10. Metody pro studium: a) protein-proteinových, b) protein-ligandových a c) protein-DNA interakcí https://www.mdpi .com/1422- 0067/20/24/6241/ htm 10. Interakce protein-protein IP1 10. Interakce protein-protein IP2 https://www.researchgate.net/figure/M utant-p53-proteins-carry-out-novel- oncogenic-interactions-A-Signaling-in- the-p53_fig2_277087873 a) protein-proteinových, b) protein-DNA interakcí c) protein-ligandových a 10. Interakce protein-protein IP 3 Metody pro studium protein-proteinových a dalších interakcí - metody pro detekci interakcí - charakterizace interakcí protein-protein (např. Kd, kvantifikace, stechiometrie, struktura...) ̶ imunoprecipitace, ko-imunoprecipitace, pull-down, ̶ flurescenční anisotropie-polarizace, ̶ SPR, ITC … ̶ afinitní purifikace, ko-purifikace, gelová filtrace, ultracentrifugace ̶ TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza ̶ kvasinkový dvou-hybridní systém ̶ FRET, ko-lokalizace, ko-exprese ̶ ko-krystalizace, cryoEM … ̶ databáze (interactom a komplexy …) ̶ genetické metody (syntetická letalita, suprese) D reconstruction of p53-DNA complex. (A) Side and top views of the p53-DNA complex. The length of the stem is limited by the size of the image frames. (B) Superimposition of the DNA-free p53 map on the p53-DNA complex map. The two maps were compared in order to determine locations of core domains and dimers within the complex. N/C � areas of N and C termini interaction. (C) Stereo view of the crystal structure of two core domains bound to DNA (PDB entry: 2ata) fitted into the high density areas of the map (threshold used: 2s (light grey). (D) Fitting of the core domains and DNA in the EM map. Core domains are displayed in blue and red, DNA in orange. Docking was performed with both Chimera and Veda/UROX. The best fits from each software produced similar results. 10. Interakce protein-protein IP4 Imunochemické metody Imunochemické metody jsou založeny na interakci antigen-protilátka. Pomocí těchto metod stanovujeme přítomnost patogenů nebo prokazujeme, zda vzorek obsahuje specifické protilátky vůči danému antigenu či nikoliv. Antigen je makromolekulární látka přirozeného nebo umělého původu, kterou organismus rozpoznává jako cizí. Protilátka je tedy molekula, které je schopna navázat se na antigen a tím spustit obrannou reakci organismu. Rozlišujeme polyklonální protilátky (namířeny proti více epitopům určitého antigenu), monoklonální protilátky (namířeny proti jednomu epitopu antigenu) a rekombinantní protilátky (kombinace obou předchozích). Vybrané metody: - Imunoprecipitace, Pull-down assay, WBimunodetekce, ELISA, SPR, ITC, FP, 5 Imunoprecipitace - metoda izolace specifických proteinů z proteinových směsí (lyzátů, purifikovaných…) prostřednictvím protilátek - protilátky jsou v komplexu se svými antigeny odděleny od ostatních molekul pomocí proteinů A nebo G (zdroj bakterie), které vážou imunoglobuliny a současně jsou imobilizovány na pevném podkladu (KULIČKY, „beads“) - proteiny A a G se vážou na oblast Fc těžkých řetězců - oblast Fab je stále k dispozici pro vazbu antigenu 10. Interakce protein-protein IP 1.Fab region 2.Fc region 3.Heavy chain with one variable (VH) domain followed by a constant domain (CH1), a hinge region, and two more constant (CH2 and CH3) domains. 4.Light chain with one variable (VL) and one constant (CL) domain 5.Antigen binding site (paratope) 6.Hinge regions 6 Imunoprecipitace- protilátka je imobilizována na pevném podkladu (např. paramagnetických nebo agarózových/nemagnetických kuličkách), váže antigen –protein a vyváže jej ze směsi (získáme nativní či denaturovaný protein) Postup: - lýze buněk, in vitro translace, směs proteinů - inkubace vzorku (buněčných extraktů …) s protilátkou -precipitace kuličkami s proteiny A/G - promytí - oddělení proteinu od kuliček a detekce (WB, využití další) - detekce protein (nejčastěji se proteiny oddělí od imunoglobulinů a kuliček denaturačně elektroforéza, WB) https://www.youtube.com/watch?v=QRgTpCEY2nU 10. Interakce protein-protein IP 7 https://www.youtube.com/watch?v=QRgTpCEY2nU 10. Interakce protein-protein IP https://www.researchgate.net/figure/Mutant-p53- proteins-carry-out-novel-oncogenic-interactions-A- Signaling-in-the-p53_fig2_277087873 10. Interakce protein-protein IP8 Různé systémy afinitních značek a jejich interakčních partnerů využívané pro purifikaci proteinů nebo studium protein-protein interakcí -proteinových interakcí (afi nitní koprecipitaci). TAG 10. Interakce protein-protein IP9 Koimunoprecipitace (Co- IP) a afinitní koprecipitace, (pull- down analýzy) Ďurech M., Trčka F., Vojtěšek B., Müller P., Metody pro studium protein-proteinových a protein-ligandových interakcí 10 Izolace specifických proteinů (tzv. pull-down assay) https://www.youtube.com/watch?v=euHjpUs20YE10. Interakce protein-protein IP 10. Interakce protein-protein IP11 Cíle: Kvalitativní parametry - proteiny, interakční partnery, porozumění interakcím WB, IP Kvantitativní definování - afinita (Kd…) ELISA SPR FP, fluorescenční anizotropie - afinita, kinetické a termodynamické parametry (DG, DH, DS)- ITC 10. Interakce protein-protein IP12 Rezonance povrchového plazmonu (SPR) Vysoce citlivý a teplotně stabilizovaný SPR biosensorový systém pro monitorování biomolekulárních interakcí v reálném čase bez nutnosti značení biomolekul. Pomocí SPR sytému T200 lze získat informace o kinetice, affinitě, koncentraci, specifitě, selektivitě a termodynamice biomolekulárních interakcích a tato metoda tak může být použita v různých oblastech od základního výzkumu po výzkum bioterapeutik a léčiv. V principu, jeden z vazebných partnerů je imobilizován na povrchu biosenzoru a druhý je přítomen volně v nánášecím pufru. 10. Interakce protein-protein IP13 Princip metody fluorescenční polarizace (A), měření interakce proteinu s ligandem (B) a inhibice interakce proteinu s ligandem (C) metodou FP. Ďurech M., Trčka F., Vojtěšek B., Müller P., Metody pro studium protein- proteinových a protein-ligandových interakcí 10. Interakce protein-protein IP14 Izotermální titrační kalorimetrie (ITC) Ďurech M., Trčka F., Vojtěšek B., Müller P., Metody pro studium protein- proteinových a protein-ligandových interakcí Izotermální titrační kalorimetrie se používá pro charakterizaci biomolekulárních interakcí malých molekul, proteinů, protilátek, nukleových kyselin, lipidů a ostatních. Během jednoho experimentu je možné získat kompletní termodynamický profil (stechiometrie, Ka, ∆H and ∆S).