Molekulární podstata nádorového bujení klíč k porozumění procesů v základech lidské rakoviny. Nádor vzniká ze společné buňky, ve které byl - většinou desítky let před vznikem viditelného nádoru - zahájen program neregulovaného dělení. Maligní transformace buňky probíhá přes akumulaci mutací ve specifických třídách genů. Existují dvě třídy genů, které dohromady tvoří jen malou část celé genetické výbavy, ale hrají hlavní úlohu v zahájení procesu tvorby nádoru. Ve své normální konfiguraci řídí životní cyklus buňky, tj. sled dějů, při kterých se buňka zvětšuje a dělí. PROTOONKOGENY jsou normální buněčné geny mající základní význam ve fyziologii buňky. Hrají úlohu především v regulaci životního cyklu buněk: ► Buněčného cyklu ► Buněčné proliferace ► Diferenciace ► Apoptózy V průběhu evoluce dobře konzervovány a jejich přítomnost v normálních buňkách všech vyšších organismů předpokládá, že mají základní význam v buněčné fyziologii. Kódují proteiny, které hrají klíčovou na různých úrovních integrace mitogenních signálů nesených růst. faktory a hormony. Jsou-li modifikovány, ať na strukturální nebo kontrolní úrovni, začnou se chovat jako onkogeny a podporují vývoj nádoru. ONKOGENY mutované nebo aktivované protoonkogeny Proces karcinogeneze zahrnuje změněné exprese nebo funkce protoonkogenů na různých stupních transdukce signálů. NÁDOROVĚ SUPRESOROVÉ GENY (ANTIONKOGENY) zabraňují abnormální buněčné proliferaci Human Cytomegalovirus (HCMV; Human Herpesvirus 5) nueleoe apsid leg U ment genome membrane ií>J*--------glycoprotein complex I glycoprotein complex III V posledních 30 letech byla objevena řada genů odpovědných za vývoj nádorů. Na porozumění maligní transformaci má zásluhu zejména široká škála dřívějších prací s onkogenními virusy. Copyright 1»4 - "97 Afcorkofteschke První tzv. ONKOGEN s r c (sarcoma) byl izolován v roce 1970 z viru Rousova sarkomu u kuřat. Virus Rousova sarkomu má dvě rozdílné části: část kódující proteiny odpovědné za replikaci viru a část kódující s r c gen umoňující vznik nádorů in vivo u kuřat. Normální kuřecí genom obsahuje příbuzný gen c-src. Později se ukázalo, že řada retro virů je onkogenních. Bylo též prokázáno, že src není jednoznačně retro virový gen, ale spíše téměř přesná kopie genu nalezeného ve všech kuřecích buňkách. Tento normální gen, tzv. proto-onkogen je v retro viru modifikován (aktivován) tak, že působí po přenesení do buněk nádor. Objev s onkogeny příbuzných sekvencí v eukaryotickém genomu stimuloval úsilí transformovat normální buňky DNA stejným způsobem jaký užívají retro virusy. Mnoho protoonkogenů kóduje proteiny mající vztah k růstově stimulačním signálům přecházejících z vnějšího prostředí do nitra buňky. Růst buňky je deregulovaný, jestliže mutace v protoonkogenů způsobící trvalou aktivaci růstově stimulační dráhy. Toto souvisí se signály, které si navzájem předávají buňky v tkáních. Jedny buňky uvolňují růstové faktory, proteiny (glyko), které se pohybují mezi buňkami a po vazbě na vhodný receptor na povrchu jiných buněk vyvolávají kaskádu dějů, které přenáší tento signál přes cytoplasmu až do jádra. V jádře pak proteiny nazývané transkripční faktory odpovídají tím, že aktivují řadu genů, které pomáhají buňce procházet buněčným cyklem. Podobně funguje i přenos růstově inhibičního signálu. V normální buňce je rovnováha stimulačních a inhibicních signálů pečlivě regulována, protože to souvisí s regulací buněčného cyklu, který je rozhodující pro buněčnou proliferaci a diferenciaci. V nádorové buňce je v důsledku změn v signálních drahách organizace buněčného cyklu narušena. Buňka je vybavena také zpetnovazebnými mechanismy, které mohou působit proti neobvyklým změnám v procesu bun. dělení. Apoptóza - schopnost buňky spáchat za určitých podmínek „sebevraždu", tj. jestliže její základní komponenty jsou porušeny nebo jestliže je její kontrolní systém deregulován. Tak působí např. poškození chromozomální DNA. V tomto procesu se účastní také specifické geny např. p53 nebo bcl-2. Mutace těchto genů pak způsobují poruchy apoptózy. Bylo zjištěno, že neschopnost apoptózy přispívá ke vzniku nádorů a k jejich rezistenci k terapii. Druhým obranným mechanismem proti neustálé proliferaci je vestavěný buněčný mechanismus, který sčítá a limituje celkový počet dělení buňky, buňka stárne a hyne. Molekulárním nástrojem tohoto sčítaní jsou segmenty DNA na koncích chromosomů tzv. telomery. Ty se při každém dělení zkracují a když dosáhnou kritické délky dochází k stárnutí a krizi. Jestliže tento sčítací systém funguje v nádorové buňce řádně, její nadměrná proliferace je přerušena předtím, než je nádor příliš velký. Aktivací genu, který kóduje enzym telomerázu, který není v normálních buňkách, ale byl nalezen v nádorových buňkách, však dochází k obnově telomerických segmentů a to umožňuje buňce se nekonečně množit, tj. stát se nesmrtelnou. í 1 ' f - GGGTTAGGGTTAG -GGGTTAGGGTTAG c-"*""^ Většinou trvá desítky let než se v prekarcinogenní populaci nasbírá dostatek mutací k malignímu růstu. U některý ch j edinců j e však tato doba silně zkrácena. To je vysvětlováno dědičností některých genů způsobujících rakovinu. Jestliže rodičovská zárodečná buňka obsahuje mutaci tak u potomka je tato mutace přítomna ve všech buňkách těla a pravděpodobnost vzniku nádoru je vysoká. Protoonkogeny lze dělit ^ Podle lokalizace jejich produktu na ty, které kódují 1) sekreění proteiny 2) proteiny buněčného povrchu 3) cytoplasmatické proteiny 4) jaderné proteiny ^ Podle funkce jej ich produktů na 1) růstové faktory (např. sis, hst), 2) receptory pro růst. faktory (např. fms, kit, erb B), 3) cytoplasmatické proteiny - protein kinázy (např. raf) a G-proteiny (např. ras), 4) jaderné proteiny (např. myc, myb, fos, jun) Jaderné protoonkogeny jako jsou c-myc, c-fos, c-jun, c-myb - tzv. geny rané odpovědi (immediate early genes) a jejich produkty jsou proteiny vážící se na DNA a fungující jako tzv. transkripční faktory, které regulují transkripci pozdních genů. Jsou většinou aktivovány overexpresí, která může být indukována různými způsoby: translokací (Burkitt lymphoma), insercí retroviru (spíše v experimentálních systémech), amplifikace genů - to je obecný mechanismus aktivace jader, protoonkogenů a byla pozorována u řady nádorů. RŮSTOVÉ FAKTORY - EGF, TGFct, TGFß, IGF RECEPTORY PRO RŮSTOVÉ FAKTORY - EGF-R -NEU - PDGF-R Přenos signálů a růstová regulace v eukaryotických buňkách. Jsou znázorněny reprezentativní protoonkogeneny v signálních dráhách. ONKOGENY a ANTI-ONKOGENY Externí signály Přenos externích signálů Růstové faktory Transmembránové receptory Tyrosinové kinázy GTP-vazebné proteiny Jaderné děje Serine -treoninové kinázy Replikace DNA METABOLICKÁ ODPOVĚĎ Onkogeny a anti-onkogeny: hlavní funkční skupiny onkogenních proteinů a jejich pravděpodobná vnitrobuněčná lokalizace. Anti-onkogeny jsou označeny větším písmem. Mutace protoonkogenu vedoucí k transformaci můžeme funkčně rozdělit do dvou tříd: získání funkce (gain-of-function), kde aktivita protoonkogenu vzrůstá a má za následek abnormální nebo nadměrmou růstovou stimulaci ztráta funkce (loss-of-function), která vede k inaktivaci represorové složky, která normálně negativně ovlivňuje buněčnou proliferaci (nádorově supresorové geny - p53, RB, geny pro antiproliferační molekuly -TGF ß, TNFa, interferon y) V obou případech je výsledkem nadměrná stimulace růstu. Geny kritické pro vývoj nádorů spadají do dvou jasně rozlišitelných kategorií: dominantní a recesivní (A) overactivity mutation (gain of function) single mutation event creates oncogene normal cell activating mutation enables oncogene to stimulate cell proliferation ceElsthat proliferate abnormally (B) underactivity mutation (loss of function) second mutation event normal cell inactivates tumor suppressor mutation event inactivates second gene no effect of coPV gene mutation in one gene copy two inactivating mutations functionally eliminate the tumor suppressor gene, Stimulating cell proliferation Figure 23-24. Molecular Biofogy of the Cell, 4th Edition. Autokri A SINGLE SIGNALING CELL RECEIVES A WEAK AUTOCRINE SIGNAL Figure 15-6. Molecular Biology of the ní signál IN A GROUP OF IDENTICAL SIGNALING CELLS, EACH CELL RECEIVES A STRONG AUTOCRINE SIGNAL II, 4th Edition. Při buněčné transformaci a karcinogenezi se uplatňují autokrinní mechanismy (vznik autokrinní smyčky) - neplánovaná produkce růstových faktorů buňkami nesoucími odpovídající receptory nebo aberantní exprese receptoru. Tři způsoby aktivace a změny protoonkogenu v onkogen proto-oncogene DELETION OR POINT MUTATION IN CODING SEQUENCE DNA- RNA I T hyperactive protein made in normal amounts normal protein greatly overproduced CHROMOSOME REARRANGEMENT or i nearby regulatory DNA sequence causes normal protein to be overproduced i l=H I___■ DNA RNA fusion to actively transcribed gene greatly overproduces fusion protein; or fusion protein is hyperactive Figure 23-27. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Šest způsobů ztráty zbývající dobré kopie nádorově supresorového genu HEALTHY CELL WITH ONLY 1 NORMAL Rb GENE COPY n n normal Rb gene _in paternal chromosome mutation at Rb locus ^^ in maternal chromosome POSSIBLE WAYS OF ELIMINATING NORMAL Rb GENE o nn n nn fin O v/^ v_> n IX nondisjunction nondisjunction mitotic gene deletion point (chromosome and recombination conversion mutation loss) duplication Figure 23-29. Molecular Biology of the Cell, 4tti Edition. Spektrum účinků p53 v modulaci přežívání a frekvence změn genu p53 u lidských nádorů Fig. 1 The spectrum of surviv- p21: promotes growth arrest CD95 (?) al -modulation effects of p53 bct-x: blocks apoptosis Cyclin G (?) gadd-45: DNA repair (?) + \ i v i MDM-2 Survival Lung Colon Esophagus Ovary Pancreas Skin Stomach Head and neck Bladder Sarcoma Prostate Liver Brain Breast Kidney Blood Melanoma Cervix Testis p21; promotes growth arrest bax: promotes apoptosis IGF-BP3: inhibition of IGF signalling bci-2: blocks apoptosis MOR; increases drug resistance Death 10 20 30 40 Frequency of p53 alterations (%) 50 60 Vztahy mezi genetickými a fenotypovými změnami u nádorů Gentic alterations Phenotypic alterations Oncogene Tumor suppressor gene Proliferation Differentiation Apoptosls Response to genetic damage Invasion Metastasis Onkogeny a nádorově supresorove geny mají funkce v regulaci proliferace, diferenciace, apoptozy a odpovědi na genetické poškození. Jejich úloha v invazi a vzniku metastáz je však nejasná. ©NORMÁLNÍ, KONTROLOVANÝ RŮST © Z . _ _í ___.o. g A ABNORMÁLNI RUST, ale stále ještě nějak kontrolovaný Nefunkční mezibuněčná NEKONTROLOVANÝ RUST komunikace NEKONTROLOVANÝ RUST Poznatky o molekulárně genetické podstatě nádorového onemocnění lze shrnout takto: ► primární pro vznik nádoru jsou změny vyvolané jak genetickými (mutace v DNA) tak negenetickými příčinami (ovlivnění exprese genů) ► karcinogeneze je několikastupňový proces založený na poruše genetické homeostázy a pouze dílčí změna v kterémkoliv článku ke vzniku nádoru nevede ► ke vzniku nádoru může vést jen kombinace poruchy několika různých mechanismů, přičemž cesty, kterými se tak děje mohou být velmi rozdílné ► byly nalezeny velké individuální a mezidruhové rozdíly i tkáňová a orgánová specifita ve spojitosti se vznikem nádorů ► na vzniku nádoru se mohou významně podílet látky z vnějšího prostředí ZMĚNY METYLACE DNA A ACETYLACE HISTONŮ NÁDOROVÁ EPIGENETIKA EPIGENEIKA - dědičné změny v genové expresi beze změn v sekvenci DNA Epigenetické změny hrají významnou úlohu v karcinogenezi. Savčí buňky mají schopnost epigeneticky modifikovat svůj genom prostřednictvím ► METYLACE DNA, tj. kovalentního přidávání metylových skupin do 5 pozice na cytosinovém kruhu v CpG dinukleotidu s účastí enzymu metyltranferázy. Přibližně 70% CpG zbytků v savčím genomu je metylováno, distribuce je nerovnoměrná, většina genomu je chudá na CpG. Metylace DNA hraje zásadní úlohu v normálním vývoji, v inaktivaci chromozómu X a supresi tzv. parazitických sekvencí DNA. Umožňuje „zapínat a vypínat" geny na správném místě a ve správné době. Aberantní metylace DNA v promotorové oblasti je však také klíčovým mechanismem inaktivace nádorově supresorových genů. Může způsobit zvýšení mutací a dědičně tlumí geny, jejichž promotory jsou asociovány s tzv. CpG „islands" a které kontrolují buněčnou proliferaci. Zatím neznámé mechanizmy zabraňují de novo metylaci těchto promotorů u normálních buněk. Důkazy spojitosti mezi metylaci DNA a genovou expresí s využitím inhibitoru metylace - 5- azacytidinu (5-AZA)- mnoho genů může být reaktivováno. Hypo- nebo hypermetylace DNA (obsah 5-metylcytosinu) patří mezi negenotoxické mechanismy karcinogeneze. Metylaění struktura v nádorových buňkách se liší od normálních buněk. Globální hypometylace genomu je doprovázena místně specifickou hypermetalací. Hypermetylace promotorů pro nádorově supresorové geny v CpG islands je doprovázena jejich utlumením a růstovou výhodou pro tyto buňky. Hypometylace DNA je spojena se zvýšenou genovou expresí. Metylace DNA může též usnadňovat mutagenezi (5MeC může spontánně deaminovat na tymin - hypermutabilita). ► ACETYLACE HISTONŮ Genová exprese je regulována i strukturou chromatinu. Chromatin obsahující hypoacetylované lysiny v histonech má kompaktní strukturu represivní pro transkripci. Inhibitory histonových deacetyláz (HDAC) mohou vytvářet otevřené struktury chromatinu a aktivovat určité geny inhibující nádorový růst využití v terapii (butyrát, trichostatin). Existuje „crosstalk" mezi metylací DNA a acetylací histonů při tlumení (silencing) genové exprese. 5 AZA a HD AC inhibitory v kombinaci způsobují reaktivaci nádorově supresorových genů Unmethylated CpG Island Activators» Histone Acetyltransferases, Basal Transcriptional Machinery Protect the Island f---------------- ----------------A um 00000 0 0 1 1 1 M RNA Transcription Hypermethyíated CpG Island Transcriptional Repressors, Histone Descetylases, DNA Methyltransfenises and Methyl-binding Proteins Shut-Down the Island ,—a—, Spreading from MethylatJon Centers, Seeding of Methylation, Selective Advantage v um 0 a i *\ t Transcription is Abolished í Figure 1 The typical CpG island oľ a tumor suppressor gene is represented in a normal and a tumor cell. The presence of a dense hvpermethylation changes completely its molecular environment. White dots, unmethylated CpGs; Black dots, methylated CpGs Utlumení genové exprese aberantní metylací DNA a modifikací histonů CH3 DNA methylation histone deacetylation H-3 Lys-9 methylation CH3 ch3 DNA demethylation histone acetylation H-3 Lys-4 methylation CH3Ac Nukleosomy v promotorové oblasti. Proteiny vážící se k 5MeC (MeCP2) se váží k metylovaným CpG místům a způsobují tlumení genové exprese histon deacetylázou (HDAC). Přítomnost tohoto komplexu, deacetylace lysinu v histonech a metylace histon-3 lysin-9 histon metyltransferázou přeměňuje nukleosom v kompaktní konfiguraci, která zabraňuje vazbě transkripčních faktorů. Demetylace a deacetylace způsobuje pak zase uvolnění inhibičního proteinového komplexu a tvorbu otevřené struktury nukleosomu, která umožňuje transkripci. A Percentage of CpG Island Hypermethylation in Human Cancer According to the Tumor Type m c=i lana 2 3 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 1 .Lymphoma 2.Esophagus 3.Stomach 4.Colon S.Pancrens ^Leukemia 7. L1 tenis S. Liver íUIeml & Neck lO.Glionia 11. Kidney 12. Breast 13. Lung 14.0vary lS.BIadder 30 25 20 15 10 5 0 Percentage of CpG Island Hypermethylation in Human Cancers According to the Tumor Suppressor Gene U Hi u L_y i_j* r o 10 1. pi©'"1"" 2. pl5INK4b 3. DAPK 4.UM1 HI 5. MGMT 6. APC 7. GSTPI 8.p73 9. pM*** 10. BRCA1 Figure 3 (* and b) are alternative ways to present our CpG island hypermethylation profile of human cancer (Esteller et a!., 2O01a), (a) an average value of the frequency of hypermethylation of II tumor suppressor (jenes (pl6 ]>JK4a p 14 Alii-- p!5 INK* M G MT. liMLHI. BRCAL GSTPI. DAPK., CDHl. p73 and APC) is shown according to the most common types of human tumors, (b) the other side of the coin: the frequency of CpG island hypermethylation of ten particular tumor suppressor genes in the tumor types described in a. In the cases of pl5J K4b and hMLHI an overestimate n exists due to (he high number of Leukemias and micro-satellite unstable tumors included, respectively Table 1 Hallmarks of cancer and different types of genes silenced by aberrant DNA methylation Hallmark" (acquired capability} G aw silenced by DNA methylation Gene junction References Insensitivity to antigrowth signals pl6CDKN2A RAR/Í Sigma 14-3-3 Cyclin-kinase inhibitor induce differentiation cell cycle arrest Herman et ai. (1995) Cote et á (1998) Umbricht et ai. (2001) Self-sufficiency in growth signals RASSFIA Regulation Ras pathway Dammann et ai. (2000) Evading apoptosis Capase-8 Initiate apoptosis Teitzť/u/, (2000) TMS! Proapoptosis Stimson and Vertino (2002) DAP-kinase Proapoptosis Kissilť/u/,(l997) pl4ARF Proapoptosis Robertson and Jones (1998) Limitless replicative potential Rb Tumor suppressor gene Ohtani-Fujita et ai. (1993) Sustained angiogenesis Thrombospondin-I VHL Angiogenesis inhibitor stimulate angiogenesis Li et d (1999) Herman et ai. (1994) Increased invasion And metastasis E-cadherin Suppress metastasis GfÄff et ai. (1995) TIMP3 Inhibit metastasis Bachmanť/u/, (1999) Genome instability hMLHI DNA missmatch repair Esteller (2000) (enabling characteristic) MGMT Repair alkylated guanine Qian and Brent (1997) BRCAI Repair DNA damage Bianco et ai. (2000) DAP-kinase death-associated protein kinase; MGMT, Ormethylguanine DNA methyltransferase; URji, retinoie acid receptor-/ß; Kb, retinoblastoma; TIMP3. tissue inhibitor of metalloproteinase-3; VHL von Hippel Lindau tumor suppressor gene , The table is illustrative, but not comprehensive, For a list of many cancer-related genes silenced by aberrant methylation. see Tsou ct ai ... 2002, 'anahan and Weinberg (2000), IMORTALIZACE BUNĚK Imortalizace zahrnuje inaktivaci specifických nádorově supresorových genů jako jsou RB a p53, které se účastní regulace přechodu Gl-S fáze buněčného cyklu a indukce apoptózy i dalších genů spojených s buněčným cyklem a apoptózou. Kromě toho existuje v buňkách mechanismus - buněčné hodiny - odpočítávající počet dělení a regulující stárnutí buňky. Normální somatická buňka má omezený počet dělení, tj. limitovanou schopnost proliferovat a nastává ireverzibilní zástava růstu tzv. replikativní stárnutí (senescence). TELOMERY -jsou vysoce konzervované nukleoproteinové komplexy přítomné na koncích chromozómů a obsahují tandemové opakující se sekvence DNA bohaté na guanin (TTAGGG) obalené specifickými na DNA se vázajícími proteiny. Telomery tvoří protektivní čepičku kolem genomové DNA a zabraňují chromozomálním ztrátám a aberantním fúzím během mitotického cyklu. Telomery se zkracují s dalšími buněčnými děleními, což může způsobit genovou nestabilitu a změněnou genovou expresi. Buňky procházejí krizovým stadiem (Hayflickův limit) nebo umírají. Zkracování telomer vybudí proliferativní stárnutí přes aktivaci pRB a p53 kontrolních bodů, což vede u p53-wild typů k zástavě proliferace. Dochází k bariéře v proliferaci charakterizované dysfunkcí telomer, extrémní genomovou nestabilitou a rozsáhlou smrtí buněk mechanismy závislými i nezávislými na p53. Délka telomer koreluje s buněčným stárnutím, ale neexistují žádné důkazy pro jasnou korelaci na organismální úrovni a korelace s délkou života člověka či jiných druhů. Heterogenita průměrné délky telomer odráží genetické rozdíly a komplexní rovnováhu mezi procesy, které vedou k degradaci a těmi, které prodlužují telomery. Např. buňky se sebeobnovnou kapacitou mají delší telomery než diferencované, nebo telomery lab. myší jsou delší než u člověka. Telomery jsou kratší u lidských somatických tkání ze starších lidí než u mladších jedinců nebo u zárodečných buněk. Děti s genetickými nemocemi projevujícími se rychlým stárnutím tzv. progerickým syndromem (Down, Werner, At. telangiectasia) umírají v raném věku s tělem 90ti letých a jejich telomery jsou drasticky zkráceny. Imortalizované buňky vznikající z krizového stadia (inaktivací p53 a pRB, overexpresí cMyc a Ras a v důsledku vážné genové nestability) obnovují funkci telomer aktivací telomerázy, alternativním telomery udržujícím mechanismem (ALT) nebo jiným adaptivním mechanismem. Ve skutečnosti mají nádorové buňky kratší telomery než jejich odpovídající normální buněčné typy. Tyto telomery se dále zkracují během progrese nádoru a u myších exp. modelů, jsou zkrácené telomery spojeny se zvýšenou genetickou nestabilitou a zvýšenou nebo redukovanou spontánní malignitou v závislosti na genetickém kontextu. Mnoho faktorů (genetických, nutričních, hormonálních, environmentálních, farmakologických) může modulovat udržování telomer a potenciál buněčného života. ______ ___ r ___ TELOMERÁZA. Telomery nejsou udržovány normálním replikačním procesem. U kmenových, nádorových a imortalizovaných buněk, je zkracování telomer zastaveno aktivací telomerázy -reverzní transkriptázy, která rozšiřuje telomerické TTAGGG opakované sekvence. 3 hlavní složky: s telomerázou spojený protein, TLP1, telomerázovou RNA -hTR a telomerázovou katalytickou jednotku TP2 - lidská telomerázová reverzní transkriptáza. Telomeráza používá svou RNA k navázání na telomery, zatímco katalytická proteinová jednotka syntetizuje DNA přímo na koncích chromozómů reverzní transkripcí templátu RNA. Telomeráza je vysoce exprimována ve většině nádorů a kmenových buněk, středně v hyperplastických a metaplastických buňkách a velmi nízká nebo žádá v normálních dif. tkáních a postupně se snižuje s věkem. Její exprese je spojena s vysokým proliferačním indexem a obnovným tkáňovým potenciálem, agresivitou nádorů, vysokým histopatologickým gradem a s proliferací cévního endotelu. Telomerázová aktivace a overexprese je často nezbytným a raným dějem v mnohastupňové karcinogenezi: vzrůstá rychle při chemické karcinogenezi a po zkrácení telomer. Telomeráza není ani onkogen ani nádorově supresorový gen, ale regulována nahoru nebo dolů mnoha faktory a stává se důležitým predisponujícím dějem u karcinogeneze nebo cílené nádorové terapie. Homeostáza systému telomery - telomeráza je komplexní a je svázána s genetickými a environmentálními faktory. Řada faktorů snižuje ( 0 diferenciační činidla, epigallocatechin gallate (z čaje), antineoplastické látky -cisplatina, doxorubicin, protein fosfatáza 2, MAPK, tamoxifen, androgeny, volné radikály, inhibitory reverz, tarnskriptázy) a řada zvyšuje (T chemické karcinogény, mutace telomerických sekvencí, gamma záření, PKC, EGF, estrogeny) telomerázovou aktivitu. Vztahy mezi telomerázovou aktivitou a nádorovým onemocněním jsou složité a jen částečně objasněné. Telomeráza může paradoxně buď podporovat nebo inhibovat tvorbu nádorů v závislosti na genetickém kontextu. U nádorových buněk jsou telomery kratší a telomerázová aktivita obvykle následuje po zkracování telomer. Ztráta funkce telomer při raném dělení zahajuje genetickou nestabilitu, zatímco v pozdějším bodě progrese nádoru absence telomerázy inhibuje růst. Tak zatímco inhibice telomerázy u ustanovených nádorů může být cenným terapeutickým přístupem, na věku závislé zkracování telomer může být rizikovým faktorem pro nádory tím, že umožňuje obejít kontrolní bod mortality. Systém telomery-telomeráza představuje komplexní skupinu molekul interagujícíh navzájem a modulujících věk buněk, genetickou stabilitu a nádorovou transformaci. Vnější zásahy mohou modulovat žití zvyšováním nebo snižováním délky života, ale s tímto přístupem jsou spojeny také odpovídající problémy. Udržování telomer by mohlo být důležité pro prodloužení života, ale vzhledem ke složitosti fyziologických mechanismů na buněčné a zejména organismální úrovni, nelze tento problém zjednodušovat. Z onkologického hlediska, může overexprese telomerázy zvyšovat riziko vzniku nádorů. Ačkoliv normální buňky s delší dobou života a udržovanými telomerami se nejeví jako neoplastické, zpoždění fyziologické smrti může zvyšovat pravděpodobnost kontaktu s karcinogény. Telomeráza sama také zvyšuje onkogenní potenciál predisponovaných buněk a je cílem protinádorových terapií. Zatím se pozornost soustřeďuje na zvýšení doby života několika cílových buněk nebo snížení proliferujícíh nádorových buněk. Málo pozornosti je věnováno organismální úrovni, mikro- a makroprostředí, ve kterém tyto buňky rostou jako normální nebo imortalizované nádorové buňky: tj. angiogenezi, růstovým a difernciačním faktorům, cytokinům, hormonům, imunitnímu systému a environmentálním faktorům. ? ? ? ? ? Zbývá odpovědět na otázky: Je bezpečné prodlužovat lidský život použitím terapeutických látek? Je lepší prodlužovat lidský život nebo zlepšovat kvalitu života? Stadium terminálni proliferační zástavy (TPA) if, a: c c Q c o Q. C a. immortalization y crisis p53-min js TPA senescence Time in Culture Normal cells divide a limited number of times before permanently exiting the cell cycle and remaining in a viable non-proliferative state referred to as senescence (1). If p53 is inactivated in these cells, the cells may resume dividing a limited number of times, before they permanently exit the cell cycle (p53-minus TPA) (38,39). If p53 and the pRb/pl6INK4a pathway are both disrupted, for example, by the presence of SV40 or HPV viral oncoproteins, the cells may bypass senescence but subsequently arrest in a state referred to as crisis (44). A rare cell (~1 in 107) may escape from crisis and become immortalized. Transduction of some normal cells with hTERT expression constructs may result in expression of telomerase and bypass of senescence. Zkracování telomer může vést k chromosomální nestabilitě a vzniku nádoru SELF-RENEWAL OF EPITHELIAL CELL POPULATION BY REPEATED CELL DIVISION -----------------telomeres shorten and uncap r normal p53 and cell cycle checkpoint control l loss of p53 and cell cycle checkpoint control i * normal senescent cells mutant cell survives and proliferates stop dividing | chromosome fusion CHROMOSOME / ^ BREAKAGE- chromosome FUSION-BRIDGE translocation CYCLE . chromosome breakage chromosome bridge cell dies dueto catastrophic genomic *" instability and DNA damage I massive chromosomal damage I telomerase reactivated I chromosomes are partially stabilized and cell survives with many mutations CANCER Figure 23-36. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Rozšiřování na guanin (G) bohatých telomerových vláken telomerázou GGGTTAG GGGTTAGGGTTAG 51 GGGTTAGGGTTAG p The telomerase holoenzyme contains protein subunits including a catalytic subunit with reverse transcriptase activity and an RNA molecule that acts as the template for addition of TTAGGG repeats to telomeres. Imortalizace je nutná,ale ne dostačující pro maligní transformaci Normal cells SV4íMransduoed mgrfral celte SV4ü-invnürtaliieQ' cells raa no iransfofmanon r.1.:^ ^ rrt& iL No transformation Malynant transformation B Normal cells ras MEK immortalized cells ras -^---------*MEK ^ Premalure senescence Malignant, transformation A) In a number of in vitro models it has been shown that oncogenes, such as activated ras, can cause malignant transformation of immortalized cells but not their normal mortal counterparts. In the example illustrated, activated ras caused malignant transformation of SV40-immortalized fibroblasts, but not normal fibroblasts nor SV40-transduced fibroblasts that had not become immortalized (67). (B) Mouse fibroblasts transduced with activated ras obtain a constitutively active MEK signaling pathway. In immortalized cells this may result in malignant transformation, but in normal cells this results in upregulation of p53 and p16INK4a and premature senescence (74). Adenovirová terapie využívající promotoru pro telomerazu normal cell viral agent hTERT adenovirus \ telomerase viral replication blocked cancer cell telomerase+ viral replication vr U * • cell destruction viral release ?, virus spread Inhibitory telomerázy a konvenční terapie telomerase inhibitor alone a*ä_ tumor size • telomere . «MB «MS SMI IBHiO length (kbp) 7 6 5 4 conventional therapies alone tumor size telomere 4F <8 9 4ff :MHHHi iiMHi ■■■■ iBHi length (kbp) 7 7 7 7 conventional therapies + telomerase inhibitor tumor size apopiocic 9$ <8 8ř íř telomere II—I «T I JBMHJ WHO length (kbp) 7 5 3 2 > time of treatment