Světelný mikroskop - základní pracovní nástroj Tři cíle mikroskopie: • zvětšit obraz • rozlišit detaily v obraze • popsat detaily viditelné okem nebo kamerou Jednoduchý mikroskop Složený mikroskop jedna čočka nebo jeden systém čoček více čoček nebo více systémů čoček Světelná mikroskopie a kontrastní metody Historie světelného mikroskopu Odjakživa chtěli lidé vidět věci mnohem menší, než mohli vnímat pouhým okem Hans a Zacharias Janssenovi tubus Zacharias Janssen {1530-1638} okular První složený mikroskop (kolem 1595) zvětšoval 3x při zatažení tubusu a více než 10x při max. roztažení, měřil 1,2 m 1625 - nejstarší známá kresba mikroskopu "M A AC ANA NATUR/Í Ak ANTU»llí van LlíutTíO-HIÍÉK. HFÍIM1H U[IT11||[M. v-lit-iiiLii.n'.iWSjpiTíiji ■ J I Cl . . . r lock mit Mikroskop ' .--aus Gloede. S. 51 Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) Jednoduchý mikroskop(1660) Konvexní skleněná čočka byla připevněna do kovového držáku a byla zaostřována pomocí šroubu. Robert Hook 1665 složený mikroskop kniha Micrographia, sledování tenkých řezů korkem -pojem buňka n ■ří «■ Sííííí í í í **+«♦♦*««+**> Bj'ihe CouiVíil of the RüTH. Society of ic&ŕľiľ far Improving of Nitonl KtLOwkájŕ. lr¥]tiiin 'Imii m^.r,tijňmfíj J^wMiiij mf]?JW] WrifjL MÍCROGRAPÍHA: ni i a h i minute' bodies MADE IT HASHJfyiNG fi r. A ■ • ' Oi»itiiii>i at liuitjn áwfifa,. •-r r. iwČKt, Fm «h r . : ~----- Robert Ho o ke {163S-1703} zaostřovací šroub "objektiv držák pre Mikroskopy 17. století Galileo Galilei poroku 1600 nfefe Itálie Guiseppe Campani, 1662 Jednoduchý Italský mikroskop, 1686 Anglie John Yarwell, 1680 Mikroskopy 18. století 1700 1730 ■^1-JjfcŠi-^ Mikroskopy 19. století Mikroskopy 20.století Olympus 1998 Leitz1910 Lupa Skládá se z jedné čočky nebo z jediného systému C0Cek Olympus CX31 Okular [pevná zvSiisní tox) Stupnice vzdálenosti okulárii Složení mikroskopu Kroužek dioptrické korekce Revolverový nVuoj Objektiv Držák preparátu Přepravní pojistka* Páčka apertumt clony Centrovacf šrouby kondenzoru Kondenzor Upevňovací íroub tubusu jjte šroubovák ivaný s mikroskopem) Kolečko zarážky pro zaostřován ľ Stativ CX31BBSF umožňuje kroskopických — nf.v..v0ViT' pojistka" J něrré vady naho pole, ■-"lack" ' akz dle kolečko Intenzity svetla Stolek Kofečko mtkroposuvu Objímka pro filtry (o průměru 45 mm) Krouíek polní clony Kolečko makíoposuwi Kolečko posuvu v ose X KoSečko posuvu v ose V 1. Část mechanická: stativ, noha stativu, tubus, revolverový měnič objektivů, stolek, makrosroub, mikrosroub 2. Část osvětlovací: zdroj světla, zrcátko, polní clona, kondenzor, irisová clona, objímka filtru 3. Část optická: objektivy, okuláry 1. Část mechanická Stativ Noha statívu Tubus - spojuje okular a objektiv Mechanická (optická) délka tubusu - vzdálenost mezi horním a dolním koncem tubusu, mění se vzájemným posunem dvou na sebe nasunutých částí, dána výrobcem (160 - 170 mm) a je nutno ji dodržovat - objektivy a okuláry konstrukčně přizpůsobeny - nekonečná délka tubusu (vkládání modulů), oc - monokulárni přímý, šikmý, binokulární, trinokulární Revolverový měnič objektivů Stolek - pohyblivý; s křížovým vodičem preparátu, který se ovládá dvěma šrouby Makros roub - pro hrubé ostření Mikrošroub - pro jemné doostřování 2. Část osvětlovací Pozorování ve světle procházejícím x dopadajícím Zdroj světla - lampa v noze statívu s kolektorovou čočkou (fixně seřízená), kolektor spolu se zrcátkem soustřeďuje světlo do kondenzoru Polní clona - používá se při malém zvětšení, viz práce s mikroskopem Irisová clona - reguluje množství světla přicházejícího do mikroskopu, stupnice, podle které se nastavuje numerická apertura kondenzoru Kondenzor - 2-3 spojky, objímka; soustřeďuje paprsky pro dokonalé osvětlení zorného po/e;optická osa osvětlovací soustavy musí procházet středem kondenzoru Numerická apertura kondenzoru má být vždy menší než numerická apertura objektivu (70-80%) Filtry - modrý, šedý 3. Část optická - čočky Zabezpečuje vhodnou kombinací čoček (kromě vytváření obrazu) také v různé míře odstraňování hlavních optických vad čoček ČOČKY Průhledné těleso omezené vypuklými (konvexními) a vydutými (konkávními) plochami Z funkčního hlediska rozlišujeme: spojky a rozptylky Optická osa (prochází středem čočky - O) a 2 ohniska (obrazové F -vzniká v něm obraz; předmětové F'- na straně předmětu) Středem čočky proložíme hlavní rovinu a vzdálenost ohniska od hlavní roviny se nazývá ohniskovou vzdáleností (f) i L F' F 0 1 f 3. Část optická - čočky Geometrické zobrazování spojnou čočkou (viz obr.) - paprsek rovnoběžný s optickou osou se na povrchu čočky láme do F; paprsek procházející středem čočky se neláme; paprsek procházející F' se láme rovnoběžně s optickou osou Zobrazování předmětu mikroskopem: preparát umístěn mezi dvojnásobnou ohniskovou vzdálenost a ohnisko objektivu - skutečný, zvětšený, převrácený obraz Hlavní vady čoček: Vada barevná (chromatická) - způsobená různým lomem světla o různé vlnové délce odstranění pomocí soustavy dalších čoček (achromáty) Vada kulová (sférická) - vzniká tím, že paprsky rovnoběžné s osou se lámou různě podle jejich vzdálenosti od středu čočky Vada astigmatická - paprsky dopadající na čočku ze strany se neprotnou v jednom bodě Vyklenutí zorného pole - paprsky dopadající na čočku šikmo mají jiné ohnisko než rovnoběžné paprsky přímé; nelze zaostřit na celé zorné pole 3. Část optická - objektiv Vytváří zvětšený převrácený a skutečný obraz předmětu Čím je kratší ohnisková vzdálenost objektivu, tím je větší zvětšení. Zvětšení objektivu - je vyznačeno (10x, 20x, 30x); dá se vypočítat z ohniskové vzdálenosti podle vzorce Z = 250 / f 250mm je tzv. normální zraková délka Numerická apertura (A) - vyjadřuje vztah mezi otvorovým úhlem (úhel, který svírají dva nejkrajnější paprsky, které se ještě dostanou do otvoru objektivu) a lomivostí prostředí objektiv A = N * sin a/2 a - otvorový úhel \ a / N - index lomu prostředí mezi \^ ^S objektivem a preparátem preparát -------^---------------- 3. Část optická - objektiv Čím je větší numerická apertura, - tím je vyšší rozlišovací schopnost objektivu (schopnost rozlišit dva vedle sebe ležící body jako samostatné). - tím menší hloubková ostrost (schopnost současně ostře zobrazit větší nebo menší počet rovinných vrstev předmětu). Světelnost objektivu je přímo úměrná A2 Krycí sklíčko N=1,51, vzdušné prostředí N=1 —► 2 úhly (menší ve skle, větší ve vzduchu), pod nímž vstupují paprsky do objektivu —► do objektivu se dostane menší množství paprsků (použití imerzního oleje N=1,5) Pozorovací (pracovní) vzdálenost - vzdálenost čelní čočky objektivu od krycího skla preparátu Velikost zorného pole - větší, čím menší zvětšení objektiv má (čím větší f, tím větší zorné pole) Světelnost objektivu - intenzita osvětlení zorného pole, závislá na numerické apertuře (viz výše) 3. Část optická - objektiv Typy objektivů Achromaty - jednoduché, složené ze 2 až 6 čoček; je u nich korigovaná chromatická vada, a to pro žlutou až zelenou oblast spektra Apochromaty - korekce barevné vady pro tři základní barvy spektra, vyšší numerická apertura a lepší rozlišení detailů Planachromaty - barevně korigovány jako achromaty a korigováno i vyklenutí zorného pole (mikrofotografie) Planapochromáty - zcela odstraněno vyklenutí zorného pole i chromatická vada, patří k nejlepším a nejdražším objektivům Fluoritové objektivy - z fluoritového skla (vynikající optické vlastnosti), dobře propouští UV záření, vhodné pro fluorescenci ale i pro pozorování ve světlém poli 3. Část optická - objektiv Suché objektivy - mezi objektivem a krycím sklem je vzduch Imerzní objektivy - imerzní olej (mezi objektiv a krycí sklo, mezi přední čočku kondenzoru a podložní sklo) - vodní imerze Objektivy pro práci bez krycího skla - NCG (no cover glass)-hematologie Objektivy s korekcí na tloušťku krycího skla - korekční prstenec Objektivy s irisovou clonou - omezení světelného toku objektivem, vliv na hloubku ostrosti Odpružené objektivy - zamezení mechanickému doteku čočky Objektivy pro speciální pracovní postupy - např. fázový kontrast, DIC Ivůtáenl Objaktiv s korekcí na nekoficůna OzfiaÍBnííJbjakUuu Numerická apert ara Houftťha krycrtio šidítka Sarovnr pruh Barevné označení objektivů - červená,žlutá, zelená,světle modrá, tmavě modrá, černá 3. Část optická - okular Zvětšuje obraz vytvořený objektivem Zvětšení okuláru je prázdné - nezobrazuje více detailů, než bylo zobrazeno objektivem Typy okulárů Huygensův okular H - skládá se ze 2 čoček, v kombinaci se slabými objektivy (achromáty) Ortoskopické okulary O - nezkreslují zorné pole, v kombinaci s objektivy achromatickými a planachromatickými Kompenzační okulary K - kompenzují chromatickou vadu objektivů, jsou určeny pro práci s apochromáty Periplanatické okulary P - kompenzují chromatické vady a částečně i vyklenutí zorného pole, v kombinaci s planachromatickými objektivy Brill okulary - umožňují pozorování a kompenzaci pro dioptrické oko, dioptrická korekce, manžety Průměr zorného pole (FN - field number) -18 - 22 mm, širokoúhlé okulary (UW) - až 25 mm Projektivy - okular používaný při mikrofotografii užitečné zvětšení mikroskopu -minimální - numerická apertura objektivu x 500 maximální - numerická apertura objektivu x 1000 objektiv 1OOx, NA 1,3 = okular 13x = okular 6,5x měření pomocí mikroskopu do okuláru se vkládá destička s pomocnou sítí nebo měřítkem -1 mm rozdělený na 100 dílků -objektivové měřítko, kterým pro danou soustavu objektiv-okulár vypočítáme tzv. kalibrační faktor (číslo, kterým musíme násobit počet dílků okularoveho měřítka, abychom dostali měřenou vzdálenost v jednotkách délky (mm, mikrometry) zjišťujeme, které dílky okularoveho a objektivového, měřítka se překrývají a trojčlenkou vypočítáme hodnotu 1 dílku okularoveho měřítka pro použitý objektiv Úplné Köhlerovo osvětlení skládá se ze nastavujeme do optimální polohy • zdroje svetla . clonu osvětlovacího systému • kolektorové čočky , „ • clonu kondenzoru • irisové clony • polohu kondenzoru 1. Umístíme preparát a zaostříme s objektivem 10x 2. Uzavřeme polní clonu 3. Kondenzor snižujeme nebo zvyšujeme tak dlouho, až je obraz svítícího pole ostře ohraničený 4. Polní clonu otevřeme tak, aby se dotýkala okrajů zorného pole. 5. Obraz svítícího pole posuneme centrovacími šrouby kondenzoru do středu zorného pole Postup práce s mikroskopem Mikroskop přenášíme oběma rukama (kapotáž) Manipulujeme pouze pomocí vroubkovaných částí 1. Zapneme mikroskop, nastavíme osvětlení, vložíme preparát, zařadíme objektiv 10x, zaostříme na preparát 2. Nastavíme vzdálenost okulárů a provedeme dioptrickou korekci (okular bez dioptru zaostříme na objekt mikrošroubem, zavřeme oko; okular s dioptrem doostříme podle svého oka). Použití manžet: při pozorování s brýlemi ponechte manžety ohrnuté, nikdy manžety neodstraňovat z hygienických důvodů !!!!!!!! 3. Nastavíme aperturní clonu 4. Zařadíme požadovaný objektiv a doostříme mikrošroubem. 5. Zařadíme filtr, přizpůsobíme osvětlení a pozorujeme Potřeby pro mikroskopování Krycí skla -různá tloušťka (0,08; 0,11; 0,13;0,17;0,20 mm) - velikost (mm) a tvar Podložní skla - různá tloušťka (1; 1,2 mm) velikost (26 x 70 mm) - zabroušené hrany, matované Preparační soustavy- pinzeta, skalpel, nůžky, preparační jehly, štětec, pipeta Laboratorní sklo - Petriho miska, hodinové sklo, kádinka atd. Krabice na preparáty Slohy na preparáty Kontrastní metody kvalita zobrazení biologických objektů závisí na 1. dostatečném zvětšení obrazu (maximální užitečné zvětšení = numerická apertura objektivu x 1000) 2. rozlišovací schopnosti mikroskopu (numerická apertura objektivu a kondenzoru, kvalita osvětlení preparátu - Koehlerovo osvětlení) 3. kontrastu obrazu (cytologická a histologická barviva, optické metody) • Fázový kontrast • Nomarskeho diferenciální interferenční kontrast (DIC) • Hoffmanův modulační kontrast (HMC) • Dodtův infračervený gradientovy kontrast (DGC) • Fluorescence • Konfokální laserová skanovací mikroskopie Metoda fázového kontrastu Frits Zernike, 1934 Nobelova cena Zeiss, Jena amplituda - intenzita světla vlnová délka - barva 400 nm .500 nm- 600 nm 7.00 nm' fázový posun - neviditelný pro lidské oko Nebarvené objekty různá optická hustota změna fáze ZAŘÍZENI pro fazovy kontrast změna fáze vlnění na změnu amplitudy viditelné pro člověka Objektivy pro fázový kontrast - fázový prstenec (převádí neviditelné fázové rozdíly na rozdíly amplitudové) Kondenzor - aperturní kroužek pro různé zvětšení Centrovací dalekohled - seřízení fázových prstenců Zelený filtr- 540 nm fázová destička procházející světlo x fázový kontrast křídlo motýla Problem halace apodizovaný fázový kontrast Malformovaný střední háček diplozoona Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) - povrchová topologie objektu kolem 1950, Georges Nomarski mikroskop -1959 Carl Zeiss zvětšený obraz vzorku se jeví jako šikmo osvětlený trojrozměrný objekt n analyzátor interference dvou laterálně posunutých obrazů a srovnání | Wollastonův hranoly fázových rozdílů v celé ploše obrazu objektiv preparát kondenzor Wollastonův hranol polarizátor vzniknou dva identické obrazy objektu, které jsou vůči sobě laterálně posunuty různá tloušťka preparátu = fázové rozdíly rozdělení polarizovaného světla na dvě složky lineární polarizace světla Ancylostoma duodenale červené krvinky Clonorchis sinensis pylové zrno borovice ■ w. i- ■ I £ řez ledvinou myši příchytné svorky diplozoona Nové technologie • mikroskop s videokamerou • spojení počítače s mikroskopem • digitalizace a analýza obrazu DIGITÁLNÍ MIKROSKOP Olympus MIC-D Místo klasického pozorování pomocí okulárů zobrazuje MIC-D na monitoru osobního počítače, který je s mikroskopem spojen USB kabelem. Protože se jedná o digitální obraz, jeho zpracování je velmi rychlé a snadné: uživatel jej může uložit, vymazat, upravit, vytisknout, umístit na web nebo poslat e-mailem.