INVAZIVITA - VZNIK METASTÁZ Metastázy - tvorba progresivně rostoucích sekundárních nádorových fokusů v místech nespojených s primárním nádorem. Série definovaných kroků - metastatická kaskáda: ► uvolnění buňky (od okolních buněk, ECM) ► překonání bazálni membrány v epitelech (metalloproteinázy) ► překonání bazálni membrány a endotelu cév ► přenos krevním (lymfatickým) řečištěm ► překonání endotelu, bazálnich membrán v jiné lokalitě ► uchycení v nové tkáni (hyaluronan a jeho receptory - CD44, integriny) ► přežívání, proliferace ► vznik mikro- a makrometastáz - letalita onemocnění Existuje řada genů a proteinů, které regulují metastatickou schopnost buněk a které musí být koordinovaně exprimovány. Ztráta funkce tzv. supresorových genů pro metastázy, které zabraňují tvorbě spontánních, makroskopických metastáz, aniž by ovlivňovaly růst primárního nádoru (prvním z objevených genů je nm23). Význam dostupnosti cév, angiogeneze - tvorba cév v nádoru Struktura metastáz MELANOMA OFTEN SPREADS TO LUNGS PATTERNS OF METASTASIS can be explained in part by the architecture of the circulatory system. Tumors in the skin and many other tissues often colonize the lungs first because the lungs contain the first capillary bed "downstream" of most organs. In contrast, because the intestines send their blood to the liver first, the liver is often the primary site of metastasis for colorectal cancers. Yet circulation is not the only factor: prostate cancer, for example, usually metastasizes to the bones. This tendency may result from an affinity between receptors on prostate tumor cells and molecules in bone tissues (inset). COLORECTAL CANCER OFTEN SPREADS TO LIVER PROSTATE CANCER OFTEN SPREADS TO BONES PROSTATE CANCER CELL RECEPTOR ADHESION MOLECULE STROMAL CELL 2 OF BONE y Benigní versus maligní nádory \ neoplastic gland tubules normal gland tubules (cross-section) fibrous connective-tissue capsule of benign tumor ADENOMA (BENIGN) normal gland tubules invasive, cancerous gland tubules ADENOCARCINOMA (MALIGNANT) Figure 23-3. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Proces vzniku metastáz cells grow as a benign tumor in epithelium break through basal lamina invade capillary connective tissue basal lamina SJ^^travel through bloodstream (less than 1 in 1000 cells will survive to form metastases) adhere to blood vessel escape from blood vessel proliferate to form wall in liver (extravasation) metastasis in liver Figure 23-15. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Metody výzkumu Metodickým základem současného výzkumu je úspěšné klonování předpokládaných metastatických genů a manipulace s jejich expresí nebo funkcí genových produktů. 3 nejobecněji používané testy metastatického procesu. 1) test na spontánní metastázy - nádorové buňky jsou subkutánně injikovány do syngenních nebo imunodeficientních zvířat. Test napodobuje přirozenou situaci. 2) test na experimentální metastázy - nádorové buňky jsou injikovány intravenózne. Test odhaduje schopnost buněk opustit krevní řečiště a kolonizovat specifické tkáně. 3) test invazivity - nádorové buňky jsou umístěny na povrch matrix (tvořené např z kuřecí srdeční nebo chorioalantoidní membrány či umělé membrány) a sleduje se migrace tímto materiálem. Poznatky o povrchových a intracelulárních regulačních molekulách účastnících se metastatického procesu jsou vodítkem pro nové terapeutické přístupy - využití specifických monoklonálních protilátek nebo antisense techniky. Význam buněčné adheze Pro vznik metastáz jsou důležité zejména změny v buněčné adhezi a komunikaci Buňky se pro předání signálu musí dotýkat - "juxtacrine signaling" Kontakt buňka-buňka - kadheriny (E-kadherin) na povrchu jsou propojeny přes katenin, vinkulin, plakoglobin s cyto skeletonem - geny kódující tyto proteiny označeny jako supresorové geny pro metastázy Kontakt buňka - extracelulární matrix - integriny Anchorage dependence - závislost na podkladu Area code - specifická oblast bazálni membrány „Junctional" a „nonjunctional" adhezivni mechanizmy živočišných buněk pro vzájemnou vazbu a pro vazbu k extracelulární matrix nnnnnnn intermediate filaments adhesion belt J (Cadherins) ]desmosome (Cadherins) "I gap junction J (connexins) lg-likeCAMs-«Jl integrins4*»f selectins TL hemidesmosome focal adhesion (iritegrins) (integrins) y X r^p; /'xnucleus ľK ('"V") 1............ \ ■áäMg gmwMM! ir f-------K-t^yt'At I S^^GÍUJ üü 1- ,*■*—■- ..r^. Sk IL Exr^';;•' &asal lamina •: .^^^t^^^^KS^^-': __ľľ^ÄPflpŕ^ÄívIT'/ \\ l-w~-- ■■ "H collagen \ $£&*■■' ftbronecíin :ÍV ;* . .■ ■-. ........................ cytoskeletai <#ttpanentš integrins stroma ■' Adheze buněk CELLULAR ADHESION lil:;,: :''-',r./' il,;.r-: ■ v. ■ ■ ,; ■ ■ . ... .... ... ' . ■.:■■' -..:•. : Jll^*0*^ EXTRACELLULAR MATRIX \ CELL-CELL ADHESION MOLECULES RECEPTOR FOR EXTRACELLULAR MATRIX IMPORTANCE OF CELL-CELL ADHESION INVASIVE CELL IMPORTANCE OF ADHESION TO EXTRACELLULAR MATRIX DETACHED CELL !#-■ ''■:& ;# DEAD CELL CELL ATTACHED TO INAPPROPRIATE EXTRACELLULAR MATRIX Carcinoma in situ turnen ciliated epithelial cell ■■§: ', í"-^-!^,;^ : : .• .-. llllfll Ä;: WĚĚÉmĚÍ0- N- ^r í ;1(Bfe] *M Ipas.: ■R*—- \... ^;jp| :Í':":;":;'ŕV. jjl É |||| ÉÉšÉÉ":-:: :- Í Él 1 lH ^ lpi í 1 ÉÉ iSií'jVíií &HHÍ&. -ť: Ü Mlit.: rtiucus^ ■..-■■.-r ■H .ÍÉil 'irffe ■,.".....-■"--." i"..;>\. m m Pi - i m im - ■ ■■■: J« /: MÜ 1 «stasia ■Äá^sÄ» JU Ufir*», MĚ" stroma u tut» tí a« -:■■ ■aelil Malignita - buňky pronikají přes bazál ní laminu non-dividing ,. ... '■ i.imor, n ■"-■ dlVldinO lumen cancer cel) y., ■'A- ■ cancer celí íäa - :' -■■■■ ■■■■'■ :-rf^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^H AAí: V'A^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^B illlliilliliiliiililiiiislllíii / A >; ^.-'^äfŕ-' .; y A ^Ii .,-. • ~T^::/:-:|É i N ľ^:^#K. '^£::$Pv'' -L ~~Z.---^>< _'_A—'-—.... J "■— ¥Ě"'•■;. / / A<-M,. /^^ !/"!§ V:-:' A"'' . >_'"'^sí« -a: ^aa:--'":-asA>:" -'■■ 'Mďfi i ' .-' '•-•-' ^,i.:-. --/"Msgí v 4M / r #?«i ■ •• ■ .; ;:<-v-«* ■, v ■" . tjiiíetjs-. ' :#ir*í ■: -<%?#>'■-.■■■■ .-' - "* HHHNHHHHHHHHHHHHI *%, "'Y % A-" V'"'r^- ! 47A x 'A ; <%pg: :; JÉ$|tol■'•■'. -S5"é- í > l i< AAA basal lamma .....- ,._......_.; .- , ,< -.__.,..--. ,.^| aa Jpgř ,J._-......._•' ä ///i ; ,, ■ W f , ■ v -: .-■ invasion; :i|š ' ' ■ ...íl ---■'-; -ig! -J (-.■-' -M l - :■• , . . j ■ ' ' '-- V:0 Invaze do krevních a lymfatických cév - počátek metastáz »«Hb**1 "-k......____MM m. WIĚĚmmm t Ét« ^«■:>3B H MMU Im,.........di m^ i ■ wm b1o< lies líum a?i : iiiiii a: i amir a Adheze nádorových buněk na cévní stěny ve vzdálených orgánech mřóm ? Metastatická nádorová buňka se dělí a tvoří sekundární nádor «SIS SU MUCINY Velké glykosylované proteiny syntetizované buňkami gastrointestinálního, dýchacího a močopohlavního ústrojí. Chrání epiel proti mechanickému, chemickému, enzymatickému a mikrobiálnímu poškození. Kódovány řadou genů, tkáňově specifické Hlavní mucin sekretovaný gobletovými buňkami ve střevě - MUC2. Poruchy povrchových mucinů jsou obecnou charakteristikou maligní transformace. Jsou odpovědné za abnormální chování buněk: změny adheze nebo metastázování a uniknutí z imunologického dozoru. Red blood cell Figure 4 | Tumours use mucins for invasion, metastasis and protection, a | Tumours use the anti-adhesive ettect ot mucins to detach from the tumour mass and surrounding stroma and invade (see FIG. 5). b | Tumours use the adhesive eftect of mucins to attach to endothelia and invade (see FIG. 6). c | Tumours also use mucins to escape immune surveillance fsee FIG. 7). Apical expression of mucins Turnorigenesis Cis interactions r\ J Receptor/liganci tor cell-cell adhesion IX, Vj ^^ (r% As ħX Evidences for Intercellular communication Involvement Proposed biological events associated with altered intercellular communication V v VbN/ VoVnV x Inhibition of GJC by tumor-promoting stimuli Stimulation of GJC by antitumor promoting agents Cell growth Genetic instability Tumor growth suppression by con-nexin transfection Deletion of CAM genes Decreased connexin expression/ function Clonal expansion Genetic instability Aberrant gene expression Suppression by CAM gene transfection • Invasion behavior Metastasis Figure 1. Hypothetical view of the role of intercellular adhesion and communication in multistage carcinogenesis. GJC, gap-junctional communication; CAM, celi-adhesion molecule. „Docking" Transition „Locking" TC * slabé a přechodné vazby * zprostředkované zejména rozpoznáním uhlovodík -uhlovodík [____ * Aktivace nádorovách a hostitelských buněk * (platelety, leukocyty, endoteliální buňky atd.) * tvorba zánětlivých cytokinů, chemokinů a bioaktivních lipidů Exprese inducibilních adhezívních molekul (selektiny, ICAM, VCAM) EC pevnější adheze nádorových buněk k endoteliálním b. zprostředkované v základu integrinovými receptory Integriny jsou hlavními přenašeči signálu pro následné molekulám děje (uvolnění od endoteliálních b., interakce s ECM, proteolýza, pohyb buněk a invaze) Hypotéza „docking a locking". Interakce nádorových buněk s cévními endoteliálními buňkami může být rozdělena do počáteční fáze slabé adheze („docking") a pozdější fáze pevné adheze („locking"). Je znázorněna účast specifických skupin adhezívních molekul v těchto dvou fázích. Přechod je zprostředkován širokou škálou bioaktivmích mediátoru jako jsou 12(S)-HETE. TC = Tumor cell; EC = endothelial cells; ECM = extracellular matrix. Angiogeneze IN SITU TUMOR Capillaries proliferate tumor begins to grow Turr imor continues to expand, 'entually spreading to other organs After treatment with antiangiogenic drugs, tumor diminishes in size Endothelial cells in the capillary release protein growth factors Tumor cells release angiogenic proteins and suppress levels of angiogenesis inhibitors ANGIOGENESIS, or neovascularization, involves the proliferation of new blood vessels. The process transforms a small, usually harmless cluster of abnormal cells (known as an in situ tumor) into a large mass that can spread to other organs. Drugs that aim to interfere with angiogenesis—for example, by halting the action of angiogenic proteins—can reduce the size of tumors and potentially maintain them in a dormant state. ANGIOGENEZE Angiogeneze je proces tvorby nových krevních kapilár. U dospělého jedince je proliferace endoteliálních buněk velmi nízká. Fyziologickou výjimku, kde je ale angiogeneze přísně regulována, tvoří ženský reproduktivní systém a hojení ran. Neregulovaná angiogeneze je spojena s řadou patologických stavů jako je revmatická artritída, psoriasis, diabetická retinopatie a nádorová onemocnění. Nádorový růst a tvorba metastáz jsou závislé právě na angiogenezi. Úloha: ■ zásobování živinami a kyslíkem. ■ cesta, kudy se nádorové buňky dostávají do oběhu a mohou tak metastázovat v různých vzdálených orgánech. Angiogeneze je komplexní proces zahrnující širokou souhru mezi buňkami, rozpustnými faktory a složkami extracelulární (mimobuněčné) matrix (ECM). Kooperativní aktivita tzv. systému plasminogenových aktivátorů (PA) a metalloproteináz. Plasminogenové aktivátory - serinové proteázy, které přeměňují plasminogen na plasmin. Plasmin degraduje různé složky ECM včetně fibrinu, fibronektinu, lamininu atd. Plasmin také aktivuje několik typů metaloproteináz. Rodina metaloproteináz (MMP) - asi 16 členů, většina jsou rozpustné sekretované enzymy PA a MMPs jsou sekretovány spolu se svými inhibitory, což zajišťuje přísnou kontrolu likální proteolytické aktivity a je tak zachována normální struktura tkání. Aktivita PA i MMP je kontrolována na několika úrovních: ► exprese se zvyšuje působením angiogenních růstových faktoru a cytokinů ► pro-MMP a pro-PA mohou být proteolyticky aktivovány ► MMP, plasmin a PA jsou regulovány tkáňovými inhibitory MMP (TIMP). Během nádorového růstu a tvorby metastáz je kontrola proteolytické aktivity narušena. U mnoha typů nádorů (kolorekta, prsu, žaludku, moč. měchýře, prostaty) byla detekována vysoká aktivita MMPs. Byla také nalezena dobrá korelace mezi množstvím MMPs a a agresivitou a invazivitou nádoru. Po proteolytické degradaci zahajují "vedoucí" endoteliální buňky migraci přes degradovanou matrix. Jsou následovány proliferujícími endoteliálními buňkami, které jsou stimulovány řadou faktorů, z nichž některé jsou uvolňovány z degradované ECM. Hlavní endogenní induktory angiogeneze: Peptidové růstové faktory a prozánětlivé mediatory ► vascular endothelial growth factor family (VEGF) a angiopoetiny působí specificky na endot. buňky. Působí přes tyrosin kinázové receptory a fungují protiapopticky ► cytokiny a chemokiny přímo působící - aktivují řadu dalších bun. typů. Prototypem je FGF (fibroblast growth factor) a PDGF (platelet growth factor), IL-8, IL-3 ► nepřímo působící faktory (TNF alpha a TGF beta), které působí uvolňování dalších faktorů z makrofágů, endoteliálních nebo nádorových buněk. Např. TNF alpha stimuluje uvolňování VEGF, IL-8 a FGF-2 z endotel. buněk. ► Enzymy_(COX-2, angiogenin), hormony (estrogeny), oligosacharidy (hyaluronan), hemopoetické faktory (EPO, G-CSF, GM-CSF), adhezívní molekuly (VCAM-1, E-selektin), oxid dusíku atd. Endogenní inhibitory angiogeneze: trombospodin-1, interferon a/ß, prolactin, angiostatin, endostatin, vasostatin atd. Zahájení nádorové angiogeneze je výsledkem posunu v rovnováze stimulátoru a inhibitorů. ■ ll.up bFGF PDGF iTiAbs PDGFR — Pericyte ..'■-. Proliferation Migration Survival CZ5 O Thrornbo&pondin End ostati n Tumstatin The development of tumour vasculature — angiogenesis — is important for progression of many tumour types, although tumours frequently form abnormal leaky vessels. Angiogenesis is induced by factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and platelet-derived growth factor (PDGF). VEGF receptors (VEGFRs) are expressed on the endothelial cells of the tumour vessels, whereas PDGF receptors (PDGFRs) are expressed by the pericytes that support bloodvessel growth. VEGF is produced by both pericytes and endothelial cells, and PDGF is produced by endothelial cells, so each cell type produces the growth factor that promotes proliferation and survival of the other cell type. A number of mAbs and receptor tyrosine kinase (RTK) inhibitors have been developed to block these signalling pathways, and have been shown to slow tumour growth in preclinical and clinical studies. Endothelial cells also produce endogenous inhibitors of angiogenesis, such as thrombospondin, endostatin and tumstatin. These are also being developed as anticancer agents. Úloha buněčné adheze Proces buněčné invaze, migrace a proliferace je zprostředkován také adhezívními molekulami. Interakce buňka-buňka a buňka-ECM CAM jsou děleny do 4 základních skupin v závislosti na jejich biochemických a strukturálních vlastnostech: selektiny, imunoglobulinová supergenová rodina, kadheriny a integriny. Členové každé z nich se uplatňují v angiogenezi. K zahájení angiogenního procesu se musí endotel. buňky uvolnit od sousedních buněk. Během invaze a migrace je interakce endotel. buněk s ECM zprosředkována integriny. Také konečná fáze angiogenního procesu, včetně konstrukce kapilárních smyček a určení polarity endoteliálních buněk vyžaduje buněčné kontakty a kontakty s ECM. Integriny (2 nekovalentně spojené jednotka alfa a beta) - heterodimerizují ve více než 20 kombinacích. Endotel. buňky tak exprimují několik různých integrinů -napojení na široké spektrum proteinů ECM. V aktivovaném endoteliu mohou suprimovat aktivitu p-53 a p21 a zvyšovat poměr Bcl2:Bax, což má antiapoptické účinky Další molekuly: ■ vaskulární endoteliální kadherin zprostředkovává na Ca2+ závislé homofilní interakce mezi endotel. buňkami. ■ členové ICAM zprostředkovávají heterofilní adheze. Jsou zvyšovány TNFalfa, IL-1 nebo INF-gamma. ■ P- nebo E-selektin - podporují adhezi leukocytu k cytokiny aktivovanému endoteliu Neoplastická buňka Endoteliální buňka Fibroblast Model angiogeneze - interakce buněčných typů. V nádorových buňkách prostaglandiny (PGs) tvořené přes cyklooxygenázu-2 (COX-2) zvyšují produkci růstových faktorů jako je VEGF, které působí přímo na endoteliální buňky a bFGF, který stimuluje produkci COX-2 u fibroblastů. PGs tvořené ve fibroblastech stimulují produkci VEGF, který působí parakrinním způsobem na endoteliální b. a opět zvyšuje aktivitu COX-2 a usnadňuje permeabilitu cév a angiogenezi. Inhibitory COX-2 blokují produkci PGs a tak zabraňují angiogenezi indukované růstovými faktory. Stupeň angiogeneze jako prognostický faktor r Úzký vztah mezi angiogenezí a tvorbou metastáz. v Cím intenzívnejší angiogeneze, tím větší riziko metastáz a horší prognóza nádorového onemocnění. Histologické řezy a detekce fekálních oblastí tzv. „hot spots" pomocí monoklonálních protilátek proti cévním endoteliím nebo adhezívním molekulám CD31 a CD34. Kvantitativní hodnocení je prognostickým faktorem např. u rakoviny prsu, děložního čípku, močového měchýře a melanomu. Zvýšená vaskularizace kostní dřeně - horší prognóza u akutní leukémie. Inhibice angiogeneze - léčebná metoda Antiangiogenní terapie - výhody proti terapii mířené přímo proti nádorovým buňkám. Endotehální buňky jsou geneticky stabilní, diploidní a homogenní cíl a zřídka zde dochází k mutacím. Také jejich obnova je 50 krát vyšší než v normální klidové tkáni a aktivované krevní cévy vykazují specifické markery jako jsou integriny a selektiny nebo VEGF receptory. Hustota cév uvnitř nádoru má také prognostickou hodnotu. Byla nalezena pozitivní korelace mezi nádorovou angiogenezí a rizikem vzniku metastáz, znovuobnovení nádoru a smrtí. ♦ inhibitory buněčné invaze, motility a adheze (inhibitory MMP aktivity, inhibice buněčných adhezívních molekul) ♦ inhibitory aktivovaných endotehální ch buněk (trombospodin-1 - fyziologický inhibitor angiogeneze, který je snížen během aktivace angiogeneze a jeho produkce je regulována p53, angiostatin a endostatin - zdrojem jsou samotné nádorové buňky, uměle syntetizované látky (talidomid) ♦ látky, které interferují s angiogenními růstovými faktory a jejich receptory (specifické protilátky, INF-alfa ♦ inhibitory enzymů jako je COX-2 (NSAIDs) ♦ tzv. "vascular targeting" - inhibice růstu nádoru destrukcí nádorových cév. Endogenní inhibitory angiogeneze Table I. Some endogenous inhibitors of angiogenesis Name Description Thrombospondin-1 and internal fragments of thrombospondin-1 Angiostatin Endostatin Vasostatin Vascular endothelial growth factor inhibitor (VEGI) Fragment of platelet factor 4 (PP4) Derivative of prolactin Restin Proliferin-related protein (PRP) SPARC cleavage product Osteopontin cleavage product Interferon a-/ß Meth 1 and Meth 1 Angiopoietin-2 Anti-thrombin III fragment Thrombospondin is a 180 kDa, large, modular extracellular matrix protein (53) A 38 kDa fragment of plasminogen involving either kringle domains 1-3, or smaller kringle 5 fragments (58,163,164) A 20 kDa zinc-binding fragment of type XVIII collagen (59) An N-terminal fragment (amino acids 1-80) of calreticulin (61) A 174 amino acid protein with 20-30% homology to tumor necrosis factor superfamily (60) An N-terminal fragment of PP4 (63) 16 kDa fragment of the hormone (57) NC 10 domain of human collagen XV (165) A protein related to the pro-angiogenic proliferin molecule (166) Fragments of secreted protein, acid and rich in cysteine (62) Thrombin-generated fragment containing an RGD sequence (65) Well known anti-viral proteins (56) Proteins containing wetalloprotease and /hrombospondin domains, and disintegrin domains in NH2 termini (65) Antagonist of angiopoietin-1 which binds to tie-2 receptors (39,44) A fragment missing C-terminal loop of anti-thrombin III (a member of the serpin family) (64) Inhibitory angiogeneze v klinických zkouškách Phase t Phi» 11 Dru 4 Sparvi-i-J Huchanlům C0L4 Cülldq-sf-s-j, NCI Synttrtlc UUP InUiH«; Mrvtyclmn il-rmfti.iN 3qiMÍMrti*n* UrgftlHlrt mnihiLi NartH É^eAirt^p- C^nhrflBftliilln Oi tyw Ajinpr:iBib in 11 r ■ 111 ŕn r a 1 i ■: -=| *ndaf»hiim PtKmftK2204 endDbuhr. N opařili IKUEnnMMl D 'srkl VEGF rnc+ptor UQhlIlrig JnrtiBtlnn BfitfaUttUal coll HI r;ť:i ■rtMD-fer «'Ciltfuin Influx pm?flTJ5KÍHa4 l4o**Tt* ■firrjil rratacuki Inhibitor aľ VtCr rícnpíijr cas.sTíoaA NVJirlll SptfhHrtitiiJUP iiiiiibnM TN P**™ ThJlldomldd TMP Rtiim. F!_ffiůf|lllll dťlllfrgLfd; ptoMejjean UrítoaiMi 5US4ID 3unjm BJocJhJ. VEDF růL-trpLOJ iii;-iiil,ii] Vin. -i ..*,« An ll bod y \a Nnlnnnn «1 PfldCltatdl DUrT«C4 lntirlfluhlf*-l* rtpriHllnq Innl ml IP-ID EU01213T* UOfCt GtflTilrli,1 im iff rrnbciilfi Integjln jnlnganl«! Phase III M|d|rTi44t9l Ui IllaJi Dkrtnc" iyrUJinllc MlrP iPhLDlIc AD334" AijLuruľk ^yrup-iúliiľ UUP iHriitiHe« Unu-dMlnl/AEQ-M Aůivni* HHuuIUUP HiitUECFn InhLbllor AilU-VeIGF Ah HCl ÉÍ4BWJMM it^lltWtr 1» VEQF Inbrfarnn-ulln Cítim m ■ n=uJ 1 y Jnhlbrflnn cd hF