Přístupy k analýze buněčných proteinů / Ústav molekulární farmacie (ÚMF)1 9_ Přístupy k analýze buněčných proteinů Zuzana Soldánová Marie Brázdová Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF2 Metody ̶ stanovující fyzickou přítomnost buněčných proteinů ̶ Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) • SDS-PAGE ̶ Westernův přenos ̶ Imunodetekce proteinů ̶ ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ̶ Imunoprecipitace ̶ Imunohistochemie ̶ Izoelektrická fokusace ̶ Dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF3 Purifikace proteinů ̶ 1. krok ̶ zisk suspenze buněk nebo tkáně ̶ 2. krok ̶ rozbití buněk nebo tkáně 1. ultrazvukem 2. použitím mírného detergentu na perforaci plasmatické membrány 3. protlačení buněk malým otvorem 4. rozbití buněk těsnícím rotačním pístem v tlustostěnné nádobce ̶ 3. krok ̶ zisk hustého homogenitu nebo extraktu s většími i menšími molekulami z cytosolu (enzymy, ribosomy, metabolity, membránou uzavřené oraganely) ̶ zisk organel v neporušeném stavu Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF4 Homogenizace buněk nebo tkání Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF5 Elektroforetické techniky ̶ schopnost pohybu elektricky nabitých molekul v elektrickém poli ̶ vertikální polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) ̶ používají se alkalické pufry • udělení negativního náboje proteinům – proteiny se poté pohybují ke kladné elektrodě (anodě) ̶ různé varianty • gel vložený mezi dvě nádoby naplněné pufrem, do kterých se ponoří elektrody • desková varianta (vzorky jsou naneseny do jamek na horní straně gelu) Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF6 Faktory ovlivňující pohyblivost proteinů v gelu ̶ Velikost ̶ se vzrůstající velikostí molekuly se snižuje pohyblivost proteinů v gelu (efekt molekulárního síta) ̶ Tvar ̶ globulární proteiny se pohybují rychleji než vláknité ̶ Hustota náboje ̶ náboj/jednotka hmoty ̶ čím vyšší je hustota náboje tím vyšší je pohyblivost v gelu ̶ Koncentrace akrylamidu ̶ se vzrůstající koncentrací pohyblivost klesá Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF7 PAGE ̶ proteiny ̶ různé tvary molekul ̶ disponují také různými náboji ̶ DNA ̶ uniformní z hlediska tvaru a rozdělení náboje ̶ Interpretace elektroforetogramu v nativní podobě je obtížná. Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF8 SDS-PAGE ̶ denaturační varianta PAGE ̶ běžně používaná metoda ̶ používá se pro separaci proteinů ̶ příprava vzorků ̶ rozpouštění v roztoku obsahujícím negativně nabité molekuly (SDS: dodecylsulfát sodný) ̶ eliminace disulfidových vazeb v proteinech redukčním činidlem (β-merkaptoetanol) ̶ dokončení přípravy vzorků varem Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF9 SDS-PAGE ̶ SDS ̶ negativně nabitý ̶ váže se k proteinům • zamaskování vlastního náboje proteinu • denaturace proteinu a eliminace vlivu tvaru proteinu • počet molekul SDS navázaných na protein je zhruba úměrný jeho molekulové hmotnosti • ekvivalentní hustota náboje • větším proteinům v gelu kladen větší odpor • Pomalejší pohyb (efekt molekulárního síta) ̶ Proteiny se separují pouze podle molekulové hmotnosti Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF10 SDS-PAGE Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF11 Způsoby přenosu ̶ kapilární přenos ̶ závaží, skleněná destička, papír, filtrační papír, nitrocelulózový filtr, gel, filtrační papír, skleněné destičky ponořené v přenosovém pufru ̶ suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu ̶ elektroforetický přenos ̶ Westernův přenos (proteiny jsou záporně nabité a putují ke kladné elektrodě – anodě) ̶ hnací silou je síla elektrického pole ̶ vakuový přenos ̶ obdobné uspořádání jako o kapilárního přenosu, avšak vzorek je tažen vakuem ̶ rychlejší než kapilární přenos Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF12 Westernův přenos ̶ přenos proteinů rozdělených elektroforézou z gelu na pevný filtr (membránu) ̶ složení: hubka, filtrační papír, gel, membrána, filtrační papír, hubka Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF13 Zviditelnění proteinů ̶ Nespecificky ̶ obarvení všech proteinů v gelu • Coomassie Brilliant Blue • Stříbro ̶ Specificky ̶ obarvení pouze vybraného proteinu • protilátky Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF14 Barvení Coomassie Brilliant blue Ponceau S Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF15 Imunodetekce proteinů 1. vysycení volných vazebných míst na membráně ̶ roztoky levného proteinu (mléko, BSA,…) 2. navázání primární protilátky na příslušný antigen při promývání filtru roztokem specifické protilátky 3. promývání 4. navázání sekundární protilátky obsahující konjugovaný enzym 5. promývání 6. dodání příslušného substrátu pro konjugovaný enzym 7. detekce signálu ̶ chemiluminiscence ̶ detekce zbarvení ̶ pro zviditelnění proteinu na membráně se užívají například radioaktivní sondy nebo výše zmíněné sekundární protilátky Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF16 Imunodetekce proteinů Patobiochemie 2. cvičení Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF17 Protilátky ̶ jsou schopny rozeznat konkrétní epitopy proteinů ̶ slouží jako sondy ̶ rozdělení ̶ monoklonální • získávají se z hybridomů ̶ polyklonální • získávají se z krve imunizovaných zvířat Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF18 Monoklonální protilátky ̶ produkují se pomocí hybridomů ̶ ten vzniká fůzí nádorové leukemické buňky (nesmrtelnost) a B-lymfocyty imunizovaného zvířete (produkce protilátek) ̶ drahá příprava, ale na konci téměř neomezený zdroj protilátky ̶ specifické pouze k jednomu epitopu Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF19 Polyklonální protilátky ̶ získávají se ze séra imunizovaných laboratorních zvířat ̶ relativně levná a rychlá příprava ̶ reagují s více epitopy Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF20 Primární protilátka ̶ váže se na specifický epitop antigenu ̶ váže se na ni značená sekundární protilátka Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF21 Sekundární protilátka ̶ jsou specifické pouze proti malému počtu primárních protilátek ̶ anti-myší IgG ̶ anti-králičí IgG ̶ značené různými způsoby ̶ radioaktivně ̶ křenová peroxidáza (horseradish peroxidase – HRP) ̶ alkalická fosfatáza ̶ biotin ̶ fluorescenční značka Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF22 Detekční metody ̶ kolorimetrické metody ̶ chemiluminiscence ̶ bioluminiscence ̶ chemifluorescence ̶ fluorescence/autoradiografie ̶ zlatem značené protilátky Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF23 Imunobloting 1. rozdělení proteinů daného vzorku gelovou elektroforézou 2. přenos proteinů na membránu (western blotting) 3. inkubace membrány se specifickou protilátkou 4. inkubace membrány se sekundární značenou protilátkou 5. detekce navázané protilátky Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF24 ELISA ̶ Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ̶ využívá dvě protilátky proti jednomu proteinu ̶ 2 různé epitopy ̶ jedna protilátka je navázána na nosiči ̶ nejčastěji na stěně reakční nádoby Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF25 ELISA ̶ výhody ̶ vysoká citlivost • pg/ml • potřeba malého množství vzorku ̶ možnost využití poloautomatických systémů Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF26 ELISA ̶ provedení: 1. vazba proteinu na první protilátku 2. promytí 3. vazba druhé protilátky na protein 4. promytí 5. detekce druhé prolitátky Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF27 AlphaLISA ̶ modifikace metody ELISA ̶ „ELISA v roztoku“ ̶ žádné promývání ̶ donor i akceptor je navázán na cílové molekule ̶ donor produkuje singletový kyslík ̶ výsledkem je zesílení signálu ̶ rozsáhlé spektrum využití Přístupy k analýze buněčných proteinů / ÚMF28 AlphaLISA