jakost v klinické analýze její kontrola a řízení „fatální* význam klinické medicíny aplikace norem ISO řady 9000 jakost charakteristické a žádoucí vlastnosti nebo rysy výrobku či služby jakost je nepřímo úměrná variabilitě výrobku nebo služby : variabilita - odchylka od návrhu/záměru prověření všech etap celého stanovení analytu : od odběru vzorku až po výpočet; výcvik analytika, příprava činidel, mytí nádobí, nakládání s odpadem atd. výsledkem je návrh na jejich správné provádění a vytvořit podmínky pro provoz s minimálními odchylkami od předepsaného postupu, včetně kontrolního mechanizmu 68 definice dle ČSN ISO 8402 (nahrazena normou ČSN EN ISO 9000) jakost {quality) celkový souhrn vlastností a znaků výrobku (např. analytické soupravy) nebo služby (např. provádění analýz), které zaručují schopnost uspokojovat předem stanovené nebo předpokládané potřeby koncepce jakosti (quality policy) celkové záměry a směry působení organizace v oblasti jakosti formulované vrcholovým vedením (např. vedoucím laboratoře) řízení jakosti {quality management) součást funkce celkového řízení, která určuje a realizuje koncepci jakosti systém jakosti {quality systém) organizační struktura, zodpovědnosti, postupy, procesy a zdroje potřebné na realizaci řízení jakosti; požadavkem je, aby veškeré postupy byly jasné, řádně dokumentované a dodržované; systém jakosti je pravidelně kontrolován a doplňován; všichni pracovníci se aktivně zúčastňují zavádění a provozování systému jakosti 69 příručka jakosti řízení jakosti v laboratoři - příručka jakosti : je v každé certifikované či akreditované laboratoři komplexní dokument zahrnující všechny aspekty činnosti laboratoře, od činnosti vrcholového managementu až po úklid laboratoří „domácí norma" - převod obecných norem ISO 9000 resp. EN 45000 správné laboratorní praxe (GLP), bezpečnostních předpisů, zákonů a nařízení aj. na konkrétní podmínky laboratoře celková koncepce jakosti 1) laboratoř a její povinnosti - jméno laboratoře, adresa, fax, e-mail, tel. čísla, jméno zodpovědného vedoucího 2) pracovní doba laboratoře - způsob a doby příjmu vzorků 3) seznam zajišťovaných služeb - (včetně analytů) 4) komunikace mezi laboratoří a uživateli - popis žádanek, popis nálezového formuláře, pravidla pro předávání výsledků telefonicky, způsob, pro opravy či doplnění předaných analytických nálezů, dobu potřebnou k provedení analýz, včetně způsobu kontroly jejího dodržování 5) odběry vzorků (doba) - instrukce pro pacienta, doprava vzorků, úprava až po přípravu zkušebního vzorku a skladování včetně expirační doby; zajištění jednoznačné identifikace pacienta; způsoby vyřazení nevyhovujících vzorků; směrnice pro předávání dílčích vzorků do různých sekcí laboratoře 6) provádění analýz - psané návody pro užívané analytické postupy; dohledatelnost každého stanovení od žádanky až po laboratorní nález; kalibrace včetně návaznosti na metrologický vyšší etalony 7) interpretace výsledků - údaje o možnostech konzultace pracovníků laboratoře, určené kontaktní osoby 70 71 8) účast na klinických poradách, setkání s externími lékaři 9) výchova pracovníků laboratoře, kliniků, sester a studentů 10) informování o změnách v provozu, o akreditaci či certifikaci 11) účast na vývoji a výzkumu - koncepci účasti laboratoře na výzkumu a vývoji; systém kontroly a jména příslušných odpovědných pracovníků 12) způsoby zajištění povinné mlčenlivosti 13) počty pracovníků v jednotlivých kategoriích 14) údaje o vybavení laboratoře - názvy přístrojů, výrobci, rok nákupu, cena, údaje o záruce, umístění přístrojů, údaje o servisních prohlídkách, o opravách, provozní deník přístroje a jeho uložení; o kalibraci 15) bezpečnostní pravidla laboratoře a nemocnice - uložení příslušných směrnic; záznamy o nehodách a úrazech jakost není stav, ale dynamický, vylepšující se proces 72 kalibrační, kontrolní a referenční materiály chybná analýza => špatné rozhodnutí => poškození zdraví nebo smrt měřící proces - k měřenému signálu přiřadit jeho odpovídající koncentrace pomocí kalibračních materiálů (standardů) kontrolně-regulační proces - validace výsledku analýzy a zahrnutí do řízení jakosti; sledovaní analýzy v delším časovém intervalu : vyžaduje vhodné kontrolní a referenční materiály 50. - 70. léta XX. století analýzy manuální (fotometrický, titračně apod.) nebo poloautomatické (nalévací/odsávací kyvety) : objem vzorku 20 - 500 ul, objem činidel 1 - 5 ml : vodné roztoky připravené z čistého analytu dnes automatické analyzátory : objem vzorku v mikrolitrech, objem činidla v desítkách mikrolitrů : viskozita^ potíže) kalibrační roztoky bez biologické matrice nesplňují :: požadavek shody s analyzovaným vzorkem :: místo vodných roztoků kalibrátory s bílkovinnou matricí : certifikované referenční materiály 73 vodné kalibrační roztoky a standardy IFCC- všude, kde je to možné - kalibrace pomocí vodných roztoků standardů stabilizování a ochrana (oxidace, bakteriální kontaminace apod.) užití: atestace enzymů, ověřování výtěžnosti analytické metody, kontrola vlnových délek fotometrů apod. příprava: vážením; vysoce čisté chemikálie, redestilovaná voda uchování: skleněné ampule nebo dobře těsnících lahviček : pod inertní atmosférou N2 nebo C02 pomocné látky: albumin, polysacharidy, cukry, glycerol (stabilizace enzymů), cystein, dithiothreitol, kyselina askorbová (ochrana před oxidací), komplexany, (např. EDTA, maskování těžkých kovů kata lyžujících oxidaci), různé pufry a produkty enzymové hydrolýzy substrátů (zvýšení stability enzymů) a konzervační přísady (benzoan sodný, azid sodný apod) nesmějí obsahovat jako příměs/nečistotu uvažovaný standard (jen stopové a definované množství) kontrolní séra a moče k operativnímu řízení jakosti (k tzv. vnitřní kontrole kvality) kapalná - zmrazená (- 80 °C) : původně séra zvířecí: koňská {equine), hovězí {bovine), prasečí {porcine) : nahrazována séry lidského původu lyofilizovaná - stabilnější : připravována v nejméně dvou koncentracích pokrývajících jak referenční interval analytů, tak i patologické hodnoty séra s atestem - určení správnosti v delším časovém intervalu séra bez atestu - určení shodnosti (reprodukovatelnosti) parametry: pH 7 až 8, rozdíl obsahu ve stejné šarži < 0.1 %, volný glycerol < 0.2 %, mají být sterilní, zbytková vlhkost < 1 %, stabilita v chladu 3 roky, rozdíl obsahu labilních složek < 4 %, zákal po rekonstituci a zředění vodou 1:9 měřený kyvetě 1 cm jako absorbance při 700 nm pod 0.05 a při 340 nm pod 0.2 75 sérové kalibrátory podobné složení a chování jako analyzovaný vzorek příprava: jako kontrolní séra; koncentrace analytů se upravuje přidáním lyofilizáty - stabilita komutabilita s určenými metodami příprava a atestace: jako u kontrolních sér obsah jednotlivých analytů stanoven definitivními či referenčními metodami certifikovanými referenčními materiály přípravky pro normální a patologické hodnoty analytů multikalibrační přípravky 76 certifikované referenční materiály (CRM) : kalibrace definitivních a referenčních metod : testování/porovnávání rutinních metod (komutabilita) RM - materiál nebo látka, hodnoty vlastností stanovenými pro kalibraci přístrojového vybavení, vyhodnocení metody měření nebo pro stanovení hodnot materiálů CRM je RM doložený certifikátem : certifikovaná metoda je doprovázena nejistotou při dané úrovni spolehlivosti koncentrace a matrice analytů v CRM stejná jako analyzovaném vzorku vhodnost RM pro daný účel se prověřuje (ISO Guide 35:2006) šarže CRM musí být homogenní : rozdíly mezi reprezentativním měřením vzorku musí být vždy menší než celková nejistota všech měření CRM musí mít uvedenu svou expirační lhůtu CRM - opatřen atestem koordinace evropskou komisí při evropské unii, např. institutem pro referenční materiály a měření v Belgii (IRMM) 77 validace a správná laboratorní praxe potvrzení měřením (zkoušením) a opatření objektivního průkazu, že byly splněny jednotlivé požadavky pro určený účel validovaná analytická metoda - poskytuje medicínsky správné výsledky a využitím analytického výsledku při léčení pacienta nedojde k jeho újmě ověření velikosti celkové chyby - součtu chyb náhodných a systematických správná laboratorní praxe {goodlaboratoř/praxis, GLP) : mezinárodně dohodnutý systém zabezpečení a kontroly jakosti : zahrnuje organizaci zkoušek, studií a podmínek, za nichž jsou neklinické studie plánovány, prováděny, monitorovány, zaznamenávány, archivovány 78 operativní řízení jakosti také vnitrní kontrola kvality (VKK) nástroje VKK tzv. „báječná sedma": □ tabulka lodyha-list {stem-and-leaf display) - kontrolní data rozepsa-■§§§3 ná tak, aby bylo možné rychle posoudit globální rozdělení dat m._list závad {check list) - kalendář s uvedenými příčinami závad; řádky 5 • tvoří kalendář, do kterého se zapisuje, kdy a kolikrát se daná závada a— objevila Paretův graf {Pareto chart) - histogram se sloupci vyjadřujícími čet-lllii., nost jednotlivých typů závad v klesajícím pořadí s N diagram příčina-následek {cause and effect diagram) - grafický roz-/ / bor chyb a jejich zdrojů (□ proudový diagram {flow chart, defect concentration diagram) - gra-xffjh fické zobrazení zařízení či procesu s vyznačením citlivých bodů ,./. korelační diagram {scatter diagram) - korelační graf k odhadu vzá-jemných závislostí analyzovaného problému regulační diagram {control chart) 79 regulační diagram : 1931 W. A. Shewhart : 1950 S. Levey a E. R. Jennings - klinická biochemie jednoduchá grafická interpretace Gaussova rozdělení množina normálně rozdělených dat => v intervalu směrodatných odchylek od -s do +s leží 68.3 % údajů od ~2s do +2s leží 95.5 % údajů {varovná mez) od -3s do +3s leží 99.7 % údajů [regulační'mez) osa x - cas osa y - měřený signál : uvedený podíl údajů musí ležet v odpovídajících pásech na grafu : polovina těchto údajů musí být střídavě nad a polovina pod osou x 80 + 3s + 2s c S 5 10 _ 16 l h-á-*r-1 ■ ' ■ i +■» c 01 u 1 ->-"--28 --3s den měření kumulace jen na jednu stranu intervalu =s> systematická chyba v analytickém procesu : mimo varovnou mez závady v analytickém procesu nebo proces je úplně mimo kontrolu odchylky: A směrodatné odchylky (sx); A vychýlení (b) účinnost regulačního diagramu průměrné délky série (PDS) : 0 počet bodů, kdy právě vynášený bod indikuje metodu mimo kontrolu PDS-1 p kde p je pravděpodobnost, že libovolný bod překročí kontrolní meze operativní charakteristické křivky : závislost chyby p, tj. pravděpodobnosti nezjistit posun P- je Gaussova funkce, L je násobek sx dle zvolené meze, k je faktor respektující změnu x v násobcích sx, N je počet vzorků 81 silofunkce na rozdíl od operativní charakteristické křivky osa y - (1-/?), tedy pravděpodobnost zamítnutí 1.0 1-p 0.8 0.6 ŮA 0.2 0.0 1.0 ÍJ5 2.0 2.6 3.0 k-s vícekriteriální řízení jakosti využívá kombinací více kritérií pro hodnocení analýz 2 až 4 kontrolní měření na jeden běh analýz 5 různých kritérií :: varovná kritéria ::: l2s - kontrola za ±2s x řízení jakosti dle Westgarda {WestgardQC) 123456789 10 hodnotící kritéria ::: l3s, 22s, R4S/ 4ls, 10x, eventuálně 8X nebo 12x i 1 ! i i .... •s, ,.l ... i...... i narušení ^ kritéria y i i ; ..... „j ,,; V 1 : 1234 5 6 7 8 9 10 123456789 10 123456789 10 83 : pravděpodobnost falešného poplachu je minimalizována užitím kritéria l2s : pravděpodobnost pravého poplachu je maximalizována kombinací více kritérií :: musí detekovat jak nahodilé, tak i systematické chyby : použití jednokriteriálního místo vícekriteriálního řízení jakosti :: neužívání prostého l2s (Levey-Jennings), ale alespoň l3s :: risk < 90% pravděpodobnosti odhalení problému, > 5 % falešných poplachů ::: takže funguje jen u velmi robustních analytických metod 84 systém správy laboratorních informací (LIMS, /abora tory information management system) : centrální softvér (laboratorní informatika) :: sleduje celý postup od zadání až po odstranění vzorku : kontrola provedení : kontrola jakosti : automatizované zpracování dat : odstranění chyb způsobených lidským faktorem : autentizace procesu (místní původ analýzy, způsob analýzy...) : snadné audity akreditovaných laboratoří : časově i finančně náročná implementace : neexistuje standard :: mnoho různých dodavatelů :: není upraven normou, ani zákonem 85 zadání žádanka štítek s čárovým kódem potvrzení přijetí přijetí vzorku ok kontrola stavu vzorku přidělení vzorku v analyzátoru kanalizování vzorku špatný príprava vzorku laboratorní zpracování I analýza vzorku zprava o výsledku informační rutiny zpráva o selhání ANO finální potvrzení 1 záznam v výstupních dat nelze vyhodnocení výstupních dat 86 mezilaboratorní posuzování jakostí; (EQA, external quality assurance) součást obecného řízení jakosti každé laboratoře {cca lx za 2 měsíce) : validace metod : sledování laboratoře a porovnání její přesnosti vůči ostatním laboratořím nebo obecně platným požadavkům posuzuje se : vychýlení ve vztahu k současně dosahované úrovni {state-of-the-art), resp. vůči údajům získaným referenčními či definitivními metodami : dosahovaná úroveň všech zúčastněných laboratoří, a to jak podle inter-, tak i podle intra-laboratorního rozptýlení nalezených údajů : vztah mezi nalezenými údaji a způsobem kalibrace, analytickým postupem, užitými komerčními analytickými soupravami a použitým přístrojovým parkem : dosahovaná současnou úroveň v závislosti na koncentraci analytu v kontrolních materiálech 87 mezinárodní harmonizovaný protokol pro ověřování způsobilosti (chemických) analytických laboratoří international harmonised protocol for proficiency testing of (chemical) analytical laboratories : od roku 1992 : IUPAC, ISO a AOAC {association of official analytical chemists) materiál IFCC: základy mezilaboratorního posuzování jakosti přesná a protokolární organizace testu statistické vyhodnocení testu z-skóre z = (x-xa):sy kde sx je cílová směrodatná odchylka, x je naměřená veličina, xa dohodnutá (skutečná) hodnota veličiny a z má tvar směrodatné normální veličiny interpretace z-skóre 1 z I <, 1 lze hovořit o dobrém skóre j z j ^ 2 o skóre dostačujícím 2 <, I z I <, 3 o skóre problematickém skóre | z | ^ 3 skóre nedostačující význam hodnocení laboratoře úspěch laboratoře v externím hodnocení kvality její výkony jsou v tolerančních limitech akceptovaných příslušnou (mezinárodní společností klinické chemie pro dané období výběr odběr preanalyt. f. m, mimo laboratoři ' ' 20.2 % 3 fr, im — transport preanalyt f. ^ v laboratoři J 37.1 % registrace odstředění lit rozdělení příprava vzorku : preanalytická fáze : analytická fáze : postanalytická fáze 89 řízen a kontrolován - pouze vlastní analytický postup opomíjení preanalytické fáze (odběr, transport a uchovávání vzorku) chyby preanalytické fáze - až 50 % X analytický proces má asi 25 % zbytek připadá na tzv. postanalytickou fázi jednu hrubá chyba na cca 1600 analýz příprava vzorku (55 % jde na vrub jeho hemolýzy), nedostatečný objem vzorku (21 %), záměna vzorků (12 %) a koagulovaný vzorek (5 %) hrubá chyba ohrožuje život => zpřísnění kontroly preanalytické fáze Kill as fewpatients as possible & 56 other essays on how to be the worlďs best doctor, Arlan Cohn, 2004 posta na lytická fáze : uskladnění vzorků i výsledků : přeměna analytických výsledků na podložené informace (smysl lab. medicíny) : komunikace s praktikem, zpětná vazba : metaanalýza výsledků výběr metod/postupů je poznamenán vývojem oboru analytické chemie : kvalitativní : kvantitativní původně: metody chemické : počet stanovovaných analytů byl malý, nepřesáhl několik desítek od 70. let: metody biochemické/enzymové/molekulárně biologické : spektrofotometrie : průmyslová výroba enzymů, analyzátory zájmem klinické laboratoře je analytický postup : náročnější požadavky - analytické i klinické požadavky vlastní nepřesnosti výsledku testu: včetně preanalytických chyb, systematické vlivy, náhodné chyby a omyly biologické vlivy: intra- a inter-individuální variabilitu, chyby způsobené nestandardním odběrem vzorků nejistoty: schopnost testu skýtat správné závěry (diagnóza, prognóza, nebo terapeutická rozhodnutí) 91 90 iv. historie stanovení glukózy: 1) oxidoredukční vlastnosti v alkalickém prostředí, oxidace kyselinou pikrovou, ferrikyanidem nebo redukcí Cu1+; pracné, málo citlivé, nespecifické 2) 0-toluidinem přes Schiffovu bázi; citlivé a specifické; o-toluidin - kancerogen, činidlo obsahuje ledovou kyselinou octovou 3) stanovení enzymovými postupy (GOD) charakteristické znaky analytické metody definovaná a popsaná analytická metoda : charakteristické znaky, normované v mezinárodních normách ISO i v odvozených nebo převzatých národních normách 92 specifické klinické požadavky přesnost metody ve vztahu k biologické variabilitě rozsah kalibrační funkce - minimální rozsah kalibrační funkce v rozsahu referenčních hodnot analytu analytická metoda - v principu funkce daného analytu v organizmu ekologické a toxikologické požadavky analýza potenciálně infekčního biologického materiálu neužívat k analýze jedy, kancerogeny, žíraviny a hořlaviny nevyhnutelnost: stanovení kreatininu kyselinou pikrovou, celkové bílkoviny biuretovou reakcí s NaOH, stanovení hemoglobinu přes hemiglobinkyanid aj. 93 vlastní znaky analytické metody znak analytické metody {analyticalperformance characteristic) : vlastnost z množiny vlastností, které jsou nutné pro ověření přesnosti měřícího postupu a jeho vhodnosti pro daný účel a které může být přiřazena experimentálně určitelná hodnota definováno IFCC a IUPAC Česká společnost chemická (ČSCH) - jiná nomenklatura analytických znaků správnost {accuracy, trueness; ČCHS pravdivost) : těsnost shody mezi průměrnou hodnotou získanou z velké řady výsledků zkoušek a přijatou referenční hodnotou přijatá referenční hodnota (dohodnutá referenční hodnota) : hodnota, která slouží jako schválená referenční hodnota, odvoditelná jako :: teoretická :: odsouhlasená (certifikovaná), založená na experimentálních pracích :: přiřazená (certifikovaná), založená na experimentální spolupráci :: není-li ani jedna z předchozích; očekávaná hodnota měřitelné veličiny, tj. střední hodnota specifikovaného základního souboru měření strannost čili vychýlení {bias, odchylka) rozdíl mezi střední hodnotou výsledků zkoušek a přijatou referenční hodnotou stanovení: pomocí CRM nebo RM výtěžnost {recovery) poměrem vyjádřený rozdíl mezi údaji měřícího systému při měření vzorku se známým přidaným množstvím analytu a vzorku bez přídavku, vztažený na přidané množství shodnost, preciznost {precission, přesnost) těsnost shody mezi nezávislými výsledky zkoušek získanými za předem specifikovaných podmínek opakovatelnost {repeatibility) shodnost stanovená za podmínek opakovatelnosti (stejná laboratoř, stejná metoda, stejné zkušební zařízení, stejný operátor, během krátkého časového intervalu) 95 reprod u kovatel nost {reproducibility) shodnost stanovení za podmínek reprodukovatelnosti (stejná metoda, různá laboratoř, různý operátor, různé zkušební zařízení, různá doba) přesná specifikace - slouží jako základ při konstrukci regulačních diagramů nejistota měření {uncertainty of measurement) parametr přidružený k výsledku měření, charakterizující rozptyl hodnot, které by mohly být důvodně přisuzovány k měřené veličině zahrnuje mnoho složek pracovní interval {measuring interval) uzavřený interval hodnot, které lze určit daným měřícím postupem; je omezený dolní a horní mezí stanovitelnosti. U fotometrických metod se vybere lineární oblast kalibrační křivky nebo lineární část grafu závislosti 7~= /"(log c) linearita kalibračního vztahu {linearity) rozsah koncentrací, ve kterém je analytický signál lineární funkcí koncentrace 96 kalibrace soubor úkonů, za specifikovaných podmínek se stanoví vztah mezi hodnotami měřených veličin a odpovídajícími kalibračními hodnotami (etalony) kalibrační funkce s f (c) analytická citlivost - první derivace této funkce podle koncentrace dS df(c) dc dc vypočet kalibrační funkce z kalibračních údajů regresní analýzou lineární kalibrační funkce : 10 koncentrací v pracovním intervalu, 3-4 měření jedné koncentrace : test na homoskedasticitu (rovnost jejich směrodatných odchylek) : konstrukce regresní přímky :: normální regrese (homoskedasticita) :: vážená regrese (heteroskedasticita) : test na linearitu : výpočet mezí spolehlivosti (toleranční interval) 97 přednost lineární závislosti : stanovení mezí spolehlivosti, jednodušší výpočty mez detekce {limit of detection, ĹD, LOD) - souvisí s mezemi spolehlivosti : pro použitý měřící mechanizmus platí a-6-0.05 _ p - pravděpodobnost falešně negativního výsledku a - pravděpodobnost falešně pozitivního výsledku dolní mez stanovitelnosti {limit of quantification, LOQ) nejnižší výsledek měření, pro který může být udána nejistota stanovení; IUPAC: pro LOQ nejistota (variační koeficient) = 10 % analytická specifita, specifita {analytical specificity) schopnost měřícího postupu stanovovat pouze tu měřenou veličinu, která má být stanovena vyjádření- jako nespecifita, tj. jako efekt libovolné složky vzorku odlišné od analytu způsobující změnu indikace měřícího přístroje a tím zavádějící systematickou chybu interference systematická chyba měření způsobená analytickým interferentem analytický interferent - složka vzorku, která je současně složkou ovlivňující veličiny, která však sama není zdrojem signálu měřícího systému, ale která způsobuje přírůstek nebo pokles indikované hodnoty robustnost metody {robustness, ruggedness) schopnost metody skýtat přijatelné výsledky měření i v případě malých odchylek v měřícím postupu nebo ve složení vzorku srovnání s jinými metodami {comparison with other methods) např. rutinně laboratoří používaná metoda a její porovnání s metodou referenční (IFCC), či s metodou definitivní, pokud je k dispozici 99 rozmývání vzorku {carry-oveř) není znakem metody, ale jedná se o zjištění, zda nedochází k rozmývání po sobě jdoucích vzorku (vzájemné ovlivnění měření signálu nízkého vzorku po vysokém a naopak) problém nalévacích a průtokových kyvet provedení: 15 analýz, 5x s vodou (absorbance A1 až A5) 5x se vzorkem (absorbance A6 až A10) nakonec 5x s vodou (absorbance An až A15) A6 - A5 = Al0 - A5 = A10 - A^ A15-A5=0 nedochází k rozmývání rozmývání - numericky v % jako podíl rozmývání 100-(A,, - A,)(A,-AJ 100 kritéria výběru analytické metody I analýza v laboratorní medicíně : smysl pouze k vyhodnocení zdravotního stavu pacienta dva hlavní aspekty klinická užitečnost - jaká je požadovaná jakost z lékařského hlediska jakost analytického stanovení - nesprávnosti a neshodnosti, interference a specifita metody výběr metody podle analytických znaků dle současného stavu (state-of-the-art) volí se postupy podle právě žádoucích klinických potřeb při užití analytických metod 101 dle požadavků expertů či expertních skupin (panel expertš) : empirická zjištění expertů ve specializovaných lékařských odvětvích : kompromisy přihlížející spíše k současně dosaženému stavu než k reálným potřebám dle výsledků řízení jakosti : s rostoucí jakostí analytických metod klesají náklady a pracnost kontroly výběr podle požadavků kliniků zkušenosti lékaře konfrontované se současnou úrovní postupů není možné navrhnout univerzální požadavky na jakost postupů nevýhoda - mohou se lišit a není možné stanovit společná hodnotící kriteria výběr založený na biologické variabilitě nejpřiměřenější klinickým i analytickým požadavkům : intra- i interindividuální variabilita analytů je skoro konstantní (i ve stáří) : je možný geografický i časový přenos 102 výběr podle klinické významnosti ke změnám koncentrace nebo i složení některých analytů může dojít při jakékoli změně zdravotního stavu; pro praktické využití je účelné užívat jen některé indikace změny - potřeba definovat užitečnou indikaci změny testy s binárními výsledky výsledky testů: pozitivní/negativní (ano/ne) diagnostická významnost (kontingenční tabulka 2x2) : řádky - výsledky nalezené u skupiny nemocných a u skupiny ne-nemocných pacient pozitivní test negativní test suma nemocný správně (sp) falešně (fn) N-sp + N-fn ne-nemocný falešně (fp) správně (sn) N-fp + N-sn suma N-sp + N-fp N-f n + N-sn N-(sp + fn + fp + sn) 103 diskriminující hodnota 104 senzitivita (citlivost, DSE, diagnostic sensitivity) : pravděpodobnost, že u nemocného bude nalezen pozitivní výsledek testu DSE = N-sp (N-sp + N-fh) směrodatná odchylka s-5F (DSE-(1 DSE))N specif ita (DSP, diagnostic specificity) : pravděpodobnost, se kterou se u ne-nemocných získá negativní výsledek DSP = N-sn (N-sn + N-fp) směrodatná odchylka S.£P (DSP-11 DSP))N ne-senzitivita (necitlivost) : pravděpodobnost očekávání falešně negativního výsledku u nemocného : ne-senzitivita je doplňkový pojem k citlivosti (l + DSE) = NDSE=N-fn (N-sp + N-fh) ne-specifita : pravděpodobnost očekávání falešně pozitivního výsledku u zdravého (l + DSP)=NDSP = N-fp (N-sn + N-fp) predikce (předpověď) : pravděpodobnost nemoci, je-li test pozitivní (nebo test ne-nemoci negativní) : popsáno dvěma podmíněnými pravděpodobnostmi hodnota pozitivní predikce (PPV, positive predictive value) PPV -N-sp (N-sp N-fp) hodnota negativní predikce (NPV, negative predictive value) NPV N-sn (N-sn-i N-fn) T -.T I D 94 6 100 -iD 5 95 100 I 99 101 200 DSE = 94/100 =0.94 DSP = 95/100 = 0.95 N DSE = 6/100 = 0.06 NDSP = 5/100 = 0.05 PPV = 94/(94 + 5) = 0.95 NPV = 95/(95 + 6) = 0.94 i06 význam prevalence : pravděpodobnost nemoci v definované populaci v určitém okamžiku prevalence (PRE) - podíl nemocných z počtu testovaných 100 D -100 -,D : 200 testu - PRE = 0.5 citlivost dt specifítase nemění, mění-li se počet vyšetřovaných, mění se predikce vždy srovnávat jen souměřitelné testovací skupiny T iT I D 470 30 500 -iD 475 9025 9500 I 945 9055 10000 predikce infaktu D = 500, -.D = 9500 PRE = 0.05 populace X kardiaci DSE = 470/500 = 0.94 DSP = 9025/9500 = 0.95 PPV = 470/945 = 0.497 NPV = 9025/9055 = 0.997 107 incidence : výskytu nemoci za určitý časový interval (např. rok) např. cukrovka : prevalence v USA - 2.00 %, tj. cca 4 miliony občanů nemocných diabetem : incidence v USA - 1.99 %, tj. každý rok nových 398 000 případů vydatnost (EFF, efficiency) • poměr počtu všech správných výsledků k jejich celkovému počtu EFF-MN-sp • N-sn) (N-sp N-sn N-fp.N-fn) věrohodnost a poměr věrohodností věrohodnost {likelihood) : pravděpodobnost je mírou pro nastoupení jevu při dané hypotéze : věrohodnostje mírou pro nastoupení jevu při různých hypotézách 108 poměr věrohodností (LQ, likelihood quotient, likelihood ratio) LQ --DSE (1 - DSP) = LQ-W. vztah mezi pravděpodobnostmi (P) a nadějemi (W) Wa = P / (1 - P) = 0.05 / (1 - 0.05) = 0.0526 LQ = DSE / (1 - DSP) = 0.94 / (1 - 0.95) = 18.8 Wp = LQ ■ Wa = 0.0526 ■ 18.8 = 0.98888 Wp / (1+Wp) = 0.98888 / (1 + 0.98888) = 0.497 109 definitivní metody klasifikace analytických metod založené na izotopovém zřeďování (ID) a hmotnostní spektrometrii (ID-MS), popř. na kombinaci ID s plynovou chromatografíí (ID-GC) : nejsou většinou aplikovatelné do denní praxe - složité a pracné : slouží hlavně při atestaci kalibrátorů a kontrolních přípravků referenční metody základní, důkladně prostudovaný a definovaný měřící postup, jehož analytické znaky (nepřesnost a strannost) dovolují jeho užití k posuzování správnosti jiných měřících postupů a k charakterizaci referenčních materiálů doporučené metody (dle IFCC) s popsanými logickými sledy operací, které jsou součástí postupu měření tak, jak byly definovány a doporučeny příslušnou pracovní skupinou rutinní metody metody, které nepatří do některé z výše uvedených skupin : musí být komutabilní s metodou referenční komutabilní metoda - poskytuje na reprezentativním souboru nativních sér stejné výsledky jako metoda referenční 110 optimalizace analytické metody optimální podmínky analýzy : složení reakční směsi (druh, koncentrace složek, pH a teplota reakční směsi apod.) : jednotlivé kroky a pořadí přidávání činidel hledání optimálních reakčních podmínek - zkoumání většího počtu parametrů, zjišťuje se jejich vliv existuje většinou jen jedna určitá optimální kombinace metoda postupného měnění parametrů {single variahle approach, SVA) : relaxační metoda zkoumá odděleně reakční parametry; vyžaduje větší počet nezávislých měření; zkoumá odděleně i ty, které spolu mnohdy těsně souvisí (může vést k nesprávnému závěru) multivariační metody {multivariable approach, MVA) zkoumá parametry komplexně; mění se současně několik parametrů; metodicky správnější : vyžaduje plán pokusů {experimental design, ED) plány pokusů způsob rozvržení experimentů tak, aby z co nejmenšího počtu bodů byla získána maximální informace a tedy co nejlepší popis průběhu funkce o více proměnných faktorový plán obsahuje všechny možné kombinace vybraných faktorů parametry: počet faktorů a počet úrovní každého faktoru : počet faktorů (f) odpovídá počtu vstupních proměnných (počtu složek) : počet úrovni\L) je počet hodnot každé vstupní proměnné {např. počet měřených koncentrací) počet bodů faktorového plánu (celkový počet experimentů ri) fM c c >0I E p n O-©-o 0-.ij- -0- proměnná 1 tříhladinový dvoufaktorový plán {Ĺ = 3); 32 experimentů 112 aproximativní metody a algoritmy optimalizace - snaha „odhalit" numericky funkci závislosti výstupu na optimalizovaných parametrech - aproximace black box : algoritmy nepopisují fyzikálně chemické vlastnosti, ale „jen" numericky zaznamenávají vztahy mezi proměnnými parciální metodou nejmenších čtverců {partial least squares, PLS) : MVA, hodnoty pro všechny komponenty analyzované směsi počítány současně kanonická korelace {canonical correlation, CC) umělé nervové (neuronové) sítě {artificial neural networks, ANN) : nápodoba biologického systému vzájemně propojených neuronů 113 analytické soubory funkční soubory jednotlivých analytických metod klinicko-biochemické požadavky lékařů : jaterní soubor, soubor pro tukový metabolizmus, soubor pro poruchy glukózové tolerance aj.) jiné dôvody- organizační, bezpečnostní, ekonomické akutní (staťimová) analýza stanovení jednoho nebo skupiny hlavních anaiytů co nejdříve a nonstop glukóza (diabetes), kreatinin nebo močovina (ledviny), bilirubin a aminotransferáza ALT (jaterní testy), kreatinkináza a troponin (srdce), a-amyláza či lipáza (slinivka), acidobazická rovnováha krve, základní toxikologické vyšetření a základní vyšetření moči základní biochemické vyšetření základní sledovací (screening) vyšetření anaiytů charakterizujících činnost hlavních tělesných orgánů a funkcí celkovou bílkovinu, bilirubin, kreatinin, močovinu, glukózu, cholesterol, kyselinu močovou, ALP, aminotransferázy ALT a AST, popř. GMT nebo CK 114 základní hematoloaické vyšetření stanovení krevního obrazu hemoglobin, erytrocyty, hematokrit, leukocyty, trombocyty, retikulocyty, osmotickou rezistenci erytrocytu, bazofilní tečkování erytrocytu apod. organizační dělení analýz do souborů imunochemická vyšetření imunoelektroforéza sérové bílkoviny, a 1-fetoprotein, imunoglobuliny A, G, M, prealbumin, al-antitrypsin, a2-makroglobulin, transferin, ceruloplasmin, CRP, prostatický specifický antigen aj radioimunoanalvtická vyšetření thyroxin, trijodtyronin, thyreotropin, luteinizační hormon, folikuly stimulujícího hormonu, prolaktin, choriogonadotropin, estradiol, progesteron aj. vyšetření mozkomíšního moku chemické stanovení anaiytů + různé speciální testy 115 základní vyšetření moči pH, dusitany, bílkovina, glukóza, bilirubin, urobilinogen, ketolátky, osmolalita, erytrocyty a hemoglobin, leukocyty, vyšetření močového sedimentu doplňkové analýzy morfologická analýza močového sedimentu (epitelie, válce granulované, voskové, epitelové, erytrocytární, leukocytové, žlučové, pseudoválce, spermie a mikroby (kvasinky, bakterie, trichomonady, plísně) speciální analytické soubory analýzy na místě (POCT, point-of-care testing) alternativní názvy : analýzy mimo laboratoř {off-site testing) : analýzy u pacienta (NPT, near patient testing) sebekontrola pacientů (self-monitoring, home diagnostics) analýzy krve a moče s cílem kontroly aktuálního zdravotního stavu : dávkování léčiv (diabetici, kardiaci), signál k návštěvě lékaře 116 analvza u lůžka (bed-side monitoring) analýzy přímo u lůžka pacienta (mikroanalyzátory) personálem kliniky :: sledování tzv. vnitřního prostředí pacienta: pH krve, p02, pC02, ionty sodíku, draslíku, chloridy a hemoglobin nebo hematokrit sledování léčiv (druo monitoring) kontrola hladiny těch léčiv, která Jsou ve větších dávkách toxická a hrozí jejich predávkovaní, nebo protože mají lidé na některá léčiva individuální toleranci speciální analyzátory nejčastěji monitorovanými léčivy - digoxin, fenytoin, fenobarbital, kyselina valproová, diazepam, theofylin, gentamicin, tobramicin, methotrexat, cyklosporin a dal. drogy {drugs of abuse) : semikvantitativní imunoanalýza (diagnostické proužky) : kvantitativní instrumentální metody (HPLC, GC, MS, CZE apod.) alkohol, amfetamin, barbiturany, benzodiazepiny, cannabinoidy, kokain, methadon, opiáty, antidepresiva, anabolické steroidy aj 117 obsah analytu ve vzorku analytické výsledky způsob jejich vyjadřování hodnota analytického výsledku c(glukóza) = 4.7 ± 0.1 mmol/l : přímá diagnostická hodnota : počet platných číslic; první platná X±SV n x + Kn-R hodnota diagnostického indexu a sv x -----> sa i i s 'A "J TbJ de Ritisův index - poměr katalytických koncentrací AST a ALT : porucha jater; < 0.7 dobrá prognóza, > 1 špatná prognóza : poměr hodnoť analytického výsledku; zákon šíření chyb! hodnota diagnostického testu GFR = V, test na účinnost glomerulární filtrace {glomerular filtration rate) : současné stanovení kreatininu v séru a sbírané (24 h) moči :: výpočet kreatininové klírens; korekce na povrch těla 118 interpretace výsledku analýzy analyt - součást vzorku, kterou stanovujeme {kreatinin v séru a v moči) : stanovení s určitou přesností v závislosti na obsahu, stabilitě, metodě apod. analytická metoda/postup - metoda stanovení analytu {Jaffého reakce s kyselinou pikrovou v alkalickém prostředí) výsledek analýzy - hodnota ve vztahu k diagnóze {kreatininové klírens) test na určitou funkci - testovaný stav ve vztahu k diagnóze {glomerulární filtrace) index - diagnostické poměry obsahu analytů srovnání hodnoty výsledku analýzy s diagnostickými hodnotami (referenční interval) 119 variabilita výsledku analýzy (AV) analytická nepřesnost, analytická variabilita, variabilita analytického procesu suma všech analytických chyb : preanalytická /aze (odběry, transport, uskladnění) + analytická fáze (dávkování, kalibrace, instrumentální chyba, náhodné chyby) výsledná přesnost, resp. nepřesnost - ve shodě s účelem analýzy model analytického měření souhrn všech vztahů mezi vstupními a výstupními veličinami měření : vstupní veličiny :: hodnoty veličin ve vzorku :: veličiny ovlivňující měření - podmínky :: hodnoty konstant 120 zdroje chyb (nejistot) měření : nezahrnutí všech ovlivňujících podmínek : instrumentální vlivy : vlivy lidského faktoru : hodnoty veličin získané externě přehled možných chyb analytického měřícího postupu : náhodné (nahodilé) chyby :: pravděpodobnost náhodné chyby má tzv. normální rozdělení : systematické (soustavné) chyby :: chyby měřících metod ::: citlivost, dynamický rozsah, selektivita :: chyby měřících prostředků ::: nehomogenity měřících podmínek :::: fyzikální - tepelná konvekce :::: konstrukce - umístění čidla :: chyby obsluhy ::: únava ::: morálně-volní vlastnosti - podvody, lenost... 121 parametry vyhodnocení nejistot analytického měřícího postupu : normované pokyny - ČSN P ENV 13005 (014109) :: pokyn pro vyjádření nejistoty měření : nejpravděpodobnějši hodnota výsledku :: aritmetický průměr (při normálním rozdělení hodnot) :: medián pro n < 3 : střední chyba jednoho měření :: výběrová směrodatná odchylka (s) :: výběrový rozptyl - střední kvadratická chyba (s2) : střední chyba aritmetického průměru (s, uA) : nejistota výsledku měření - limit spolehlivosti :: interval, ve kterém se nacházíš deklarovanou mírou pravděpodobnosti skutečný výsledek měření :: specifikuje charakter měřící metody :: vymezuje hranice, v nichž je výsledek s danou (určitou) pravděpodobností považován za správný, tj. přesný a pravdivý 122 dílčí nejistoty analytického postupu v laboratorní medicíně nejistota typu A : náhodné vlivy; příčiny přímo neznámy : statistickou analýzou z vlastních měření :: výtěžnost, systematická odchylka . x... - x . Xref : systematická odchylka (b) x :: někdy bias nebo vychýlení _ r = - :: rozdíl mezi průměrem měření (XeXp) - v sérii, n = 10 xief a referenční (správnou) hodnotou (xref) :: někdy se spíše používá hodnota výtěžnosti (r) 1 n 11=1 : dlouhodobá přesnost (intermediate precision) x'rel n :: jinak též reprodukovatelnost -sledování přesnosti metody, regulační diagramy s ::: minimum 15 záznamů ročně sx,rei = ::: geometrický průměr :: jako relativní směrodatná odchylka metody (sxre|, ure|repro) nebo směrodatná odchylka průměru 123 nejistota typu B : známé vlivy; odhadnutelné příčiny : nelze zjistit statistickým vyhodnocením vlastních dat :; převzatá (certifikát, odborná literatura, dokumentace) krajní chyba - ±z (Az) koeficient chybového rozdělení (0) 0 = 3 (normální) 0 = V3 (rovnoměrné) 0 = V6 (trojúhelníkové) Az 0 : je dána geometrickým součtem jednotlivých nejistot (uBE - nejistota reference/etalonu, uBM - n. měřidla, uBT - n. vlivem teploty) relativní nejistota referenčního materiálu (ure|řref) _uref X tef 124 celková nejistota měření (utot) (TMU, total measurement uncertainty, TEA, total allowable analytical error) : kombinovaná nejistota (uk) ur u^ Ur (standardní) kombinovaná nejistota (ureltot) Urel,tot ~ . L'rcl.rep +Urelref + "lei +Urel,x rozšířená kombinovaná nejistota (uext.tot) : koeficient rozšíření (k) :: k = 1 (P = 68%) :: k = 2(P = 95%) :: k = 2.58 (P = 99 %) ^exttot = ^ ' ^lel.tot 125 biologická variabilita (BV) obsahu analytu přirozená biologická proměnlivost (roztyl) obsahu bioanalytu : intraindividuální - u jednoho jedince :: biologické faktory a jejich časový vliv : interindividuální - mezi jedinci :: rozptyl průměrných hodnot individuí určité populace vlivy : stálé - rasa, pohlaví, věk, biorytmy : proměnné - hmotnost, dieta, léky BV se vyjadřuje relativní směrodatnou odchylkou sxre| (RSD, relative standard deviatiorí) : starší název je variační koeficient (OJ, coefficient of variatiorí) x - koncentrace analytu A, sx - směrodatná odchylka stanovení x, x - průměrná hodnota x intraindividuální variabilita (sx; CVX) : ukazuje na maximální nepřesnost stanovení : analytická metoda musí mít přesnost rovnu 1/3 sr interindividuální variabilita (sG, CVG) : ukazuje na maximální systematickou odchylku (vychýlení, bias) stanovení :: systematická odchylka (b; BA; správnost) ::: rozdíl mezi hodnotou očekávanou a naměřenou celková biologická variabilita (stot; CVC) : průměrná hodnota všech anal. výsledků po vyloučení výsledků odlehlých : průměrná hodnota stanovená primární či referenční hodnotou : pragmaticky nahrazuje biologicky relevantní údaj o obsahu (BV) :: aproximace skutečné hodnoty 126 cílová hodnota (TV) obsahu analytu {target value, TV) 127 referenční interval (RI) obsahu analytu referenční rozmezí, mez, hranice (1929) dříve i tzv. normální či fyziologické hodnoty získávání: analýzou vzorků osob, které se hodnotí jako zdravé RI (fyziologický interval) - hodnoty laboratorního testu, mezi nimiž leží většina hodnot získaná měřením referenční populace (mezi 2.5% a 97.5% kvantilem souboru zdravých jedinců) : soubor dostatečně početný a homogenní :: vyloučit faktory nehomogenity ::: nemocní, léčení ::: věk, konstituce, dieta, genetické aspekty 40 - « o 5 >8 " 10 - zeny muzi 1 r ■■H ni- 03 0,2 0.8 1.4 0.2 0.8 aktivita ALP 1.4 referenční hodnoty referenčního jedince - donora referenční skupiny referenční populace 128 souvislost mezi analytickým nálezem a stavem pacienta zdravý (normální) nebo má analyt vybočující (patologické) hodnoty : analytický výsledek je zatížen chybami, které vyjadřujeme nejistotami : referenční interval je zatížen BV, respektive TV požadovaná výsledná přesnost (sA; CVA allowable coefficient of variation) : minimální požadovaná přesnost SA ™ U.O * S| celková chyba (TE, total error) : rozdíl mezi výsledkem a cílovou hodnotou : diagnostické kritérium kvality analytické metody :: TE > utot => nesprávná klinická interpretace TE-z-s. b z = 1-4; z = 1.65 nebo 1.96 129 nejdulezitejsi parametry : celková biologická variabilita (stot) : intraindividuální variabilita (s^ akceptovatelná kvalita stanovení minimální kvalita stanovení u • 1.65 ' :0.25-sTi. utot < 1.65- J + 0.375-s optimální kvalita stanovení utot < 1.65 •"' + 0.125 -sf tot TOt akceptovatelné vychýlení b 0.375 -s. 'tot ideálni vychýleni b<0.125-s. tot 130 příklad k vyhodnocování výsledku stanovení obsahu glukózy : dlouhodobá přesnost :: dvě kontroly v roce ::: x = 5.4 mmol/l, sXre, = 2.3 % ::: x = 13.4 mmol/l, s'Xre| = 1.7 % 22+2< 2% : kombinovaná nejistota reference (CRM) :: certifikovaný obsah glukózy xref = 8.75 mmol/l :: uref = 0.6 % u^ = 08756--r0-0007 = 0-07 % 131 systematická odchylka o 70 r -100 100.5 % :: xexp = 8.79 mmol/l, n = 10 875 :: xref = 8.75 mmol/l výtěžnost b 100.5-100.0 0.5 % výchylka střední chyba aritmetického průměru :: si- 01„ mmol/l . 0 1 . 003 mo|/| :: n = 10 a ,-jq relativní střední chyba aritmetického průměru s.,, S' -100 °03-100 = 0.3 % re x 8.79 kombinovaná nejistota uk- 2.02 4-0.32 -i 0.52 +0.32 =2.1 % rozšířená kombinovaná nejistota u,.tI! 2.1-2 4.2% biologická variabilita obsahu glukózy : % = 6.5 %, sG = 7.7 % => stot = 10.1 % podmínka optimální kvality stanovení splněna uui^1.65-^ ,0.125-s,. 2.1 %< 6.2% => podmínka ideální vychýlení splněna b<0.125-stnt 0.5%<1.3% správné čtení výsledků a jejich interpretace RI (glukóza) = 3.3 - 5.6 mmol/l stot = 10.1 %, sT = 6.5 %, sx = 2 % 1. výsledek analýzy glukózy :: dnes 4.3 ± 0.1 mmol/l 2. výsledek analýzy glukózy :: na příští kontrole 3. výsledek analýzy glukózy :: na poslední kontrole indikuje stagnaci 4.7 ± 0.1 mmol/l 3.8 ± 0.1 mmol/l 134 normy a pokyny k vyhodnocování výsledků : ČSN 01 0115 :: Mezinárodní slovník základních a všeobecných termínů v metrologii : ČSN EN ISO 9001 :: Systém jakosti : Model zabezpečení jakosti při návrhu, vývoji, výrobě, instalaci a servisu : ČSN EN ISO 10012-1 :: Metrologický konfirmační systém pro měřící zařízení : ČSN EN ISO 10012-2 :: Směrnice pro řízení procesů měření : EAL-R2 :: Vyjadřování nejistot při kalibracích : EAL-R2-S1 :: Vyjadřování nejistot při kalibracích - Příklady : TPM 0051-93 :: Stanovenie neistôt pri meraniach, 1. a 2. diel 135 jednotky původně: hmotnost, popř. aktivita na objem (v biologické tekutině) g a mg/dl, jinak též gramprocenta (g%) a miligramprocenta (mg%) 1977: soustava SI hmotnost (g, mg) => látkové množství (mol) koncentrace - mol/l (analyt s přesně definovanou molekulovou hmotností) enzymy: koncentrace katalytické aktivity místo koncentrace enzymu katalytická aktivita 1 katal - množství enzymu, které rozloží 1 mol enzymového substrátu za 1 s za definovaných reakčních podmínek koncentrace katalytické aktivity- katalytická aktivita vztažená na objem obsah katalytické aktivity- katalytická aktivita vztažená na hmotnost mezinárodní jednotka U (international unit, IU) - množství enzymu, které rozloží za 1 min 1 umol enzymového substrátu za daných podmínek 1 U = 1 umol/min = 16.67 nmol/s = 16.67 nkat 136 hmotnostní koncentrace enzymů/proteinů {mass concentration) : stanovení v imunodiagnostice a u enzymu CK :: koncentraci vyjadřujeme jako mg či ug proteinu/l počet elementů v biologických tekutinách (buněk, částic, různých útvarů) :: početní koncentrace, tj. počet částic v litru močový sediment - arbitrárni početní koncentrace (arbitrárni jednotka) : zjednodušení při vyjadřování počtu částic (elementů) na definovaný (dohodnutý) objem po odstředění vzorku moče se zjistí počty jednotlivých elementů v zorném poli mikroskopu v odečítací komůrce s definovaným objemem (Btirkerova komůrka) jiné užití: analýzy některých testů v moči (např. průkaz bílkoviny), v mozkomíšním moku, ve stolici (obsah železa) apod. IFCC a IUPAC: systém zkratek pro vyjadřování analytického nálezu pro tyto typy vzorků nad rámec SI 137