2. Centrifugační metody separace makromolekul Motto semináře: „A přece se točí“ Metody molekulární biologie pro farmaceuty Doc. RNDr. Jan Hošek, Ph.D. hosek@mail.muni.cz Ústav molekulární farmacie FaF MU Orientace v bludišti metod pro separaci biologických makromolekul Vlastnosti využívané pro dělení biologických makromolekul obecně Molekulová hmotnost Konformace a tvar Náboj Hustota Metody separace Elektromigrační Chromatografické Centrifugační Orientace v bludišti metod pro separaci biologických makromolekul Metody separace Elektromigrační Elektroforetická separace biologických makromolekul Chromatografické Centrifugační příště Orientace v bludišti metod pro separaci biologických makromolekul Metody separace Elektromigrační Elektroforetická separace biologických makromolekul Centrifugační příště Chromatografické Orientace v bludišti metod pro separaci biologických makromolekul Metody separace Elektromigrační Elektroforetická separace biologických makromolekul příště Chromatografické Centrifugační dnes Orientace v bludišti metod pro separaci biologických makromolekul Pohyb látek v gravitačním poli - centrifugace - PRINCIP Pohyb částic v tekutém prostředí pod vlivem odstředivého pole, které vzniká otáčením rotoru centrifugy. Chování částic je dáno: 1. jejich vlastnostmi 2. povahou prostředí Centrifugační metody Osa rotoru Rotace Poloměr otáčení Princip centrifugace Centrifugy Rozdělení centrifugačních technik Diferenciální centrifugace Zonální centrifugace Diferenciální centrifugace Separace směsi heterogenních částic v homogenním roztoku Rozdělení centrifugačních technik Rozdělení centrifugačních technik Zonální centrifugace Separace směsi částic s podobnými vlastnostmi v gradientním roztoku Diferenciální centrifugace • Částice se liší podstatně velikostí, hmotností nebo hustotou = složky směsi budou sedimentovat různou rychlostí. • Opakovanou centrifugací lze z původní směsi při postupném zvyšování otáček získat jednotlivé složky nebo frakce ve formě sedimentu. • Výchozí krok pro hrubou separaci a izolaci složek z lyzátů buněk nebo homogenátů tkání Směs látek v roztoku. Centrifuface při nízkých otáčkách (1 000 g). Shromáždění sedimentu. Centrifugace supernatantu při středních otáčkách (20 000 g). Shromáždění sedimentu. Centrifugace supernatantu při vysokých otáčkách (80 000 g). Diferenciální centrifugace Diferenciální centrifugace supernatant sediment separace jader, ribozómů, mitochondrií, buněčných membrán, nukleových kyselin, proteinů Diferenciální centrifugace - praxe Diferenciální centrifugací nelze oddělit  různé typy nukleových kyselin  ribozomální podjednotky  jiné částice, vykazující podobné vlastnosti To řeší zonální centrifugace Zonální centrifugace Izokinetická centrifugace  separace podle rychlosti sedimentace částic  stanovení sedimentačního koeficientu S Izopyknická centrifugace  separace podle hustoty částic 22 Síly při zonální centrifugaci Odstředivá sílaVztlaková síla Copyright © motifolio.com Rate-zonal centrifugation versus equilibrium density gradient centrifugation Sample Stabilizing sucrose gradient Slow-sedimenting component Fast-sedimenting component Centrifugation Fractionation Sample Steep sucrose gradient Low buoyant-density component High buoyant-density component 6111182 Izokinetická centrifugace Izopyknická centrifugace Zonální centrifugace  Homogenní roztok nahrazen roztokem, jehož koncentrace od povrchu ke dnu zkumavky narůstá (gradientní roztok)  K jeho přípravě se používají dobře rozpustné a vůči analyzovaným částicím inertní látky – sacharóza, glycerol  Vzrůstající hustota a viskozita gradientního roztoku eliminují vliv zvyšujícího se odstředivého zrychlení směrem od osy otáčení, čímž brání nárůstu rychlosti sedimentace částic v průběhu centrifugace. Provedení zonální centrifugace vzrůstající hustota a viskozita gradient eliminuje vliv zvyšujícího se odstředivého zrychlení  velikosti  tvaru  hustoty vzorek částice se rozvrství podle Kontinuální Diskontinuální V obou případech jsou po ukončení centrifugace částice příslušného druhu zkoncentrovány do úzkých pruhů Hustotní gradient 27http://quizlet.com/ Příprava kontinuálního gradientu Hustotní gradient Běžně používanými látkami k přípravě hustotních gradientů jsou: chlorid cesný Sacharóza Ficoll Hustotní gradient Rozdíly v hustotách se pohybují v rozmezí 1,0-1,3 g/ml u sacharózy a 1,0-1,9 g/ml u CsCl, což umožňuje oddělit a izolovat např. buněčná jádra mitochondrie nukleové kyseliny atp. Čistota získaných preparátů je vysoká Zonální centrifugace - praxe o Izolace neutrofilů z plné krve – využití polysacharózy Histopaque (ρ = 1,07 – 1,1 g/mL) Izokinetická centrifugace Tento způsob centrifugace se využívá k podrobnější charakterizaci částic např. k přesnému stanovení jejich velikosti Izokinetická centrifugace např. při analýze nukleových kyselin se obvykle používá 5-20% sacharózový gradient, v němž se koncentrace sacharózy lineárně mění od hladiny ke dnu zkumavky. rychlost sedimentace částic je v průběhu centrifugace konstantní. Izokinetická centrifugace rychlost, při níž částice sedimentuje, závisí na velikosti částice tvaru částice hustotě částice a je ovlivňována vlastnostmi prostředí podmínkami centrifugace Izokinetická centrifugace vzorek nanesený na povrch gradientu (5-20% sacharóza) centrifugace frakcionace obsahu zkumavky Izokinetická centrifugace 35 http://quizlet.com/ Sedimentační koeficient Charakterizuje rychlost pohybu částice při centrifugaci dr/dt = S . a = S . ω2 . r r = vzdálenost od osy otáčení t = doba centrifugace S = sedimentační koeficient a = ostředivé zrychlení ω = úhlová rychlost 1 Svedberg = 10-13 sekundy 23S-rRNA, 16S-rRNA, rib. podjednotky 30S, 50S Sedimentační koeficient S = sedimentation coefficient vt = terminal velocity r = distance from the axis of rotor ω = rotational speed (angular velocity) m = weight of particle η = viscosity of the medium r0 = radius of the particle Příklady hodnot standardních sedimentačních koeficientů So 20,wDensity http://jpkc.scu.edu.cn Příklady hodnot standardních sedimentačních koeficientů So 20,w Izopyknická centrifugace hustotní centrifugace nebo centrifugace do rovnováhy částice se oddělují podle své hustoty Izopyknická centrifugace během centrifugace si medium samo vytvoří koncentrační a tím hustotní gradient částice nalyzovaných látek se pohybují oběma směry tak dlouho dokud nedosáhnou polohy, v níž je hustota roztoku shodná s hustotou částic Izopyknická centrifugace Takto stanovená hustota se označuje jako vznášivá hustota. Její hodnoty jsou ovlivněny interakcí částic s ionty roztoku a jsou obvykle vyšší než je hustota částic v buňkách. Izopyknická centrifugace centrifugace frakcionace obsahu zkumavky nižší hustota vyšší hustota roztok CsCl obsahující směs částic Stanovení vznášivé hustoty izopyknickou centrifugací 25 °C = 10,8601 × nD 25 °C – 13,4974 nD 25 °C = index lomu roztoku CsCl Izopyknická centrifugace - praxe Meselson-Stahl experiment 1958 MESELSON, M; STAHL, FW. The replication of DNA in E. coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1958, roč. 44, s. 671-682. Meselson-Stahl experiment - design palyapbio.edu.glogster.com Copyright © motifolio.com The Meselson-Stahl experiment – predicted results Conservative Dispersive Semiconservative Parent DNA (15N) New DNA (14N) Parent double helices Daughter molecules Expected bands Granddaughter molecules Expected bands 6111169 48 Meselson-Stahl experiment - results palyapbio.edu.glogster.com Izopyknická centrifugace - praxe Stahl Meselson experiment 1958 MESELSON, M; STAHL, FW. The replication of DNA in E. coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1958, vol. 44, pp. 671-682. Výpočet % (G+C) • Výpočet % (G+C) - praxe Pneumococcus G+C(%) Vznášivá hustota  Salmon sperm DNA E. coli Separace různých forem DNA o Speciálním případem využití izopyknické centrifugace je rozdělení odlišných strukturních typů DNA v gradientech CsCl za přítomnosti etidium-bromidu. o Po navázání etidiumbromidu na DNA se její vznášivá hustota významně snižuje, přičemž množství navázaného etidiumbromidu a tím i pokles hustoty DNA závisí na jejím strukturním typu. o To umožňuje vzájemně separovat a izolovat různé formy DNA, např. kovalentně uzavřené kružnice plazmidových DNA od otevřených a lineárních molekul plazmidové a chromozomové DNA. Izopyknická centrifugace - praxe Chci pomocí centrifugace oddělit lineární jadernou DNA od kružnicové mitochodriální DNA (nebo plasmidy od bakteriálního chromosomu). Jak na to? Izopyknická centrifugace - praxe 6M CsCl,  = 1,7 Extrakt bakt. buněk Smíchat Centrifugace 48 hodin Izopyknická centrifugace - praxe Molekuly zaujmou polohu v místě shodné hustoty s roztokem Hustota v g/ml 1,80 1,65 Izopyknická centrifugace - praxe Hustota CsCl 1,65 1,80 RNA Chromosomální DNA Proteiny Izopyknická centrifugace – praxe - reálný obrázek Chromozomální DNA Mitochondriální DNA Centrifugace – praktický vzorec RCF = relative centrifugal force (hodnota g) rpm = repeats per minute r = poloměr otáčení (cm) RCF = 1,119 × 10-5 × rpm2 × r