace cévní
stěny, NO u fagocytující buňky)
43
Imunitní ochrana vs.regulace
masivní produkce ROS jako nástroj
imunitní ochrany
x
indukce změn nízkých koncentrací ROS,
jež jsou pravděpodobně regulačním
mechanismem
44
45
Pozitivní účinky kyslíkových radikálů
• meziprodukty oxidasových a oxygenasových
reakcí (cyt P-450), během reakcí jsou radikály
vázané na enzym, takže nepoškozují okolní
struktury
• baktericidní účinek fagocytů, respirační vzplanutí
(NADPH-oxidasa)
• signální molekuly (první poslové), zatím jasně
prokázáno u NO·, u některých dalších radikálů se
předpokládá podobné působení
Oxidační stres
Při porušení rovnováhy mezi vznikem a
odstraňováním RONS nastává tzv.
oxidační stres
Rovnováha může být porušena na obou
stranách!!
Příčiny vzniku oxidačního stresu:
-nadměrná tvorba RONS,
- nedostatečná činnost antioxidačního
obraného systému,
- kombinace
46
Poškození lipidů - atak na nenasycené MK
Poškození
• ztráta násobných
vazeb
• vznik reaktivních
metabolitů
(aldehydy)
Důsledek
• změna fluidity
propustnosti
membrán
• vliv na membránově
vázané enzymy 47
peroxidace lipidů
- řetězová reakce
- enzymové peroxidace lipidů (syntéza prostanoidů,
leukotrienů, aktivní centra hydro- a endoperoxidas (COX a
lipoxygenasy)
- neenzymová peroxidace lipidů – patologický proces,
meziprodukty lipoperoxidace, vazba na proteiny, ovlivnění
fluidity
Peroxidace kyseliny
linolenové
48
peroxylový radikál
hydroperoxid
Peroxidový radikál– alkanaly,
alkeny….modifikace, plíce
malondialdehyd
Poškození proteinů
Poškození
• agregace a síťování,
• fragmentace a štěpení
• reakce s hemovým železem
• modifikace funkčních skupin
Důsledek
• změny transportu iontů
• změny aktivity enzymů
• Proteolýza, aktivace proteáz a
fosfolipas důsledkem hromadění
Ca21 v cytosolu
• Vznik nových antigenních determinant
s následnýmiautoimunitními reakcemi49
Přímé poškození bílkovin působením RONS
-oxidace, hydroxylace, nitrace, chlorace AK, neprobíhá
řetězová reakce
Nepřímé poškození bílkovin produkty peroxidace lipidů
-alkoxylové a peroxylové radikály
Malondialdehyd a 4-hydroxynonenal, vznik příčných vazeb
mezi sousedními řetězci, vznik karmobynových sloučenin
Poškození DNA
Poškození
• štěpení cukerného
kruhu
• modifikace bází
• zlomy řetězce
Důsledek
• mutace
• translační chyby
• inhibice
proteosyntézy
• chybné párování
50
• Hydroxylace purinových bazí
- 8-hydroxyadenin, 8-hydroxyG, 8-oxoG, FapyG, FapyA
• Hydroxylace pyrimidinových bazí
-thyminglykol, uracilglykol,…
• Hydroxylace cukerných zbytků
-oxidace a fragmentace – uvolnění bazí, přerušení řetězce
DNA a tvorba malondialdehydu
51
Poškození biomolekul
Sloučenina Poškození Následky
lipidy
- oxidace PUFA (ztráta dvojných
vazeb)
-tvorba reaktivních sloučenin
(aldehydů a ROO·)
-oxidace cholesterolu
- změna propustnosti membrán
- poškození membr. enzymů,
proteinů
- Změna fluidity membrán
Proteiny
- modifikace -SH a fenylu
(arom.) AK
- vznik příčných vazeb mezi
řetězci-sítování a agregace
- fragmentace + štěpení
změny v transportu iontů
vstup Ca2+ do cytosolu
změny v aktivitě enzymů
vznik nových antigeních determinant
aktivace proteáz a fosfolipáz
DNA
Modifikace a štěpení deoxyribosy
modifikace bází
zlomy řetězce
Vznik příčných vazeb mezi
řetězci DNA a proteinů
Vznik mutací
Chyby v párování bazí
translační chyby
inhibice proteosyntézy
TEST
Jak umíme oxidační stres kvantifikovat ?
Detekce volných radikálů
• poměrně náročné vzhledem vzhledem k
fyz. chem. vlastnostem
Měření produktů oxidačního stresu
• jednodušší, široká paleta markerů
oxidačního stresu
52
Markery oxidačního stresu
Posouzení lipoperoxidace:
malondialdehyd (MDA), konjugované dieny,
izoprostany
Posouzení poškození proteinů :
proteinové hydroperoxidy
Posouzení poškození DNA :
stanovení modifikovaných nukleosidů (8-oxoG)
53
Stanovení antioxidantů
askorbát
tokoferol
SOD
GSHPx
glutathion
54
Onemocnění spojená s oxidačním stresem
Neurologická
Alzheimerova choroba
Parkinsonova choroba
Endokrinní
Diabetes
Gastrointestinální
Akutní pankreatitida
Vaskulární
Ateroskleroza
Ostatní
Obezita
Transplantace orgánů, Rakovina 55
Antioxidační ochranný systém
Tři typy ochrany
zábrana tvorby nadměrného množství RONS
• záchyt a odstranění radikálů (lapače,
vychytávače, zhášeče)
• reparační mechanismy poškozených
biomolekul 56
Přehled antioxidantů a vychytávačů VR
1. Endogenní antioxidanty
• enzymová (cytochrom c, SOD, GSHPx, katalasa)
• neenzymová
- membránová ( -tokoferol, -karoten,
koenzym Q 10)
- nemembránová (askorbát, uráty, transferin,
bilirubin)
2. Exogenní antioxidanty
• inhibitory vzniku VR (regulace aktivit enzymů)
• scavengery vzniklých VR (enzymy, neenzymy)
• stopové prvky (Se, Zn) 57
58
Antioxidační systémy organismu
1. Enzymy (endogenní)
superoxiddismutasa, katalasa, glutathionperoxidasa
2. Vysokomolekulární antioxidanty (endogenní)
transferrin, ferritin, ceruloplazmin aj., vážou volné ionty kovů
3. Nízkomolekulární antioxidanty (exogenní,
endogenní)
• redukující látky s fenolovým -OH (tokoferol, flavonoidy, urát)
• redukující látky s enolovým -OH (askorbát)
• redukující látky s -SH skupinou (glutathion, dihydrolipoát)
• látky s rozsáhlým systémem konjugovaných dvojných
vazeb (karotenoidy)
59
60
Superoxiddismutasa
• obsažena v každé buňce, fylogeneticky velmi starý enzym
• katalyzuje dismutaci superoxidu
2 ·O2
- + 2 H+  O2 + H2O2
• oxidační čísla kyslíku v reakci:
dvě isoformy: SOD1 (Cu, Zn, cytosol), dimer, Cu = redoxní
centrum cytosol, intermitochondriální prostor, hepatocyt,
mozek, erytrocyt, vysoká stabilita, katalýza při pH 4,5-9,5
• SOD2 (Mn, mitochondrie), tetramer, matrix mitochondrie, menší
stabilita než Cu, Zn – SOD, fylogeneticky mladší,
(-½)  (0) + (-I)
61
Eliminace H2O2 v organismu
• katalasa obsažena v erytrocytech
disproporcionace H2O2, H2O2  ½ O2 + H2O, při vysokých
koncentracích H2O2
Detoxikace alkylperoxidů : H2O2 +ROOH  O2 + H2O+
ROH
• glutathionperoxidasa (odstranování interacelulárních hydroperoxidů)
• obsahuje selenocystein, druhý substrát - glutathion (G-SH) redukuje H2O2 a
hydroperoxidy fosfolipidů (ROOH)
detoxikace peroxidu vodíku, GSSG se redukuje na GSH pomocí glutathionreduktásy
2 G-SH + H-O-O-H  G-S-S-G + 2 H2O
2 G-SH + R-O-O-H  G-S-S-G + R-OH + H2O
neškodný derivát
Glutathionperoxidasy
odstraňují intracelulární hydroperoxidy a H2O2
2 GSH + ROOH  GSSH + H2O + ROH
• cytosolová GSH - glutathionperoxidasa (EC
1.11.1.9, cGPx)
• extracelulární GSH - glutathionperoxidasa
(eGSHPx)
• fosfolipidhydroperoxid GSH - peroxidasa (EC
1.11.1.12, PHGPx)
62
63
Nízkomolekulární antioxidanty
Lipofilní Hydrofilní
Tokoferol
Karoteny
- Lykopen
- Lutein
Ubichinola
L-askorbát
Flavonoidy
Dihydrolipoáta
Glutathiona
Močová kyselinaa
a Endogenní sloučeniny.
64
Tokoferol
• Lipofilní antioxidant buněčných membrán a lipoproteinů
• Redukuje peroxylové radikály fosfolipidů na hydroperoxidy, které jsou
dále redukovány GSH, tokoferol se oxiduje na stabilní radikál
• PUFA-O-O· + Toc-OH  PUFA-O-O-H + Toc-O·
• Toc-O· se částečně redukuje na Toc-OH askorbátem n. GSH (fázové
rozhraní)
• Toc-O· + askorbát  Toc-OH + semidehydroaskorbát
O
HO
CH3
CH3
H3C
R
CH3
O
O
CH3
CH3
H3C
R
CH3
65
Karotenoidy
• Karotenoidy jsou polyisoprenoidní uhlovodíky (tetraterpeny)
• Odstraňují peroxylové radikály, samy se při tom mění na
stabilní karotenový radikál
• Mají schopnost zhášet (deexcitovat) singletový kyslík
• Zdroje v potravě: listová zelenina, žlutě, oranžově a
červeně zbarvená zelenina a ovoce
• Nejúčinnější antioxidant je lykopen, vyskytuje se pouze
v některých potravinách, hlavně rajčata a výrobky z nich
(kečupy, protlaky) – je termicky stabilní
• Vysoký příjem lykopenu ve středomoří
66
Obsah lykopenu v potravinách (mg/100 g)
Rajský protlak
Kečup
Rajská štáva/omáčka
Meloun
Papaja čerstvá
Rajčata čerstvá
Meruňky kompot
Meruňky čerstvé
10-150
10-14
5-12
2-7
2-5
1-4
~ 0,06
~ 0,01
Pro efektivní uvolnění a vstřebání
lykopenu je vhodné rajčata rozvařit
a konzumovat s tukem
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
CH3
CH3
67
Zeaxanthin a lutein
OH
CH3 CH3
CH3
CH3 CH3
CH3 CH3
CH3 OH
CH3CH3
CH3
CH3 OH
CH3 CH3
OH
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
zeaxanthin (dvě chirální centra)
lutein (tři chirální centra)
• patří mezi xanthofyly, kyslíkaté deriváty karotenoidů
• liší se polohou dvojné vazby a počtem chirálních center
• vyskytují se zejména v zelené listové zelenině
• obsažené ve žluté skvrně (macula lutea) a chrání ji před degenerací
68
Ubichinol (QH2)
• Vyskytuje se ve všech membránách
• Endogenní syntéza střevní mikroflórou z tyrosinu a
farnesyldifosfátu (odbočka při biosyntéze
cholesterolu)
• Exogenní zdroje: klíčkový olej, játra, maso
• Redukovaná forma QH2 pomáhá při regeneraci
tokoferolu
• Toc-O· + QH2  Toc-OH + ·QH
69
L-Askorbát (vitamin
C)
• Kofaktor hydroxylace prolinu (syntéza kolagenu)
• Kofaktor (reduktant) hydroxylace dopaminu na noradrenalin
• Silné redukční činidlo (Fe3+ Fe2+, Cu2+  Cu+)
• Umožňuje vstřebávání železa z potravy
• Redukuje radikály ·OH, ·O2
-, HO2·, ROO· aj.
• Regeneruje radikál tokoferolu
• Odbourává se na oxalát !!
• Nadbytek askorbátu má prooxidační účinky:
Fe2+ a Cu+ katalyzují vznik hydroxylového radikálu
askorbát + O2  ·O2
- + ·monodehydroaskorbát
70
L-Askorbová je dvojsytná kyselina
Dva konjugované páry:
askorbová kys. / hydrogenaskorbát
hydrogenaskorbát / askorbát
O
HO O
O
C
CH2OH
H OH
O
O O
O
C
CH2OH
H OH
O
HO OH
O
C
CH2OH
H OH
dva enolové hydroxyly
pKA1 = 4,2 pKA2 = 11,6
71
L-Askorbová kyselina má redukční účinky
O
O O
O
C
CH2OH
H OH
O
HO OH
O
C
CH2OH
H OH
askorbová kys. dehydroaskorbová kys.
(redukovaná forma) (oxidovaná forma)
72
Flavonoidy a ostatní polyfenoly
• Ubikvitárně rozšířené v rostlinách, nejhojnější redukční
sloučeniny v naší stravě
• Celkový příjem je cca 1 g (mnohem vyšší než u vitaminů)
• Deriváty chromanu (benzopyranu), obsahují mnoho
fenolových hydroxylů
• Hlavní představitel kvercetin
• Redukují volné radikály a samy jsou přeměněny na málo
reaktivní fenoxylové radikály
• Chelatují ionty kovů (Fe2+, Cu+) a zabraňují tak jejich účasti ve
Fentonově reakci
73
Hlavní zdroje flavonoidů a jiných
polyfenolů
• zelenina (nejvíc cibule)
• ovoce (jablka, citrusy,
hrozny)
• zelený čaj, černý čaj
• kakao, čokoláda
• olivový olej (Extra Virgin)
• červené víno
O
OH
OOH
HO
OH
OH
kvercetin
74
Glutathion (GSH)
• tripeptid
• γ-glutamylcysteinylglycin
• tvoří se ve všech buňkách
• redukční činidlo (-SH)
• redukuje H2O2 a ROOH (glutathionperoxidasa)
• redukuje různé kyslíkové radikály
• regeneruje -SH skupiny proteinů a koenzymu A
• podílí se na regeneraci tokoferolu a askorbátu
HOOC
N
N COOH
O
H
CH2
SH
O
H
NH2


g
75
Regenerace redukované formy GSH
• musí být zajištěna plynulá regenerace redukované
formy glutathionu (GSH)
• glutathionreduktasa, významná v erytrocytech
• GSSG + NADPH + H+  2 GSH + NADP+
pentosový
cyklus
76
Dihydrolipoát
• kofaktor oxidační dekarboxylace pyruvátu a 2-oxoglutarátu
• redukuje mnoho radikálů (mechanismus není znám)
• podílí se na regeneraci tokoferolu
• terapeutické použití (acidum thiocticum) – diabetické
neuropatie
S S
COOH
COOH
SH SH
dihydrolipoát
(redukovaná forma)
lipoát
(oxidovaná forma)
77
Kyselina močová
• Konečný katabolit purinových bází, dvojsytná kyselina
• V tubulech se z 90 % resorbuje
• Nejhojnější antioxidant krevní plazmy (150-400
μmol/l)
• Má výrazné redukční účinky, redukuje radikály RO·,
• Váže kationty železa a mědi
78
Laktimová forma kys. močové
je dvojsytná kyselina
N
N
N
N
H
OH
HO
OH
N
N
N
N
H
OH
HO
O
N
N
N
N
H
OH
O
O
kys. močová hydrogenurát urát
pKA1 = 5,4 pKA2 = 10,3
2,6,8-trihydroxypurin
79
Redukční účinky kyseliny močové
Různé přeměny
radikál
(oxidovaná forma)
hydrogenurát odštěpí jeden elektron
R· je např. ·OH, superoxid aj.
+
N
N
N
N
H
OH
HO
O
N
N
N
N
H
OH
HO
OR H RH+ +
hydrogenurát
(redukovaná forma)
Srovnejte koncentrace v krevní plazmě:
Askorbát: 10 - 100 μmol/l
Urát: 200 - 420 μmol/l
• Vazba iontů přechodných kovů, změna jejich
oxidačního stavu a zabráněné jejich účasti v
radikálových reakcích
• Ferooxidasová aktivita- mobilizace intracelulárních
zásob Fe
• Transportní proteiny (transferin, laktoferin,
ceruloplasmin)
• Zásobní bílkoviny (feritin, hemosiderin,
neuromelanin), haptoglobin, hemopexin
• Proteiny obsahující velké množství thiolových
skupin (metalothioneinů, albumin)
80
Vysokomolekulární antioxidanty
Stopové prvky ovlivňující VR
Selen
ovlivňuje resorpci vit. E, součást
selenoproteinů
 Se = nedostat. imunitní odp.., hemolýza
erytrocytů, syntéza methemoglobinu
Zinek
stabilizace buněčných membrán
zvýšení imunitní odpovědi, antagonista Fe
81
ROS
Enzymy
Proteiny
SOD, CAT, GPX,
GST, MSH,
RSH-PX
1GP, Trf,Alb
ferritin
Metabolity
Vitaminy
A, E, C, KoQ
bilirubin, urát
Mg, Mn, Zn, Se
lipoát,karnosin
NAD(P)H
Radiace
ZÁNĚT
(neutrofily,
makrofágy)
Arginin
(NOS)
Autooxidace
Elektron
-transport
Polutanty
Oxidasy
(+)
(-) (-)
DNA, RNA
PROTEINY
EnzymyLIPIDY
Chyby
Transkripce,
Translace
Oxid. nukleové
kyseliny
Alterované
PROTEINY (enzymy)
Oxid. modifik.
oxLP
82