1. Izolace a purifikace nukleových kyselin
Klíčový krok pro další práci s DNA a RNA
Metody molekulární biologie pro farmaceuty
Doc. RNDr. Jan Hošek, Ph.D.
hosek@mail.muni.cz
Ústav molekulární farmacie
FaF MU
Užitečné odkazy
o BioTechniques
• The International journal of Life Science Methods
• http://www.biotechniques.com/
o Reseach Gate
• http://www.researchgate.net/
o BitesizeBio
• Brainfood for biolologists
• http://bitesizebio.com/
o Journal of Visualized Experiments (JoVE)
• http://www.jove.com/
2
3
Cíl izolace a purifikace NA
Získat NA v nativním stavu z přirozeného materiálu v
dostatečném množství a čistotě pro další analýzy
Obecný postup izolace NA
Lyze buněk
a tkání
Extrakce NA
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
?
Lyze buněk a tkání - uvolnění vnitřního obsahu buněk
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
 Biologická lyze
především využití degradačních enzymů
(lysozym, proteináza K, celuláza…)
 Chemická lyze
využití detergentů (např. laurylsíran
sodný), chelatačních činidel (např.
EDTA), guanidiových solí
 Fyzikální lyze
použití varu, mražení, sonikace, drcení
Většinou kombinace více přístupů
Homogenizace
mletím
Proteináza K
Lysozym
Detergenty
Homogenizace
drcením
Celuláza
Detergenty
Mražení
tekutým
dusíkem
Lyze varem
Sonikace
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Lyze buněk a tkání - uvolnění vnitřního obsahu buněk
Stav materiálu po lyzi buněk
Komplexní směs
DNA, RNA, lipidů, proteinů,
sacharidů, uhlovodíků
a dalších nízkomolekulárních látek
Další postup:
oddělit DNA, případně RNA
od ostatních složek směsi
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
9
Extrakce
Extrakce je čistící a dělící operace, při které
přechází složka ze směsi látek v kapalné či tuhé
fázi do jiné kapalné fáze - rozpouštědla.
Extrakce je velmi výhodná pro izolaci tepelně
nestálých látek, protože se může provádět i za
laboratorní teploty nebo za chladu.
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Extrakce směsí fenol - chloroform
denaturaci proteinů
na rozhraní
Separace proteinů a NA založená na
lehké vodné
těžší organické fáze
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Obecný postup extrakce fenolem
1) Rozrušení buněčných stěn
3) Oddělení fází centrifugací – vrstva organická (fenol), mezifáze (proteiny a zbytky
buněk), vodná (NA)
2) Denaturace proteinů a tuků – fenol, chloroform
https://blog.addgene.org/rna-extraction-without-a-kit
DNA/RNA
proteiny
Lipidy +
lipofilní látky
Princip fenolové extrakce
http://bitesizebio.com/
Modifikace fenolové extrakce
Fenol ekvilibrovaný neutrálním, nebo
alkalickým pufrem
DNA a RNA
proteiny
fenol
Použití kyselého fenolu
RNA
DNA
Fenol a
proteiny
https://www.genetargetsolutions.com.au/product/5prime-phase-lock-gel/
http://openwetware.org/
P. Zumbo, WEILL CORNELL MEDICAL COLLEGE
Účinek kyselého
fenolu
Stav materiálu po extrakci
Silně zředěná DNA, RNA
Stopy fenolu
Stopy chloroformu
Další postup:
Zakoncentrování a purifikace NA
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Purifikace NA precipitací
Srážení, jedna ze základních metod
izolace a koncentrace biologických
makromolekul. Do roztoku,
obsahujícího požadovanou
makromolekulu, se přidá určité
množství precipitačního činidla
(síran amonný, ethanol, aceton
apod.); makromolekulární
sloučenina se vysráží, aniž obvykle
dojde k denaturaci. Může se proto
následně znovu rozpustit a použít
ve své nativní, biologicky aktivní
podobě.
http://www.vivo.colostate.edu
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Obecný postup precipitace ethanolem
1) Přidání ethanolu, případně izopropanolu
3) Koncentrování vzorku centrifugací (roztok
zchlazený na -70ºC)
2) Přidání jednomocných kationtů (K+, Na+…)
4) Promytí sedimentu NA 70% ethanolem
5) Rozpuštění NA ve vodě
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Rozpustnost DNA ve vodě
DNA JE HYDROFILNÍ
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Obecný postup precipitace ethanolem –
Přidání NaCl + C2H5OH
NaCl
Na+
Cl-
C2H5OH
Nízká dielektrická
konstanta
Neutralizace PO3Snížení
hydrofility DNA
VYSRÁŽENÍ DNA
ve vodném prostředí
Na+
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Obecný postup precipitace - DOKONČENÍ
3) Koncentrování vzorku centrifugací (roztok
zchlazený na -70ºC)
4) Promytí sedimentu NA od zbytků solí 70%
ethanolem a odpaření ethanolu teplem
5) Rozpuštění NA ve vodě (přídavek EDTA,
případně Tris-HCl)
Nativní NA koncentrovaná v malém
objemu vodného roztoku
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Purifikace NA chromatografií
 Konkrétně se jedná o preparativní, afinitní
sloupcovou chromatografii
 Kolona obsahuje sorbent (matrici) schopnou
specificky vázat zvolenou látku (NA)
 Je používána pro přípravu většího množství
čistých molekul
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Purifikace NA chromatografií
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
23
Komerční chromatografie pro izolaci NA
- spin columns -Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Komerční chromatografie pro izolaci NA
- spin columns -
Jak se DNA váže na membránu
en.wikipedia.org
Komerční chromatografie pro izolaci NA
- spin columns -Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Izolace DNA magnetickými kuličkami
o DNA se váže na povrch magnetických kuliček
o Povrch kuliček může být potažen:
• Iontoměničovým polymerem polymerem, např. diethylaminoethyl (DEAE)
• Silica
http://www.diagenode.com/
https://nucleusbiotech.com/produkt-kategorie/ngs/magnetic-beads-for-dna-and-rna-purification/
Magnetické kuličky - protokol
29
http://blog.labplanet.com/
Low pH
High pH
http://bitesizebio.s3.amazonaws.com/
Izolace plasmidů alkalickou denaturací
 Jedna z metod pro oddělení plasmidů od
chromozomové DNA v extraktech bakteriálních
buněk
 Využívá rozdílné afinity DNA řetězců k denaturaci za
vysokého pH v závislosti na jejich konformaci a
stavu
 Pro izolaci plasmidů je možno použít komerční „spin
column“ izolační postupy
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Izolace plasmidů alkalickou denaturací
- princip metody pH
12,45
Směs plasmidů a
chromozomové DNA
Částečná
denaturace
plasmidové
DNA
Úplná denaturace
chromozomové DNA
Snížení pH + SDS
+ C2H3O2K
Renaturace DNA
Precipitace
Neutralizace
Centifugace
Sediment
Supernatant
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Charakterizace izolátu NA
Důležitou charakteristikou izolované NA
je:
Koncentrace
Čistota
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
33
 NA absorbují UV záření s maximem v oblasti 260 nm
 optická hustota odpovídá koncentraci
 absorbance je možno měřit při různých vlnových
délkách (230 nm – 320 nm)
 podíl absorbancí = čistota vzorku
Charakterizace NA spektrofotometrií
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Kterou částí NA absorbuje UV záření?Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Spektrum absorbance NA
35
A260 = 1,0 (v 1 cm
kyvetě)
dsDNA ~ 50 μg/ml
ssDNA ~ 33 μg/ml
ssRNA ~ 40 μg/ml
Závislost absorbance na koncentraci je lineární
při A260 = 0,1 až 0,3
(novější přístroje mají vyšší rozsah !!)
Optická hustota odpovídá koncentraci
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
36
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Optická hustota odpovídá koncentraci
- praktický význam -
37
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Optická hustota odpovídá koncentraci
- praktický význam -
http://www.biotek.com
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
Čistota DNA
A260/A280 = 1,8
< 1,8 = kontaminace proteiny
> 1,8 = kontaminace RNA
A260/A230 > 2,0
< 2,0 = kontaminace látkami,
které jsou součástí izolačních
souprav
Čistota DNA
Lyze buněk
a tkání
Purifikace NA
Charaktrizace
získané NA
Extrakce NA
40
Izolace DNA – studentská realita
Gratuluji, právě jste zvládli jeden z
nejdůležitějších kroků v molekulární
biologii
Izolaci nukleových kyselin