Metody molekulární biologie
1. Základní metody molekulární biologie
A. Izolace nukleových kyselin
ˇ Metody využívající různé rozpustnosti
ˇ Metody adsorpční
ˇ Izolace RNA
B. Centrifugační techniky
o Princip separace částic při centrifugaci
ˇ diferenciální centrifugace
ˇ zonální ultracentrifugace, gradientní centrifugace, detekce
biomakromolekul po separaci
ˇ izokinetická centrifugace, stanovení sedimentačního koeficientu,
výpočty mol. hmotnosti biomakromolekul
ˇ izopyknická centrifugace, stanovení hustoty biopolymerů, obsahu GC
v DNA, využití při odlišení DNA s různou konformací (EB/CsCl
gradient)
C. Elektroforéza nukleových kyselin
o Princip separace částic při elektroforéze
a) Elektroforetická separace v gelech; agarozové a polyakrylamidové
gely
ˇ Separace nukleových kyselin a restrikčních fragmentů DNA,
detekce NK v gelech, barvení: EB, Ag, fluorescenční barviva,
autoradiografie
ˇ Typy hmotnostních standardů, výpočet velikosti biomakromolekul
b) Pulzní gelová elektroforéza
ˇ Princip separace NK v pulzním poli
ˇ Jednotlivé typy PFGE a jejich využití
ˇ Hmotnostní standardy při PFGE
ˇ Využití PFGE při analýze genomů.
D. Elektronová mikroskopie
ˇ Využití EM při analýze NK, princip EM
ˇ Příprava vzorků pro EM
ˇ Analýza heteroduplexů, mapování NK, identifikace oblastí bohatých
AT páry, míst vazby proteinů apod.
ˇ Analýza buněčných a molekulárních struktur v EM

2. Využití enzymů při manipulacích s NK in vitro
ˇ přehled a dělení enzymů podle zdrojů, substrátů a aktivit
ˇ restrikční endonukleázy, charakteristika, definice jednotky, způsob
využití
ˇ vliv metylace na aktivitu restrikčních enzymů
ˇ využití enzymů při značení NK
ˇ zpětná transkriptáza: příprava cDNA
ˇ využití enzymů při klonování
ˇ řízené vytváření delecí nukleázami Bal31, ExoIII
ˇ modifikace konců molekul DNA
3. Hybridizace NK
ˇ rozdělení hybridizačních technik
ˇ fyzikálně-chemická podstata hybridizace NK, faktory ovlivňující
tvorbu hybridů
ˇ radioaktivní a neradioaktivní značení NK
ˇ způsoby značení DNA sond: - použití náhodných oligonukleotidů
- posunem jednořetězcového zlomu
- značení konců
ˇ značení vektoru s naklonovanou sondou
ˇ značení transkriptů in vitro
ˇ hybridizace in situ
ˇ hybridizace na filtrech: Southernův blotting, northern blotting,
western blotting, south-western blotting
ˇ hybridizace kolonií
ˇ tečková hybridizace
4. Sekvencování NK
ˇ chemická metoda (Maxam-Gilbert)
ˇ enzymová metoda (Sanger)
ˇ automatické sekvencování
ˇ využití PCR pro sekvencování
5. Průtoková cytometrie
ˇ princip
ˇ využití

6. Přenos genů do živých buněk
ˇ základní transfekční techniky (precipitace fosforečnanem vápenatým,
lipofekce, elektroporace, mikroinjekce, použitím virových vektorů)
ˇ přenos genů do zárodečných myších buněk mikroinjekcí
ˇ přenos genů do myší prostřednictvím embryonálních kmenových
buněk
ˇ přenos genů do rostlinných buněk
7. Klonování DNA, genové knihovny
ˇ příprava rekombinantních molekul DNA, základní pojmy
ˇ základní typy bakteriálních vektorů a jejich charakteristiky
(klonovací vektory, expresivní vektory, bifunkční vektory)
- plazmidové vektory (pBR322, pUC)
- vektory odvozené od bakteriofágů (lambda, M13, P1)
- kosmidy, fágemidy, fasmidy, pEMBL, umělé bakteriální a
kvasinkové chromozomy
ˇ selekce a analýza rekombinantních klonů, modrobílý test
ˇ zakládání genových knihoven, typy genových knihoven (genomové,
cDNA, expresní)
ˇ vektory používané pro přenos genů do kvasinek, rostlin a živočichů
(přehledně)
ˇ transkripce a translace in vitro
8. PCR
ˇ princip PCR, charakteristika reakčních složek, příprava primerů,
detekce produktů
ˇ typy PCR (asymetrická, inverzní, RT-PCR, RACE, in situ PCR aj)
ˇ využití PCR pro detekci mutací a polymorfismů (obecné principy)
ˇ využití PCR-fingerprintů v praxi (forenzní genetika, šlechtitelství,
archeologie, aj)
9. Analýza proteinů
ˇ polyakrylamidová gelová elektroforéza ­ princip, použití
ˇ izoelektrická fokuzace
ˇ dvourozměrná gelová elektroforéza
ˇ imunoprecipitace proteinů
ˇ příprava monoklonálních a polyklonálních protilátek a jejich využití

o Analýza interakcí protein ­ DNA
ˇ ,,Footprinting" princip a využití
ˇ technika založená na změně pohyblivosti DNA v elektrickém poli
po navázaní proteinu (,,electrophoretic mobility shift assay")
ˇ použití reportérských genů při studiu aktivity transkripčních
faktorů a při studiu struktury promotorů
10. Mapování genomů, restrikční mapování, základy genomiky
ˇ přístup shora dolů a zdola nahoru, konstrukce (makro)restrikčních
map konstrukce kontigové mapy,
ˇ strategie využití STS, ETS, STS-YAC a STS-BAC při mapování
genomů
ˇ klonování specifických genů, diferenciální skríning
ˇ vyhledávání a identifikace genů, poziční a funkční klonování
11. Diagnostika - Přehled používaných technik pro DNA fingerprinting a
význam DNA typizačních metod
A. Genotypové typizační metody bez amplifikace DNA
ˇ Restrkční analýza celkové chromozomální DNA (analýza malých
fragmentů)
ˇ Makrorestrikční analýza (izolace DNA pro PFGE, kritéria pro
výběr vhodných restrikčních enzymů, faktory ovlivňující separaci
DNA při PFGE, dvourozměrná PFGE, separace kružnicových
molekul, interpretace výsledků PFGE u bakteriálních genomů)
ˇ Analýza plazmidové DNA
B. Genotypové typizační metody využívající selektivní hybridizaci
restrikčních fragmentů (SRFH)
ˇ Základní metodické kroky pro SRFH
ˇ Přehled a příprava sond používaných pro SRFH (náhodně
klonované sondy, genově specifické sondy, sondy z vícekopiových
elementů, sondy z ribozomální RNA)
ˇ Ribotypizace (historie, charakteristika bakteriálního rrn operonu a
princip metody, automatizované systémy)
ˇ Metody pro DNA fingerprinting lidského genomu (používané sondy,
stanovení paternity)
C. Genotypové typizační metody s amplifikací DNA
ˇ AP-PCR
ˇ interrepetitivní PCR
ˇ ITS-PCR
ˇ AFLP

12. Molekulární diagnostika genů nebo jejich částí
Amplifikační metody (PCR-RFLP, multiplex-PCR, ARMS)
Metody využívající elektroforetickou separaci DNA s rozdílnou konformací
ˇ Konformační polymorfizmus jednořetězců (SSCP)
ˇ Dideoxy-fingerprinting (DDF)
ˇ Denaturační gradientová elektroforéza (DGGE)
ˇ Analýza konformace dsDNA (DCSA)
ˇ Heteroduplexní analýza (HMA)
Typizační metody s použitím endonukleáz specifických pro RNA nebo
ssDNA
ˇ Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů vytvořených
cleavasou (CFLP)
ˇ RNázová protekční analýza
ˇ Fingerprinting pomocí oligonukleotidů
Speciální amplifikační metody
ˇ Amplifikace DNA pomocí transkripce (TAS, 3SR)
ˇ Amplifikace s vytěsňováním řetězce (SDA)
ˇ Ligázová amplifikační reakce (LAR, LCR)
ˇ Amplifikace RNA sondy pomocí Qß replikázy