Mezibuněčná komunikace a interakce buněk imunitního systému Lukáš Kubala kubalal@ibp.cz I. díl Základy buněčné signalizace Povrchové receptory Cytokiny Lipidové mediátory zánětu II. díl Buňky komunikují s okolím prostřednictvím receptorů na membráně, které rozpoznávají extracelulárně přítomné molekuly – ligandy. Ligandy mohou být: • rozpustné (např. cytokiny) • nerozpustné (např. struktury na površích jiných buněk nebo mezibuněčné hmoty) Další způsoby – např. signální molekuly přecházející přes cytoplasmatickou membránu mají receptory v cytosolu/jádře. Mezibuněčná komunikace a interakce buněk – buněčná signalizace http://reasonandscience.heavenforum.org/t2181-cell- communication-and-signaling-evidence-of-design Buněčná signalizace přes membránově vázaný receptor - obecně + druzí poslové - malé molekuly produkované enzymatickými reakcemi nebo uvolňovány iontovými kanály Typy reversibilních změn zajištujících přenos signálu 1. Změna proteinové konformace 2. Fosforylace / defosforylace proteinů 3. Záměna GDP za GTP Základní mechanismy intracelulárního přenosu signálu u buněk imunitního systému 1. Receptory spřažené s enzymy nebo přímo s enzymovou funkcí (Proteinové kinázy jako součást receptorů nebo jako asociované s receptory) 2. Receptory spřažené s G-proteiny 3. Receptory typu iontových kanálů Základní typy přenosu signálu u buněk imunitního systému Protein kinázy Protein kinázy (PK) jsou aktivovány vazbou ligandu na receptor. Následně pak aktivují další intracelulární signální dráhy. Vztah mezi receptory a PK: A) v cytoplasmatické části receptoru je přímo doména s PK aktivitou B) intracelulární domény receptoru jsou asociovány s cytoplasmatickými PK PK a význam fosforylace v přenosu signálů Fosforylace – navázání fosfátové skupiny díky aktivitě specifických PK; může být jak aktivační, tak inhibiční Defosforylace – odštěpení fosfátové skupiny pomocí specifických fosfatáz; může být jak aktivační, tak inhibiční fosforylovaný protein protein protein kináza ATP ADP OH serinový, threoninový nebo tyrosinový boční řetězec PO protein fosfatáza P G-proteiny Video Vápníkové ionty v signálních kaskádách Důležitým principem v buněčném signálování je změna intracelulární koncentrace Ca2+. Působením druhých poslů, hlavně inositoltrifosfátu (IP3), dochází k otevírání iontových kanálů a zvýšení koncentrace Ca2+. Ca2+ se váží na protein kalmodulin. Vazbou Ca2+ dochází ke změně konformace kalmodulinu a vytvoření aktivního místa (centra) pro vazbu substrátu. Celý komplex kalmodulin/Ca2+ se váže na regulační proteiny (např. fosfatáza calcineurin) a mění jejich aktivitu. 2. Změna konformace Vazba dalšího proteinu Kalmodulin Aktivace proteinu 1. Vazba iontů Ca2+ Přenos signálu přes membránu zprostředkovaný vápníkovými ionty Fosfolipáza C gamma (PLC-γ) štěpí fosfatidylinositol bisfosfát (PIP2) na diacylglycerol (DAG) a IP3. IP3 otevírá vápníkové kanály uvolňující Ca2+ z endoplasmatického retikula a extracelulárního prostoru. Ca2+ aktivuje kalmodulin. DAG aktivuje PKC. Figure 6-5 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Video Vybrané typy povrchových receptorů buněk imunitního systému podle funkce 1. Imunoreceptory – receptory lymfocytů, NK buněk a žírných buněk 2. Receptory prezentující antigen (MHC receptory) 3. Fas receptory 4. Receptory rozpoznávající struktury charakteristické pro patogeny a poškozené buňky (PRR, „Pattern Recognition Receptors“) 5. Adheziny – adherence a migrace buněk • Integriny • Selektiny • Adheziny patřící do velké rodiny imunoglobulinů • Cadheriny • Mucinové receptory Další přednáška Imunoreceptory Struktura a funkce: • multiproteinové komplexy klonálně variabilních řetězců vážících antigen (TCR a BCR) nebo protilátku (FcR) a invariantních přídavných řetězců zajišťujících signální funkce TCR (T lymfocyty) BCR (B lymfocyty) FcγRIII (NK buňky)FcεRI (žírné buňky) γε δε ζζ Igα/Igβ γγγγ β α α α β IgM ITAM („Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif“) – funkčně důležité tyrosiny Průběh signalizace u imunoreceptorů s PK asociovanými s receptory vazba ligandu na imunoreceptor (TCR, BCR, FcR) defosforylace signální molekuly protein fosfatázami => návrat do původního stavu změna transkripce genů, stavby cytoskeletu, sekrece látek atd. fosforylace ITAM a následná aktivace dalších signálních drah v buňce zvýšení aktivity asociovaných PK (u antigenních receptorů se jedná o rodinu tyrosinových kináz Src) migrace receptorů do lipidových raftů a jejich agregace Membránové lipidové rafty Lipidové rafty jsou nezbytné pro signálování TCR, BCR a FcR. Jde o specializované regiony buněčných membrán bohaté na nasycené lipidy a cholesterol. Hojně se zde výskytují proteiny vázající glykosylfosfatidylinositol (GPI) a PK (např. Src-rodiny). Lipidové rafty velmi dynamicky mění strukturu a obsah proteinů. Některé typy receptorů po navázání ligandu migrují do těchto lipidových raftů a agregují zde. Figure 6-3 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Figure 6-3 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) TCR receptor Figure 6-9 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Přenos signálu přes TCR receptor Lck a Fyn jsou tyrosin kinázy ze Src rodiny. ZAP- 70 je tyrosin kináza ze Syk rodiny. Navázání recept. na antigen prezentovaný MHC vede k vazbě koreceptoru (molekula CD4) na MHC a indukci fosforylace ITAM kinázami Lck a Fyn. Kináza ZAP-70 se váže na fosforylovaný ITAM a je následně sama fosforylována a aktivována. Figure 6-12 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Video CD3 CD3 Figure 6-16 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Komplexní přehled přenosu signálu z TCR Přenos signálu přes BCR receptor Membránově vázaná IgM (mIg) ITAMs Figure 6-8 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Antigenem indukované shlukování IgM receptorů umožňuje kinázám asociovaným s těmito receptory (Src kinázy) fosforylovat ITAM. Syk kináza se váže na fosforylovaný ITAM a je tím aktivována. Figure 6-14 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Figure 6-14 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Figure 6-15 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Komplexní přehled přenosu signálu z BCR Fas receptor Nepotřebné lymfocyty jsou odstraňovány apoptózou, která je indukována navázáním Fas ligandu (člen rodiny TNF cytokinů) na receptor Fas (rodina TNF receptorů) na povrchu lymfocytů. Fas ligand (FasL) se váže na Fas. Dochází ke konformační změně Fas, který následně váže domény adaptorových proteinů. Adaptorové proteiny aktivují kaspázu 8, která následně aktivuje kaspázu 3. Kaspáza 3 štěpí další regulační proteiny, což vede k indukci apoptózy. Figure 6-24 Immunobiology, 6/e. (© Garland science 2005) Video PRR („Pattern Recognition Receptors“) = receptory rozpoznávající struktury charakteristické pro patogeny a poškozené buňky Struktury které rozpoznávají: 1. Konzervované molekulární vzory asociované s patogeny (PAMPs „Pathogen-associated molecular patterns“) 2. Konzervované molekulární vzory asociované s poškozenými hostitelskými (vlastními) buňkami (DAMPs „Damage-associated molecular patterns“) Struktury, které rozpoznávají receptory rozpoznávající struktury charakteristické pro patogeny a poškozené buňky (PRR) 1. Konzervované molekulární vzory asociované s patogeny (PAMPs „Pathogen-associated molecular patterns“) • Typické molekuly: > bakteriální sacharidy – lipopolysacharidy (LPS), lipoteichoová kyselina, manóza > bakteriální proteiny a peptidy – flagelin, N-formylmethionine > glukany hub, chitin > nukleové kyseliny – bakteriální DNA (nemethylované CpG dinukleotidy), virová dvouvláknová RNA (dsRNA) 2. Konzervované molekulární vzory asociované s s poškozenými hostitelskými (vlastními) buňkami (DAMPs „Damage-associated molecular patterns“) • Typické molekuly: > intracelulární proteiny – proteiny tepelného šoku („Heat Shock Proteins“, HSP) > komponenty extracelulární matrix – fragmenty hyaluronanu > kyselina močová, ATP, DNA Charakteristika PRR Dělení PRR A. Podle umístění → membránově vázané a cytoplazmatické B. Podle specifity ligandu PRR membránově vázané (jak na povrchu buňky, tak v endosomech) > Toll-like receptory (TLR) > C-lektinové receptory (CLR) PRR cytoplazmatické > NOD-like receptory (NLR) > RIG-I-like receptory (RLR) Toll-like receptory (TLR) • Poprvé objeveny u drosofil (produkty genu Toll regulují ontogenetický vývoj a obranu). • Podobné struktury identifikovány u vyšších rostlin, u bezobratlých a u obratlovců včetně člověka – u člověka popsáno 10 funkčních členů TLR rodiny. • Typická struktura složená z domén bohatých na leucin => specifický tvar podkovy. • Aktivace TLR: převážně tvorba dimerů - spouští specifické signální dráhy Fig. 3.11 Immunobiology, 9/e. (© Garland science 2017) Přehled TLR a jejich ligandů Fig. 3.10 Immunobiology, 9/e. (© Garland science 2017) Vereščáková H., Ph.D. Thesis, Masaryk University, Brno, 2016. TLR signalizace Příklad: Stimulace buněk pomocí LPS/TLR4 signální dráhy • Rozpoznání LPS vyžaduje interakci i dalších proteinů – LBP, CD14 aj. • Aktivace TLR4 vede k asociaci intracelulárních domén s různými adaptorovými molekulami • Intracelulární signalizace závislá na adaptorové molekule MyD88 vede především k aktivaci MAP-kinázové dráhy a transkripčního faktoru NF-κB => indukce sekrece prozánětlivých cytokinů a kostimulačních molekul. • Signalizace závislá na adaptorové molekule TRIF vede zejména k indukci interferonu α a β. C-lektinové receptory (CLR) Velká skupina receptorů s jednou a více C-lektinovými doménami Jak membránově vázané, tak solubilní. Rozpoznávají: > různé cizorodé struktury – např. manózu, fukózu a glukany > nově přítomné „nevlastní“ povrchové antigeny poškozených či pozměněných buněk – např. onkofetální antigen Velké množství skupin CLR, např: > manózový receptor (MR) – na povrchu makrofágů nebo dendritických buněk; rozpoznání a navázání opakujících se manózových jednotek na povrchu mikrobů > MBL („Mannose Binding Lectin“) – solubilní; klíčový v aktivaci komplementu > dectin 1 a dectin 2 – na povrchu dendritických buněk; rozpoznání beta glukanů kvasinek a plísní > galaktózový receptor – rozpoznání galaktózových zbytků na senescentních erytrocytech NOD-like receptory (NLR) („Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors“) - Intracelulární sensory bakteriální infekce a poškození buněk. - lokalizovány v cytosolu Rozpoznávají fragmenty peptidoglykanů z buněčné stěny bakterií: > NOD1 rozpoznává γ-glutamyl diaminopimelovou kyselinu – produkt rozpadu peptidoglykanů G- bakterií (Salmonella) nebo G+ bakterií (Listeria). > NOD2 rozpoznává muramyl dipeptid – součást peptidoglykanů většiny bakterií. Signálování: • V neaktivním stavu se NOD proteiny vyskytují v cytosolu v podobě monomerů. • Po rozpoznání ligandu dochází k jejich konformační změně a oligomerizaci. • Typická je aktivace dráhy NF-κB => indukce zánětlivé odpovědi RIG-I-like receptory (RLR) RLR jsou RNA helikázy rozpoznávající cytoplasmatickou virovou RNA, jednovláknovou (ssRNA) i dvouvláknovou (dsRNA). Zástupce: • RIG-I – exprimován v mnoha různých tkáních a buněčných typech, kde rozpoznává intracelulární RNA viry – rozlišuje virovou a hostitelskou RNA na základě odlišností 5´konců RNA transkriptů Signálování RIG-I: • V neaktivní (auto-inhibiční) konformaci se RIG-I vyskytuje v cytoplasmě. • Po vazbě virové RNA dochází ke konformační změně, aktivaci dráhy NF-κB a spuštění antivirového programu buňky => produkce pro-zánětlivých cytokinů a interferonů typu I. RLR často interagují s TLR při regulaci adaptivní imunitní odpovědi. Video Další PRR FMLP receptor 1 („N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine receptor 1“) • Exprimován především na fagocytech. • Rozpoznává fMLP uvolňovaný z invadujicích mikroorganismů a poraněných tkání. • Stimuluje leukocyty k destrukci patogenu nebo odstranění zbytků zničených tkání. Scavengerové receptory • Přítomny na membránách makrofágů. • Rozeznávají zejména modifikované lipoproteiny. • Role v iniciaci procesu fagocytózy nejen patogenů, ale také apoptotických buněk. Různé plazmatické proteiny • Zahrnují skupinu pentraxinů (do ní patří např. C-reaktivní protein) nebo také receptory bohaté na leucin (např. CD14 vážící LPS).