LECEBNE METODY CHIRURGIE OZAŘOVÁNÍ CHEMOTERAPIE BIOLOGICKÁ TERAPIE Chemoterapeutické látky ► platinové deriváty ► antimetabolity (metotrexat, fluorouracil) ► inhibitory topoizomeráz (doxorubicin, etoposid) ► alkylaění činidla (cyklofosfamid) ► rostlinné alkaloidy (vinblastin, paclitaxel) Biologická terapie - hledání nových přístupů na základě poznání mechanismů ► Stimulace obranných mechanismů hostitele včetně specifických a nespecifických imunologických přístupů (imunoterapie) ► Strategie cílené přímo na změnu nádorového růstu a diferenciace - využití růstových faktorů, genetické inženýrství - ovlivnění klíčových genů. ► Angiogenní terapie - cílená proti vaskularizaci nádorů Podpůrná (symptomatická) léčba Nemá za cíl smrt nádorových buněk, ale usiluje o co nejlepší kvalitu života nemocných (zmírnění obtíží vyvolaných nádorem a léčbou) Paliativní léčba - komplexní podpůrná léčba u pacientů s pokročilým nevyléčitelným onemocněním Kurátivní léčba - cílem je vyléčení nemocného Nekurativní léčba - cílem je zabíjet nádorové buňky, ale nemá ambice vyhubit všechny (pokročilé onemocnění, rezistence na léčbu atd.) Adjuvantní léčebné postupy -chemo- nebo radio-terapie - u těch nádorů, kde je předpokládána přítomnost mikrometastáz, nutná chemosenzitivita nádoru Neoadjuvantní postupy - predoperační léčba s cílem zmenšit primární nádor před chirurgickým výkonem Vznik a vývoj nádorů je složitý děj, který závisí na překonání řady reštrikční ch mechanismů na úrovni genomu, buňky, tkáně i celého organismu a který pro svou komplexnost vyžaduje při plánování terapie individuální přístup (tailoring therapy) - využití poznaných biologických charakteristik Klinické - staging (jeden z nejsilnějších prognostických faktorů), sledování přežití a léčebné odpovědi Orgánové - sledování odpovědi nádoru na léčbu Tkáňové - histologická charakteristika, grading, tkáňová architektonika, vaskularizace, expresní profily-imunohistochemie, in situ hybridizace Buněčná - funkční testy, obsah DNA, proliferační a apoptická aktivita Molekulární - cytogenetické a genetické charakteristiky nádorových a somatických buněk Incidence nádorových onemocnění se stále zvyšuje. Přesto je dlouhodobá mortalita téměř konstantní díky výrazným léčebným a diagnostickým pokrokům. Nové léčebné postupy, nová chemoterapeutika, kombinovaná terapie a aplikace nových poznatků o biologii nádorové buňky. Hledají se nové prognostické/prediktivní faktory umožňující přesnější rozdělení nemocných do rizikových skupin. Cancer incidence and mortality in the United States cancers of epithelia: carcinomas oral cavity and pharynx digestive organs respiratory system breast reproductive tract urinary organs skin melanoma leukemias and lymphomas central nervous system connective tissue, i muscles and vasculature I other KEY- new cases per year (total-1,220,000) m deaths per year (total = 552,200} 40 80 120 160 200 240 number per year (thousands) 280 Figure 23-2. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. DIAGNOSTIKA Laboratorní vyšetření ( sedimentace erytrocytu, hematologické vyšetření, biochemická vyšetření) Nádorové markery - laboratorně prokazatelné známky projevu specifických nádorových onemocnění (antigény, emzymy, hormony a jejich receptory) Mohou odrážet proliferační aktivitu, mohou být sdružené s diferenciací nebo vznikají při destrukci buněk. Patří sem i pro nádor charakteristické chromozomální abnormality. Biochemické metody detekce: radioimunologická (RIA), enzym vázající imunosorpční (ELISA) (většinou komerční kity a automatické analyzátory) Vyšetření stavu buněčné kinetiky Morfologie, sledování počtu mitóz - mitotický index Metody autoradiografické (inkorporace 3H-tymidinu) Metody cytochemické (speciální barvení, speifické protilátky proti antigenům spojeným s proliferací (Ki-67, PCNA), stanovení AgNOR Průtoková cytometric Molekulárně biologické metody (Southern, Nothern a Western blotting pro analýzu DNA, RNA a proteinů), polymerázová řetězová reakce - amplifikace malých fragmentů DNA, vytváření cDNA knihoven z malého množsví mRNA (PCR, RT-PCR, real-time PCR) Hybridizace in situ, microarrays Cytologické a bioptické vyšetření (pre- nebo postoperační) ZOBRAZOVACÍ METODY Ultrasonografie - vyšetření ultrazvukem, neinvazivní Rentgenové vyšetření - kontrastní vyšetření, mamografie - screening a diagnostika rakoviny prsu Počítačová tomografie (CT) - odhalí až 90% ložisek menších než 1 cm Magnetická rezonance (MR) - zejména vyšetření mozku a míchy Radionuklidové vyšetřovací metody - využití izotopů (scintigrafie, emisní tomografie Endoskopické vyšetření - nádory v tělních dutinách Klasifikace nádorových onemocnění Určení rozsahu onemocnění důležité pro volbu léčebné strategie a pro odhad prognózy onemocnění. Jednotný klasifikační systém TNM T (tumor) 1 -4 - rozsah primárního nádoru N (noduli) 1-3, 0, X - stav regionálních mízních uzlin M (metastases) 0, 1 - informace o metastázach Histopatologický grading Gl - 4, X - stupeň diferenciace Další nezávazné deskriptory Stadium choroby (staging) I. - IV. Hodnocení tělesné zdatnosti (funkční staging) U některých nádorů formulován soubor prognostických znaků, tzv. mezinárodní prognostický index (IPI) PREDIKTIVNÍ ONKOLOGIE klinicky orientovaný onkologický výzkum využívající metod buněčné a molekulární biologie. Hledání nových léčebných postupů a léčiv směrovaných na klíčové genetické změny umožňující transformaci normální somatické buňky v nádorovou. Jsou to především ► poruchy buněčného cyklu, ► poruchy v aktivitě/množství receptoru pro růstové faktory, ► exprese protiapoptických faktorů a ► nesmrtelnost nádorových buněk vázaná či nevázaná na expresi telomerázy. Chromozomální a genetická analýza nádorových buněk je důležitým faktorem pro prognózu a individualizaci léčby. Problémem jsou zvláště solidní nádory, kde jsou cytogenetické znalosti minimální např. ve srovnání s hematologickými malignitami. V praxi se jedná o stanovení ploidity DNA, chemosensitivity in vitro, cytogenetické a genetické vyšetření atd. MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE studium procesů související se vznikem a rozvojem chorob, a to na úrovni nukleových kyselin a proteinů, respektive jiných molekul, které jsou jimi regulovány. Využívá technik molekulární biologie a výsledky jsou dávány do kontextu s nálezy dalších biomedicínských oborů. Umožňuje odhalovat počátky nemoci a nahlédnout až na genovou úroveň. Nové směry vývoje protinádorové léčby Cílem je přímo a cíleně zasáhnout do klíčových mechanismů karcinogeneze na buněčné úrovni (targeted therapy). Často v kombinaci s konvenčními léčebnými postupy ► Anti EFGR terapie - monoklonální protilátky s vazbou na receptor, inhibitory tyrozinkináz, antisense nukleotidy, vakcína proti receptoru nebo ligandu ► Diferenciační terapie (kyselina all-trans retinová, vit D3) ► Inhibitory přenosu signálů Inhibitory tyrozinkináz Inhibitory cyklin-dependentních kináz - ovlivnění bun. cyklu Inhibitory jiných kináz - např. MAP kinázy, JNK Inhibitory farnesyltransferázy - inhibují onkoprotein ras - spojen s vnitřní stranou plazmatické membrány izoprenoidní lipidovou skupinou - farnesylem Mutace protoonkogenu ras - častá u nádorů - vede k nekontrolované proliferaci, inhibici apoptózy a zvýšení angiogeneze Imunoterapie intervence do imunitních mechanizmů s cílem obnovit nebo modifikovat funkce imunitního systému (substituční, supresivní nebo stimulační, aktivní vs. pasivní, specifická a nespecifická) Buněčná imunoterapie - podání buněk imunitního systému s protinádorovou aktivitou - cílené zasažení nádorové tkáně a překonání tolerance a imunosuprese vyvolané nádorem. Nádorové antigény - vznik nových antigénu, kterými se nádorové buňky liší od normálních - terč pro imunitní reakci Nespecifická buněčná imunoterapie - posílení protmádorové imunity nezávisle na specifických nádorových antigenech Princip: kultivace efektorových buněk ex vivo s látkami, které aktivují nebo posilují jejich protinádorový účinek (LAK buňky, NK-buňky, aktivované monocyty- makrofágy Zkoušeno přes 30 let - malé uplatnění v praxi Specifická buněčná imunoterapie - adoptivní imunoterapie využívající specifický převod buněk (TIL) Protinádorové vakcíny - navozují specifickou imunitní odpověď proti nádorovým buňkám v prim. nádoru i metastázach Dendritické buňky nespecifické postupy humorální buněčné rekombinantní interferony rekombinantní interleukiny rekombinantní růstové faktory chemoimunoterapie A K T I V N í adoptivní imunoterapie LAK TIL BCG imunoterapie specifické postupy monoklonální protilátky proti nádorovým Ag proti liniovým Ag A K T I V í vakcinace nádorovými antigény adjuvant cytokiny CpG dendritic ké bunky cytokiny nádorové antigény DNA vakcinace )br. 26.19: Terapeutická modulace imunitního systému nemocných s nádorovým bujením J.Krejsek, O. Kopecký: Klinická imunologie, 2004 Genová terapie Postup mající za cíl napravit genetickou odchylku způsobující vývoj nádorové buňky (p53, geny rezistence, sebevražedné geny, cytokiny) Antisense oligonukleotidy Angiogeneze a antiangiogenní terapie inhibitory proteáz inhibitory migrace a proliferace endotelu inhibitory angiogenních růstových faktorů chelátory mědi HODNOCENI DAT - VÍCEROZMĚRNÉ ANALÝZY Průnik metod molekulární biologie do onkologické diagnostiky vyžaduje zpracování multiparametrických (vícerozměrných) souborů dat. Biomarkery, „surrogate biomarkers" - „náhradní" biomarkery Patří mezi ně ► důležité genetické a cytogenetické markery, ► exprese významných regulačních genů, ► aktivity enzymů, ► cytokinetické parametry, ► parametry angiogeneze, atd. Vyšetření na chemorezistenči v testech in vitro (MTT test) a související znaky (exprese MRP, PGP). Doplňují standardní klinická vyšetření a nespecifické ukazatele imunologického a fyziologického stavu pacienta. Je nutné vytvořit systém hodnocení takovýchto dat s cílem určit jejich prognostický význam a zajistit zpětnou vazbu lékaře k těmto hodnoceným datům - individualizace léčby - prospěch pro pacienta Transplantace DONOR STEM CELLS (FROM MARROW OR BLOOD) TRANSPLANTATION CHEMOTHERAPY OR RADIATION PATIENT J Embryonic neural tissue Epithelial cells Epithelial sheets No stem cells? Burns Ulcers Genetics skin disorders V Platelets €) WBC RBC V Cancer Immune deficiencies Metabolic disorders Hemoglobinopathies Current Opinion in Cell Biology Summary of therapeutic t issue-specific stem cell transplants. Purification of HSCs from bone marrow (BM) and subsequent transplantation can reconstitute the blood system, including red blood cells (RBCs), white blood cells (WBCs) and platelets, for the treatment of cancer, immunological deficiencies, metabolic disorders and hemoglobinopathies. Epithelial cells can be cultured and transplanted, creating an autologous source of epithelial stem cells to treat burns, ulcers and genetic skin disorders. Dopaminergic neurons derived from embryonic neural tissue can be transplanted to treat Parkinson's disease. Pancreatic stem cells have not been isolated. Enucleated oocyte Somatic cell nucleus Transplant •ä Gene therapy ^ I Transplant Current Opinion in Cell Biology Nuclear transfer embryonic stem (NT ES) cells can be created by the transfer of a somatic cell nucleus into an enucleated oocyte. ES cells cultured from the ICM of a blastocyst created by NT can either be manipulated for transplantation or can undergo gene therapy before transplantation for the treatment of genetic disorders. Kontrola hemopoézy ► pozitivní regulace - využití hemopoetických tzv. kolonie stimulujících růstových faktoru (CSF) erytropoetin, G-CSF - granulocytární růst. faktor, M-CSF - monocytární růst. faktor, GM-CSF - granulocytární-makrofágový růst. faktor, interleukin 3 (IL-3) ► negativní regulace hemopoézy - prevence poškození kmenových buněk při chemoterapii - TGF ß ► autokrinní růst - blokáda přenosu růstových signálů antagonisty růstových faktorů, receptoru a inhibitory dalších stupňů přenosu signálů (inhibitory PKC, lipidového metabolismu, "antisense" látky, atd.) ► imunomodulační látky - ovlivnění imunitního systému hostitele (IL-2, interferon alfa a gama Erytropoetin - stimulace erytropoézy po chemoterapii a transplantaci KD - u některých lymfoproliferačních poruch jako jsou mnohočetné myelomy a chronická lymfocytární leukémie - u anémií spojených s chronickým onemocněním (nádory, AIDS) - v programech autologního odběru krve Granulocytární kolonie stimulující faktor (G-CSF a GM-CSF) - urychlení zotavení krvetvorby po chemoterapii - zlepšení sběru progenitorů z periferní krve - zvýšenní účinnosti cytotoxických léčiv vybuzením klidových leukemických buněk Nejběžnější využití CSF (colony stimulating factors) - prevence a ovlivnění myelosuprese - intenzifikace chemoterapeutických programů s nebo bez autologní podpory progenitorů z kostní dřeně (KD) nebo periferní krve - rekonstituce krvetvorby po chemo- a rádioterapii a autogenní nebo allogenní transplantace KD - podpora a expanze progenitorů periferní krve - stimulace hemopoézy u syndromů poruch v KD jako je cyklická neutropenic, aplastická anémie - aktivace efektorových buněčných funkcí (AIDS, poruchy funkce leukocytu) - pomocí růst. faktorů lze také buňky v GO fázi, kdy jsou rezistentní k působení cytostatik posunout do buněčného cyklu CML je klonální myeloproliferativní porucha primitivních hemopoetických kmenových buněk. Zahrnuje myeloidní, erytroidní, megakaryocyt., B- někdy T-lymfoidní elementy, ale ne fibroblasty kostní dřeně (KD). Nemoc je silně heterogenní, má 2 až 3 fázový průběh, je přítomen chromoz. marker - Ph chromozom. V minulosti byla prognóza pacientů s CML velmi špatná (stř. doba přežití 3 roky). Nyní se prognóza zlepšila díky včasné diagnóze, zlepšující se terapii a podpůrné léčbě. Léčba hydroxyureou a busulfanem podporovaná IFN a autologní transpl. KD. Nyní je stř. doba přežití asi 60-65 měsíců. S IFNalfa 20-25% pacientů přežívá. Vedlejší účinky - horečka, nechutenství, svalové bolesti, dlouhodobější - ztráta váhy, deprese, nespavost atd. MDS je získaná klonální porucha kostní dřeně charakterizovaná kvantitativními i kvalitativními poruchami v hemopoéze (hodně u starších lidí - není možná drastická terapie) Rada léčebných protokoluje zaměřena na využití diferenciačních látek k podpoře zrání blokovaných buněk. Existují in vitro modely, kde je možno pomocí retinové kyseliny, DMSO nebo vit D3 příp. G-CSF, GM-CSF. Avšak v praxi u pacientů nepřinášejí žádoucí výsledky. Kyselina all-trans retinová (ATRA) je nyní efektivním lékem při léčbě akutní promyelocytární leukémie. Na MDS má však malý účinek (genetický důvod - absence translokace 15,17 důležité pravděp. pro klinický účinek ATRA). Rekombinantní růst. faktory jako GM-CSF a IL-3 jsou u MDS pacientů úspěšně využívány ke zvýšení počtu cirkulujících bílých krvinek a destiček. Chemoprevence a chemoterapie HEALTHY CELL Jk HB PROGRAMMED DEATH OF ALTERED CELLS (APOPTOSIS) GENETIC MUTATIONS THAT CAN LEAD TO CANCER .r""-*v„ PROCESSES THAT LEAD TO EXCESSIVE PROLIFERATION OF GENETICALLY DAMAGED CELLS DAMAGED CELL (PRECANCEROUS) CANCER CELLS i Ste. DIFFERENTIATION OF CELLS DĚDIČNOST NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNI Genetika, mutace specifických genů - zvýšená náchylnost (susceptibility) k určitým typům nádorů Prevence - „family trees", cytogenetické amalýzy, enzymové markery CHEMOPRE VENCE Přírodní nebo syntetické látky, zasahující v ranných fázích karcinogeneze. Aktivují detoxifikační enzymy, antioxidační účinky - laboratorní a epidemiologické studie q-tokoferoL ß-karoten , vitamin A a retinoidy - zelenina, ovoce Dithiolthiony, sulforaphan - brokolice, květák, kapusta Genistein - sója Epigallocatechine gallate - zelený čaj Curcumin - curry Tamoxifen - antiestrogen - prevence u žen se zvýšeným rizikem vzniku nádoru prsu Nesteroidní antiflogistika (NSAID) - aspirin, piroxicam, sulindac - prevence kolorektálních nádorů Finasteride (blokuje přeměnu testosteronu na androgen) - prevence nádorů prostaty DFMO - difluorometylornitin (blokuje aktivitu ornitin dekarboxylázy) - prevence různých typů nádorů Representative members of four classes of new chemopreventive agents, whose mechanism of action is known Selective COX-2 Inhibitors Selective Binding to RXR (Rexinoids) H.C V" CF* Celecoxib COOH LG 100268 SERP-ls PPAR-7 Uganda COOH OCH 3 LY353381-HCI GW 7845 Six patterns for the cyclization of squalene are shown here; numerous other variations exist in nature Oleanolic and ursolic acids Squalene (CM) Specific Cyclase X \Specific Cyclase COOH tOOH Oleanolic Acid (OA) (C30> Ursolic Acid (UA) (Cm) Oleanolic and ursolic acids, which have been used as chemopreventive agents, are both derived from squalene. Note that the two structures differ only in the location of the two methyl groups in the E-ring. Families of Chemotherapeutic Drugs ANTIMETABOLITES Some anticancer compounds act as false substances in the biochemical reactions of a living cell. A prime example of such a drug is methotrexate, which is a chemical analogue for the nutrient folic acid. Methotrexate functions, in part, by binding to an enzyme (orange) normally involved in the conversion of folic acid into two of the building blocks of DNA, adenine and guanine. This drug thus prevents cells from dividing by incapacitating their ability to construct new DNA. Examples: methotrexate, fluorouracil, gemcitabine TOPOISOMERASE INHIBITORS Replication of a cell's genetic material requires a means to pull the DNA double helix apart into two strands. This separation is typically accomplished with the aid of a special "topoisomerase" enzyme (orange) that temporarily cleaves one strand, passes the other strand through the break and then reattaches the cut ends together. Drugs that inhibit the ability of topoisomerase enzymes to reattach the broken ends cause pervasive DNA strand breaks Examples: doxorubicin, CPT-11 ALKYLATING AGENTS Certain compounds (orange) form chemical bonds with particular DNA building blocks and so produce defects in the normal double helical structure of the DNA molecule. This disruption may take the form of breaks and inappropriate links between (or within) strands. If not mended by the various DNA repair mechanisms available to the cell, the damage caused by these chemicals will Examples: cyclophosphamide, chlorambucil PLANT ALKALOIDS Certain substances derived from plants can prevent cell division by binding to the protein tubulin. Tubulin, as its name implies, forms microtubular fibers (pink) that help to orchestrate cell division. These fibers pull duplicated DNA chromosomes to either side of the parental cell, ensuring that each daughter cell receives a full set of genetic blueprints. Drugs that interfere with the assembly or disassembly of these tubulin fibers can prevent cells from dividing successfully. Examples: vinblastine, vinorelbine, paclitaxel, docetaxel Expozice buněk velmi nízkými dávkami chemoterapeutik má minimální efekt na viabilitu nebo bun. cyklus díky dostatečným schopnostem reparačního systému opravit poškození. Ve vyšších konc. v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti kontr. bodu v Gl (souvisejícího s expresí p53) se vyskytují 2 typy odpovědi: ► v případě funkčního kontr. boduje bun. cyklus zastaven v Gl dokud nedojde k opravě poškození nebo dochází ke spuštění apoptózy při velkém rozsahu poškození (po vysokých konc.) nebo neúspěšné reparaci. ► jestliže je kontr. bod nefunkční (např. při mutaci p53) buňky vstupují do S fáze, ale postup (DNA replikace) je suprimována podle konc. látky. - v případě buněk „primed" k apoptóze, dojde k apoptóze rychle (3-6 h, „immediate apoptosis") u prahových hodnot konc, slabě nad těmi, které kompletně inhibují progresi S fáze. - v případě non-primed buněk prodloužená suprese průchodu bun. cyklem (defective progression) vede k růstové nerovnováze, sekundárním změnám, následnému nastartování a pozdní apoptóze. Tato apoptóza vykazuje často atypické vlastnosti, komlikované růstovou nerovnováhou a sekundárními změnami metabolismu. - při ještě vyšších konc. překračujících farmakologickou dávku dochází k nekróze. Nádorové tkáně mají, analogicky jako normální tkáně, proliferující část populace a část populace neproliferující, která se skládá z klidových buněk v GO fázi nazývané někdy také populace kmenových neoplastických buněk. Tyto buňky je obtížné zničit, protože jsou rezistentní k cyto statickému působení záření nebo chemoterapeutik. Určitou dobu po ozáření nebo chemickém působení vstupují znovu do cyklu a jsou zdrojem obnovy nádorového růstu. Opakovaná cytostatická terapie a kombinovaná terapie (s využitím humorálních faktorů, imunologickou indukcí, atd.) představují hlavní přístupy jak dostat do cyklu i klidové buňky, a pak účinně inhibovat jejich růst. Klíčovou otázkou však zůstává volba nejvhodnějšího časového intervalu mezi jednotlivými aplikacemi (matematické modely). Klidové buňky přežívají mnohem lépe, protože během dlouhého časového intervalu mezi cytostatickým působením a DNA replikací a dělením chromosomů je poškozený genetický materiál reparován. Rychle rostoucí nádory jsou citlivé na cytostatickou terapii, frakce neproliferujících buněk je malá, buňky mají krátkou generační dobu. Opakovaným působením lze převést GO buňky do cyklu a účinně inhibovat růst (lymfomy, seminomy, některé leukémie). Pomalu rostoucí nádory mají přechod buněk z GO zásobní populace řízen negativní zpětnou vazbou. Tento mechanismus udržuje vždy minimální hladinu GO buněk, ze kterých se populace vždy obnovuje. Tyto nádory jsou rezistentní na cytostatickou terapii a je velká pravděpodobnost vzniku rezistentních klonů. Buňky mají dlouhou generační dobu (karcinom tlustého střeva, žaludku, plic, sarkomy). Cell Cycle Progression Normal Defective (delayed apoptosis) No effect Cytostasis Immediate Necrosis (Repair) ^o* Apoptosis S^ t&' („Primed" cells) 0 Drug Concentration Generalized scheme illustrating the effects of increasing concentrations of DNA damaging antitumor drugs, on cell cycle progression and apoposis. Exposure of cells to very low drug concentrations has generally no, or minimal, effect on their viability or cell cycle, most likely due to the fact that the rate of DNA repair exceeds the rate of accumulation of the lesions. At higher drug concentrations, depending on the presence or absence of the G1 checkpoint (which is associated with expression of tumor seppressor gene p53) two types of responses occur: a) In the presence of a functioning checkpoint, cell progression through G1 is halted until the lesion is repaired. Alternatively, apoptosis is triggered when the damage is extensive (high drug concentration) or repair unsuccessful, b) If the G1 checkpoimt is malfunctioning (e.g., as in the case of of mutation of p53) the cells do enter S, but the rate of progression (rate of DNA replication) is suppressed proportionally to the drug concentration. In the case of cells „primed" to apoptosis, apoptosis generally occurs very rapidly (3-6 h, „immediate apoptosis") at the threshold drug concentration, slightly above that which completely halts their progression through S [Del Bino et al., 1991]. Cell priming to apoptosis may be associated with, among other factors, constitutive expression of c-myc. In the case of „nonprimed cells," prolonged suppression of cell cycle progression by the drug („defective progression") leads to growth imbalance, secondary changes, their subsequent „priming" (developmet of effectors), and delayed apoptosis. Delayed apoptosis may often have atypical features, complicated by growth imbalance and secondary changes in cell metabolism [Kung et al., 1990]. Necrosis is seen at still higher drug concentration, generally above its pharmacological level. Table 2. Drug inducers of Oxidative Stress Anthracyclines Epipodophyllotoxins Camptothecins Platinum coordination complexes Bleomycins Alkylating agents Table 3. Potential Mechanisms for Aldehyde Intel fere nee of Cancer Therapy Effectiveness Prolong G-| Inhibit Go to Gi transition Checkpoint arrest Gl S G2 M Restriction point block Inhibit drug-induced apoptosis Caspase inhibition Death receptor binding Vhodná strategie pro úspěšnou nádorovou terapii More apoptosis of Cancer cells Less apoptosis of Normal cells Increased efficacy + reduced toxicity = therapeutic benefit Figure 1 Desirable strategy to achieve therapeutic benefit in cancer therapy. Agents which effectively kill cancer cells are useful to the extent that toxicity to normal cells is tolerated. It is clear that therapeutic benefit can be achieved by increasing apoptosis of cancer cells as well as by lowering toxicity to normal cells upon exposure to anticancer therapy Figure 2. Duel Apoptotic Pathways of Chemotherapy Chemotherapy Cellular Damage Death Receptor Activation Cytochrome c Release Caspase 8 Activation Caspase 9 Activation Activated Caspase Cascade APOPTOSIS Cellular damage by antineoplastic agents initiates the process of apoptosis by causing release of cytochrome c from mitochondria or by activation of death receptors. These proapoptotic events result in activation of unique proteases, caspase 8 and caspase 9, which are termed initiator caspases because they activate other caspases {effector caspases} that carry out disassembly of the call. of Apoptosis Pathways by Anticancer Therapy Drugs / Irradiation / 9 "stress pathway" v Bax ^ ros .0"0 0 CAD/ICAD DNA Fragmentation Fiyurť I Apoptosis pathways in anticancer therapy. Apoptosis pathways can be triggered through dil'lerent entry sites, lor example, at the plasma membrane upon cross! inking o ľ death receptors (receptor pathway) or at the mitochondria [mitochondrial pathway). Stimulation oľ death receptors of the TNF receptor superiamily (DTL-R) such as CD95 (APO-l/Fas) or TRAIL receptors by DIL results in receptor aggregation and recruitment o ľ the adaptor molecule F ADD and easpase-S into a DISC. C a spase-8 becomes activated upon recruitment and initiates apoptosis by direct cleavage oľ downstream ei'ieetoreaspases. The mitochondrial pathway is initiated by the release oľ apoptogenic i'actors such as cytochrome c. or Smac ľrom mitochondria into the cytosol. The release oľ cytochrome c into the cytosol triggers caspase-3 activation through the ľormation oľ the cytochrome nv'Apai'-l/caspase-S-containing apoptosome complex, Smac promotes caspase activation through neutralizing the inhibitory eľľects to IAPs, while A IF causes DNA condensation. The receptor and the mitochondrial pathway can be interconnected atdil'lerent levels, ľor example, through Bid, a BH3 domain-containing protein o ľ the Bcl-2 family, which assumes cytochrome ^-releasing activity upon cleavage by caspase-8. Activation oi'caspascs is negatively regulated at the receptor level by FLIP, which block caspase-8 activation, at the mitochondria by Bcl-2 family proteins and by IAPs. AIF, released from mitochondria mediates caspase-independent large-scale DNA fragmentation alter translocation to the nucleus Typy buněčné smrti po působení protinádorových terapeutik A E h- tissue Necrosis cytotoxic agent (dose) Figure 3 Forms of cell death caused by anticancer drugs (cytotoxic stimuli). At low (subcytotoxic) doses, a drug (or other cytotoxic agents) can arrest cell proliferation without significant cytotoxicity. At higher drug concentrations, apoptosis-prone cells undergo rapid cell death caused by caspase activation. Apoptosis-reluctant cells may either recover or undergo slow cell death. At maximal cytotoxicity, rapid necrosis may occur in any cell types Mechanismy rezistence ke xenobiotikům rezistence může být důsledkem ► snížené vnitrobuněčné koncentrace látky díky změněnému příjmu do nitra buňky, zvýšenému vylučování z buňky nebo rozložení v buňce ► zvýšené buněčné detoxifikace (inaktivace) ► kvalitativních nebo kvantitativních změn buněčného cíle (enzymu) ► neschopnosti přeměňovat látku na aktivní formu ► zvýšené inaktivace látky ► zvýšené reparace DNA ► poruch v drahách apoptózy Mnoho těchto mechanismů může působit současně a jsou buď přirozeně přítomny v buňce nebo vznikají de novo během choroby a léčení. Vylučování látky z buňky je spojeno s aktivitou specifických proteinů nebo proteinových komplexů uvnitř cytoplasmatické membrány. MDR - "multidrug resistance" k nádorové chemoterapii spojené se zvýšenou expresí Pgp (PÍ70) glykoproteinu - membránová adenosin trifosfatáza (ATPáza) se širokou specifitou. Transportuje endogenní substance (toxiny, metabolity, odpad, hormony atd.). Farmakologická funkce spočívá v protekci proti cytotoxickým látkám. Mechanismus MDRje posledních 10 let intenzívně studován. Byl izolován lidský gen MDR1 na chromosomu 7. Tento gen kóduje Pgp a jeho exprese je spojena s MDR fenotypem. o o o o «: O Decreased drug \ ..***• influx Ion activation of the drug ?...-* °o°o « ° o oo o ••■♦.JOO °o o Drug inactivation o o o o Drug Activated drug Inactivated drug Detoxified drug Drug activation o o o o ♦♦' o *♦ O O ^* í°°o° °/ It i Sequestration ^ I ■ Reparation * o ° o O Increased drug efflux D B -TJ>>/S^UZr Target amplificatioi Detoxification ^Q ^ Target alteration ■► Regular way of target inhibition Buněčné mechanismy lékové rezistence ......> Different ways of resistance Buněčná detoxifikace Základní roli v rezistenci nádorových buněk k různým cytotoxickým látkám hraje glutation (GSH) - vnitrobuněěný tripeptid obsahující cystein a přítomný v savčích buňkách ve vysokých koncentracích. Zvýšená konjugace s GSH je hlavním mechanismem vývoje rezistence. Glutation- S -tranferázy (GST) - čtyři známé izoenzymy -jsou hlavní skupinou detoxifikačních enzymů. Protože katalyzují konjugaci s GSH, je hladina jejich exprese hlavním faktorem určujícím senzitivitu buněk. GSH i GST mohou způsobovat rezistenci i jinými mechanismy než konjugací, např. GSH může modulovat reparační funkce DNA a tak kontrolovat rezistenci např. k cisplatině. Využití inhibitorů GSH - indometacin, piriprost Rezistence k chemoterapii zprostředkovaná změnami buněčného cíle Změny topoizomerázy - topoiz. lije zásadní pro replikaci DNA - cíl interkalačních látek jako je adriamycin, actinomycin D nebo neinterkalačních látek jako jsou etoposide nebo teniposide. Rezistence může být způsobena změnou hladiny topoiz. II nebo expresí mutovaného enzymu. Změny DHFR (dihydrofolátreduktázy) - cíl antifolátových látek - metotrexát. Zvýšená hladina DHFR je příčinou rezistence. Změny tymidilát syntázy - cíl 5-fluorouracilu. Dva mechanismy rezistence - změny afinity TS k lékům díky substituci jedné aminokyseliny nebo zvýšená TS aktivita. Zvýšené reparační funkce DNA DNA je cílem různých cytotoxických látek. Přímou nebo nepřímou vazbou k DNA způsobují tyto látky změny v DNA a genomové poruchy vedoucí k buněčné smrti. Jednoduchá alkylační činidla se kovalentně váží k DNA - vnitro- i meziřetězcové vazby. Deriváty kovů jako je cisplatina tvoří také podobné vazby. Cisplatina obecně porušuje DNA indukcí vnitrořetězcových vazeb mezi N7 atomy dvou sousedních guaninů a v menší míře indukcí meziřetězcových vazen a monoaduktů. Další cytotoxické látky jsou schopny nekovalentně se vmezeřovat do DNA. Ačkoliv všechny tyto interakce s DNA jsou potenciálně letální, rozsah buněčné smrti je ovlivňován rozdíly v rozsahu reparace. Existuje inverzní vztah mezi buněčnou reparací a cytotoxickou senzitivitou. Reparační procesy DNA jsou velmi komplexní a závisí na typu poškození. Jejich regulace se účastní na 200 různých genů. Mají velký význam pro nádorovou chemoterapii, protože jsou zahrnuty v rezistenci k velkému počtu cytotoxických látek, zejména těch, které nejsou ovlivněny MDR fenotypem. Tři hlavní typy reparace DNA: Reverze poškození - nejjednodušší biochemický pochod obnovující integritu DNA. 06 - alkylguanin DNA alkyltransferáza přispívá hlavním dílem k rezistenci k alkylaěním činidlům - inhibice enzymu významně zesiluje cytotoxické účinky látek. Bohužel, tento zásah může na druhé straně indukovat nádory, protože tento enzym zabraňuje karcinogenním účinkům řady molekul. Excise pošlození specifickými glykosylázami po specifickém poškození baží s následným vyříznutím DNA a doplněním pomocí polymeráz a ligáz. Exprese těchto enzymů je u rezistentních buněk pozitivně regulována. Postreplikační reparace umožňuje nápravu vážných poškození DNA. Jestliže nejsou před replikací opraveny, způsobují tato poškození replikační blok. Buňky obnovují syntézu DNA v jiném replikačním bodě. Využití inhibitorů reparace DNA může zlepšit terapii. Inhibice specifických enzymů jako je DNA polymeráza nebo topoizomeráza II. K úspěšnosti chemoterapie přispívá řada faktorů. Jsou to farmakologické faktory, které zabraňují adekvátní expozici látkou v místě působení: způsob podávání léku - koncentrace a doba a dále morfologické podmínky -absorpce, metabolismus, vaskularita a okysličování tkáně. Kromě těchto faktorů, které mohou být ovlivněny přizpůsobením režimu, existují různé buněčné mechanismy odpovědné za nízkou či vysokou hladinu rezistence. a M DR cells b Tumour stem cel Figure 21 Models of tumour d rug resistance, a | In the conventional model of tumour-cell drug resistance, rare cells with genetb alterations that confer multidrug resistance (MDR) form a drug-resistant clone (yellow). Following chemotherapy, these cells survive and proliferate, forming a recurrent tumour that is composed of offspring of the drug-resistant clone, b | In the cancer-stem-cell model, drug resistance can be mediated by stem cells. In this model, tumours contain a small population of tumour stem cells (red) and their differentiated offspring, which are committed to a particular lineage (blue). Following chemotherapy, the committed cells are killed, but the stem cells, which express drug transporters, survive. These cells repopulate the tumour, resulting in a heterogeneous tumour composed of stem cells and committed but variably differentiated offspring, c | In the 'acquired resistance" stem-cell model, the tumour stem cells (red), which express drug transporters, survive the therapy, whereas the committed but variably differentiated cells are killed. Mutation(s) in the surviving tumour stern cells (yellow) and their descendants (purple) can arise (by mechanisms such as point mutations, gene activation or gene amplification), conferring a drug-resistant phenotype. As in model a, the stem cell with the aquired mutations could be present in the population before therapy, d | In the 'intrinsic resistance' model, both the stem cells (yellow) and the variably differentiated cells (purple) are inherently drug resistant, so therapies have little or no effect, resulting in tumour growth. Některé parametry lékové rezistence Host Tumor Resistance \ Factor Determinant Mechanism Intrinsic / (Innate) \ Acquired (Adaptive) Drug concentration Primary target Target-associated pathways; • repair »checkpoints apoptosis Figure 1 Some of the parameters involved in drug resistance Determinanty dodání léku do cílového místa Systemic circulation Circulation-tissue interface (for example, blood-brain barrier) Target tissue CijS? o o o Enterocyte Small intestine O Drug □ Metabolite ■► Processes that decrease drug delivery to targets ^^ Processes that enhance drug delivery to targets Determinanty působení léku v cílovém místě Removal • Metabolism * Elimination V O O Q Delivery • Absorption • Distribution Other molecules that determine the biological context in which drug-target interactions occur Variability in the target molecule J Other molecules - with which the drug interacts Target Neonkogenní a onkogenní léková rezistence NON-ONCOGENIC RESISTANCE Oncogenic resistance 1 10 100 1000 Drug concentration Figure 1 Nononeogenie and oncogenic drug resistance. Conventionally, dru;j resistance is measured by a drug concentration that inhibits cell growth and survival by a certain percent. For example, IC;o is a concentration that causes 50% decrease in cell survival (e.g. in drug-.sensitive cells (red line), 1C5(> is 1), In nononcogenic (blue line) resistance, the dose eytofoxicity curve is shifted tu the right. An IC5(( is increased due to a failure of a drug to inhibit its target. In contrast, in oncogenic resistance, IC5ii is normal but IC70 is not achieved. The killing curve reaches a plateau, because a drug (although normally internets with its target) does not kill the cells Dvě cesty překonání lékové rezistence a BlockoF Apoplosís Block drug target drug target _L V * Block apoptosis Figure 2 Twro ways to overcome oncogenic resistance, (a) Oncogeneic resistance. Inhibitors of apoptosis (block of apoptosis) prevent cell death, even though anticancer drug engage its target (e.g. microtubules, topoisomerases, UNA), (b) Targeting apoptotic pathways downstream of the block, (c) Inhibition of antiapoptotic pathways (releaving a block of apoptosis) restores sensitivity to anticancer drugs Antiangiogenní terapie Angiogenic factors W mild HypoKid angiogenic Ami HI F agent Hypoxia- activated pro-drug Deep hypoxia, Acidosis, necrosis Figure 6 Antiangiogenic therapy, (a) Targeting endothelial cells causes a HIF-dependent response. Sensing hypoxia, cancer cells stimulate angiogenesis. (h) A combination of antiangiogenic and anti-HÍF agents may cause profound anoxia and cancer cell death, which could be further enhanced by anoxia-activated prodrugs Cykloterapie Kinase inhibitor /modulator Cell survival Growth arrest Reversal of apo pt o sis-resistance y ^ Cyclo-therapeutic agent ľigure 5 Cyclotherapy. Initially, a normal cell is apoptosis prone, whereas a cancer cell is apoptosis reluctant and resistant to cyclotherapeiitic agent. A modulator such as a kinase inhibitor reverses resistance of cancer cells (see Figure 2c). Simultaneously, cells with normal cell cycle control are arrested by the same modulator and therefore 'escape' a cyclotherapeiitic agent Liposomes and gene therapy (a) Liposome vector for gene delivery Molecules used for targeting include ligands and antibodies Targeted liposome vector for gene delivery Tnphokine-activaled killer cells), which were first null cells to become LAK cells (rf), which can recognize and described in 1980,'are another experimental anticancer »cap- attack a variety of cancers, tn studies (e)lhe LAK cells, together on-Jorstudy In micef/eft), production begins with iheremoval with lnlerIeukin-2, are injected into tumor-bearing mice. Tor of the spleen from healthy animals (o). The lymphocytes in the study in humans {right), rj-mphocytes arc isolated from tbe spleen arc isolated (fc) and cultured for three days Mth inter- bloodstream (a) and cultured with intcrkukiti-2 (ir) to generate leuldn-2(n.-2)(c).ahonnonelike product of Tcells. During that LAK cells (c). Mien patients are treated id), about SO billion time the interleuldn-2 causes certain lymphocytes known as LAK cells are infused intravenously along with intcrlcckin-2. TIL'S (tumor-infiltrating lymphocytes) vyžadují víc než měsíc přípravy před aplikací pacientům TIL'S, which seem to be more potent than LAK cells, take a month or more to generate for administration to patients. After a nodule of cancerous tissue is removed from a patient (a), cells in the nodule are separated from one another by enzymes and then cultured with interleuldn-2 (i>K Under the influence of the interleuldn-2, lymphocytes scattered throughout the tumor—the TIL's (blue)—begin to proliferate rapidly and to attack the cancer cells (c). After a total of 30 to 45 days, the lymphocytes in the culture completely replace the tumor cells (if). Two-hundred billion of these replacement TIL'S are then infused into the patient along with additional interleukin-2 (e). Úloha p53 v predikci odpovědi k chemoterapii p53 je 53-kD jaderný fosfoprotein (393 aminokyselin) - funguje jako transkripění faktor produkt 20-kb genu lokalizovaného na krátkém rameni lidského chromosomu 17 - nádorově supresorový gen Hlavní fyziologické funkce: ► regulace bun. cyklu v kontrolních bodech Gl/S a G2/M ► indukce apoptózy ► stabilizace genomu p53 kontroluje odpověď buněk na genotoxický stres indukovaný různými podněty. Ovlivňuje růst a viabilitu přes transkripění aktivaci nebo represi řady genů - p21 (zástava růstu), gadd-45 (reparace DNA), bax, bcl-2, bcl-x, cd95 (apoptóza), mdm2 (zpětnovazebná regulace aktivity p53). Asi 60 % nádorů obsahuje mutovaný typ p53 - zvýšená stabilita, neaktivní Ztráta divokého typu (wild-type) aktivity p53 je hlavním prediktorem absence odpovědi na rádioterapii a chemoterapii u různých typů nádorů. p53 zvyšuje chemosenzitivitu podporou apoptózy na transkripci nezávislými nebo závislými mechanismy - aktivuje transkripci proapotických genů bax nebo suprimuje transkripci antiapoptických genů bcl-2. Indukce smrti přes CD95(Fas, FasL) ligandový systém může také zahrnovat cesty kontrolované p53. p53 může snižovat chemosenzitivitu podporou a) zástavy růstu závislou nebo nezávislou na p21, b) reparace DNA a diferenciace, c) zvyšováním transkripce antiapoptických genů j ako j e bcl-x. Ukazuje se, že účinky zmeneného statusu p53 na chemosenzitivitu závisejí na buněčném kontextu. Porucha funkce p53 u normálních buněk může spíše zvyšovat než snižovat chemosenzitivitu. Transformované buňky, které mají wild-type p53 mají tendenci stát se rezistentními. Účinky ionizujícího záření na normální (A) a nádorové buňky (B) (A) ionizing radiation damage repaired DNA damage ®r 9 ormal cel division induction of ^ OR p53 causes cell damage too cycle arrest extensive to repair apoptosis iB) ionizing radiation DNA \ damage cell division with damaged chromosomes tumor cell lacking p53 no cell cycle arrest massive mitotic failure and cell death TUMOR REGRESSES CANCER continued mutation, selection, and tumor evolution Figure 23-43. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. p53 protein o S NORMAL p53 > CELL ABNORMAL p53 "> CELL VIRAL VECTOR TREATMENT VIRUS INFECTS CELLS ACTIVE p52 DNA DAMAGED INACTIVE p53. DNA DAMAGED TUMOR CELL VIRUS REPRODUCES IN TUMOR CELLS BUT NOT IN HEALTHY ONES ->! p53 CAUSES SELF-DESTRUCTION y <$ß$0 w TUMOR CELLS PROLIFERATE IIIíÍIí I», TUMOR CELLS DIE P53 PROTEIN instructs a cell to kill itself if the DNA is damaged by, say, drugs or radiation. But if p53 is abnormal, it may not stop a cell with bad DNA from replicating. One way of treating tumor cells is through viruses genetically engineered so that they reproduce in cells with abnormal p53 but not in healthy cells. In principle, the virus would move unchecked only through tumor cells, killing them. Srovnávací genomová hybridizace a expresní microarray analýza Základní komponenta je fluorescenční poměrná hybridizace Tumor RNA/DNA Clones, oligos Chromosomes Decreased Increased gene copy gene copy In these processes, two nucleic acid samples to be compared are differentially labeled with reagents that fluoresce at different wavelengths. They are then hybridized along with excess, unlabeled repeat rich DNA, to the representation of the genome onto which information is to be mapped. In CGH, the representation may be either metaphase chromosomes or arrays of cloned probes. In expression microarray analysis, the representation may be arrays of cDNA clones or oligonucleotides. Ref RNA/DNA cot-1 DNA oo««ioooo ooooooooooo Fluorescenční mikrofotografie z výsledků CGH analýzy lidské línie z nádoru prsu MCF7 f CF7 DNA was labeled green and normal reference DNA was labeled red. The chromosomes were counterstained with DAPI. Thus, regions of weak hybridization appear blue, regions of increased copy number appear green and regions of decreased copy number appear red. CGH analýza pokročilého nádoru prsu Tumor genome The data are arranged along the x-axis with chromosome 20pter to the left and chromosome 22qter to the right. The green:red CGH ratio is plotted along the y-axis. The gray band indicates the region of normal variability. Thus, values above the band show significant increases in copy number and values below the band show significant decreases in copy number. PREDIKTIVNI MARKERY Proliferační aktivita a nádorový růst Růst vyjadřuje celkové zvýšení počtu buněk jako výsledek nárůstu buněk proliferační aktivitou a ztráty buněk apoptózou nebo nekrózou. Proliferační aktivita je výsledkem průchodu buněk bun. cyklem. Mechanismus odpovědný za proliferační aktivitu (P) je rychlost buněčného cyklu, která je v inverzním vztahu ke generační době (T) na jedné straně a na druhé straně je ve vztahu k podílu buněk vstupujících do cyklu - růstová frakce (G). Matematické vyjádření vztahu je P = G/T Vysoká proliferační aktivita je tak důsledkem buď velké růstové frakce nebo krátké gener. doby nebo obojího. Čas zdvojení (Td doubling time) nádoru (bez ztráty buněk) je definován jako Td = T (log 2/log (G+l) Krátký čas zdvojení je tedy výsledkem buď krátkého bun. cyklu nebo vysoké růstové frakce nebo obojího. PROLIFERAČNÍ MARKERY techniky inkorporace značených analogů nukleotidů do DNA 3H tymidin (autoradiografie) nebo bromdeoxyuridin (BrdU, imunohistochemie) markery buněk v S-fázi bun. cyklu, tj. syntetizujících DNA. Nevýhody: omezené použití in vivo, radioaktivita, dlouhé časy pro vyhodnocení, subjektivní kriteria mitotický index (MI) - nejstarší metoda vyhodnocování proliferace - mikroskopické počítání mitotických figur na preparátech, do budoucna - markery pro FCM. Mitózy však představují jen část proliferujících buněk a délka mitózyje variabilní zejména u aneuploidních nádorů. Míjen částečně koreluje s dalšími markery proliferace procento buněk v S-fázi flow cytometric - fluorescenční barvení DNA - měření fluorescence v suspenzi buněk image (static) cytometry - absorpční barvení (Feulgenova reakce) - měření buněk na sklíčku Histogramy vyjadřující obsah DNA - vyhodnocování % buněk v jednotlivých fázích bun. cyklu - počítačové programy SPF - S-phase fraction - celkem koreluje s dalšími markery (např. MI nebo Ki67) imunohistochemické stanovení antigénu spojených s proliferací PCNA - proliferating cell nuclear antigen - zvýšená exprese u proliferujících buněk - koreluje s ostatními markery, ale ne vždy. Nepříliš vhodný u nádorů, zvýšený i při reparaci DNA. Ki67 - kódovaný genem na chrom. 10 je exprimován v Gl, S a G2 fázi u proliferujících buněk - částečně koreluje s dalšími markery. DNA topoizomeráza II - exprese se rychle zvyšuje při přechodu S a G2 a snižuje se na konci mitózy. Organizátory jadérka (NORs) - segmenty DNA spojené s jadérky, které obsahují geny kódující ribozomální DNA. Přispívají k regulaci syntézy proteinů. Jsou vizualizovány barvením stříbrem - metoda AgNOR. Koreluje s SPF, Ki67 a MI MARKERY BUNĚČNÉ SMRTI AI - apopticky index Metody detekce apoptózy: morfologické hodnocení - světelná a fluorescenční mikroskopie, flow cytometric (subdiploidní pík bun. cyklu, annexin V, TUNEL) Další markery: Molekuly na buněčném povrchu: proliferace: CD71 - receptor pro transferin, receptory pro specifické růstové faktory apoptóza: CD95 (Fas) Změny protoonkogenu a nádorově supresorových genů - fosforylace RB proteinu, p53 (wild type, mutace), antiapoptický bcl-2 a proapotický bax Změny cytoskeletonu Markery neproliferujících a klidových buněk: statin Důležité: ► Otázka interpretace a klinické využitelnosti jednotlivých markem ► Standardizace metod a hodnocení mezi laboratořemi ► Problematika heterogenity nádorů ► Statické vs. dynamické stanovení parametrů, časový rozvoj ► Exprese a změny různých onkogenu mohou podmiňovat též citlivost nádorových buněk k chemo- a rádioterapii ► Postižení vzájemných vztahů jednotlivých markem ► Predikce odpovědí na léčbu Využití multivariačních analýz pro predikce - analýza základních (principal) component a diskriminační analýza. multi-variační > analýza 1 < experimentální data II N í > doplňování klinických dat existující informace pro různé typy nádorů (experimentální data 1, databáze), empirická zkušenost t závěry 1 —> vícerozměrné analýzy zobecnění pro jiné situace, jiné typy nádorů, zlepšená predikce a terapie t sporne výsledky konstrukce modelu přehodnocení pomocí biomatematických přístupů experimentálni verifikace částečných nesrovnalostí na modelech in vitro