APOPTOZA RNDr. Alena Vaculová, Ph.D Laboratoř cytokinetiky Biofyzikálni ústav AV ČR přednáška 9.5.2006 - programovaná buněčná smrt - termín poprvé použil australský patolog J. F. Kerr v roce 1972, aby odlišil jinou formu buněčné smrti než je nekróza - název odvozen z řečtiny, znamená „padaní listi - od 70. let intenzívní výzkum apoptozy a její regulace - geneticky kontrolovaný komplexní proces programované buněčné smrti, cílená sebedestrukce buňky - obrovský význam ve vývoji a udržení homeostáza mnohobuněčného organismu ztráta integrity plazmatické membrány bobtnání cytoplazmy a zvětšení buňky rozbití jádra desintegrace buněčných organel kompletní lyže buňky >gie-apoptóza bobtnaní cytoplazmatické membrány, integrita membrány není porušena zmenšení velikosti buňky kondenzace a specifická fragmentace jaderného chromatinu udržení integrity intracelulárních organel formace tzv. apoptotických bodies Necrosis o o Duím 8 S Biochemie - nekroza vs. apoptoza Bez účasti specifických molekul Pasivní proces bez dodání energie z ATP Neregulovaná destrukce jaderné DNA Není specifická role mitochondrií Ztráta regulace iontových rovnováh Aktivace specifických molekul Nutné dodání energie ve formě ATP Specifická fragmentace jaderné DNA Uvolnění specifických regulátorů z mitochondrií Změny symetrie membrán Fyziologický význam -nekróza vs. apoptoza Postihuje skupiny buněk Indukována nefyziologickými stimuly Poškození okolní tkáně - vylití toxických látek Spouští zánět Týká se jednotlivých buněk Indukována fyziologickými stimuly Fagocytóza makrofágy Není zánět ^**». Induktory bunečné smrti -nekróza vs. apoptóza Hypoxie Extrémní výkyvy teploty Osmotický tlak Silné změny pH Lytické viry Metabolické jedy Atd. Nedostatek růstových faktorů Hormonální změny Specifické signály smrti - „death Ugandy" Chemoterapie UV-záření Ztráta kontaktu s prostředím Význam apoptózy Eliminace nepotřebných, poškozených, nebezpečných, mutovaných či jinak pozměněných buněk za účelem udržení homeostázy mnohobuněčného organismu Studium apoptozy v mnohobuněčném organismu ■ Caenorhabditis elegans (Nematoda) - první a velmi sofistikovaný model studia PCD Přesně řízený vývoj - organismus z 1090 buněk, z nich během vývoje 131 buněk umírá apoptózou - nutno přesné načasování a lokalizace, jinak vážné malformace Jeden z nejvíce studovaných organismů z hlediska popisu mechanismů apoptozy, podobnost s obratlovci (výskyt analogických apoptotických genů a proteinů) Apoptoza ve vývoji mnohobuněčného organismu Metamorfóza hmyzu - vývoj i mága z larvy Metamorfóza obojživelníků a lazů - ztráta ocasu pulců během proměny v žábu (postupná řízená indukce apoptózy a proměna tvaru těla) Apoptoza ve vývoji mnohobuněčného organismu odumírání některých neuronů při vytváření CNS formace tvaru orgánů a struktur - prsty a interdigitální prostory odstranění abnormalit během embryogenéze (včetně spontánních abortů) Apoptoza v regulaci homeostazy organismu Eliminace starých diferencovaných nepotřebných buněk (krevní, střevní, Eliminace již nepotřebných buněk mléčné žlázy po ukončení laktace Regulace endometria během menstruačního cyklu Odumření poškozených zárodečných buněk Apoptoza versus proliferace Pro udržení homeostazy organismu je nutná dokonalá rovnováha mezi Porušení této rovnováhy má dalekosáhlé důsledky, které se odrazí na zdraví organismu Obzvláště nutné pro intenzívne ^ proliferující tkáně (krev, střevo...) Rakovina AlO homeostáza AIDS neurodegenerativní onemocnění Apoptoza a nemoci -zvýšená vs. snížená apoptoza Neurodegenerativní onemocnění (Alzheimer,Parkinson) Myelodysplastický syndrom Ischemické poškození (infakrt, reperfuze) Intoxikace jater Rakovina Autoimunitní onemocnění Virové infekce (Herpes, Adenovirus) Obecne rysy apoptozy Změny na úrovni membrán Změny na úrovni jádra Účast specifických genů a proteinů v regulaci apoptozy Změny na úrovni membrán Plazmatická membrána - Zachována integrita plazmatické membrány - Významné změny v symetrii membrány ■ Translokace fosfatidylserinu z vnitřní strany membrány na stranu vnější - signál pro fagocyty, které mají na povrchu specifické receptory pro PS Ann&*in V-PE Conjugate Plasma membrane Ca<+ Ľa" ca" Apo ptosis ---------------► Eťt&ľna lízati on üi phosphatidyl serins Cytoplasm Cytoplasm Změny na úrovni membrán Mitochondrialni membrána -změny propustnosti vnější membrány mitochondrií, tvorba pórů v této membráně -významné změny mitochondriálního membránového potenciálu - umožnění vylití některých důležitých Imediátorů apoptozy z mitochondrií do cytoplazmy ^ Změny na úrovni jádra Kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu, shlukování jaderné hmoty v okolí jaderné membrány, charakteristická jaderná morfologie Změny na úrovni jádra Specifická nzena degradace DNA -internukleozomální štěpení DNA - vznik charakteristických fragmentů DNA o délce 180 bp - účast specifických endonukleáz (Ca- a Mg- dependentních) -historie protein -DNA nucleosome- Linksr-DNA Core-ONA Htíion& H2ArH3Br H3, H4 5.5 nrn > ^-ünker-DNA Účast specifických genů a proteinů v regulaci apoptozy Kaspázy Inhibitory kaspáz Nekaspazove proteazy Proteiny rodiny Bcl-2 Mediatory apoptozy uvolňované z mitochondrií Kasoáz - Cysteinove proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové - Klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu - v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy) v cytoplazme, štěpení - aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. „death substráty" a významně se tak podílet na šíření apoptotického signálu a exekuci apoptózy - struktura: - Prodoména - Katalytické podjednotky - velká a malá (heterotetramer) Dělení kaspáz: Iniciační kaspázy (dlouhá prodoména) - kaspázy-8, -9 Efektorové kaspázy (krátká prodoména) - kaspáza-3, -6, -< Kaspázy účastnící se zánětu Aktivace kaspáz: iniciační kaspázy: na úrovni specifických signálních komplexů, zde ukotven; pomocí dlouhé prodomény DISC - „death-inducing signaling complex" - kaspáza-8 apoptozom - kaspáza-9 efektorové kaspázy: není nutná účast specifických komplexů, proteolyticke štěpení pomocí iniciačních kaspáz Iniciační kaspázy 4 ▼ Caspase-8 | DED |—| DED |^ Large Small i U CARD Large Small Caspase-9 Kaspáza-8 -iniciační kaspáza aktivovaná na úrovni signálního komplexu DISC - aktivace tzv. „vnější dráhy indukce apoptózy" -v DISCu se prokaspáza-8 (55/57) štěpí na kaspázu-8, vznikají fragmenty o velikosti 41/43 a 18 kDa (dvojkrokový mechanismus aktivace) - FLIP - inhibitor kaspázy-8, brání její aktivaci, neboť se sám váže do DISCu - aktivní kaspáza může dále aktivovat dvě základní dráhy (přímá aktivace kaspázy-3, dráha závislá na ^ mitochondriích - protein Bid) DED DED ^ ^ ------------- N 1 ________ N^ Caspase-8 activation Kaspáza-9 iniciační kaspaza aktivovaná na úrovni signálního komplexu zvaného apoptozom Složení apotozomu - cytochrom c, Apaf-1, prokaspáza-9, ATP aktivace tzv. „vnitřní dráhy indukce apoptózy" prokaspáza-9 se štěpí na kaspázu-9, vznikají fragmenty o velikosti 35 a 17 kDa Efektorové kaspázy Podílí se na exekuční fázi apoptózy Specificky štěpí celou řadu důležitých substrátů v buňce Substráty kaspáz Strukturami proteiny - laminy (jadro), aktin, fodrin (cytoskelet), keratin 18 (intermediární filamenta) Signaini a regulační proteiny - cPI_A2, PKC, některé proteiny rodiny Bcl-2, MEKK-1 Transkripční faktory - MDM2, RB Proteiny v regulaci metabolismu DNA/RNA -PARP, CAD inhibitor (inaktivace DNázy **^ závislá na kaspázách) PolvŕADP-ribosvl) polymerase ÍPARP Jaderný protein (113 kDa), opravy DNA Během apoptozy specificky štěpený na fragmenty 89 a 24 kDa - citlivý marker pro detekci apoptozy Inaktivace PARP blokuje opravu DNA, posílení fragmentace DNA DNA strand nicks PARP activation NAD+ Poly(ADP- 4 ribosyl)ation Energy metabolism massive DNA disruption PARP OVERACTIVATION NAD+ Poly(ADP-f ribosyl)ation nergy allure CELL DEATH Inhibitory kaspáz FLIP - ma sekvenci podobnou kaspaze-8, ale bez katalytického místa, kompetitivně inhibuje vazbu kaspázy-8 v DISCu lAPs - „inhibitor of apoptosis p/oteins" -clAP1, clAP2, XIAP, survivin - váží se na prokaspázy a kaspázy (prostřednictvím domény BIR) a blokují jejich aktivitu, mohou inhibovat jak iniciační, tak efektorové kaspázy - různé mechanismy ^** Nekaspázové proteazy Calpainy (I, II, calpastatin) Cathepsiny (B, D, L) Granzymy (A, B) Mohou buď spolupracovat s kaspázami, nebo spouštět buněčnou smrt nezávisle na nich Calpainy Cytosolove cysteinove proteázy Aktivace závislá na vápníku (|uM, mM), mají vazebné domény pro Ca2+, autolyze a autoaktivace |Li-calpain (calpain I), m-calpain (calpain II), calpastatin (inhibitor calpainů) Glutamate NMDA CALPAIN t C yt os kel eta I Breakdown t Membrane Damage CaM Kinase II Cathepsiny Lysosomální proteázy Aktivovány v kyselém pH (lysosom) -autoproteolyza, nebo jinými proteázami Nejznámější - cathepsin B, D Během apoptózy translokovány z lysozomu do cytoplazmy - exekuce apoptózy Granzynrr Sen nove proteazy T-bunek a NK-bunek Spolu s perforin em se podílejí na indukci buněčné smrti (perforin vytvoří póry v buňce, umožní průnik granzymu Granzym B se může účastnit aktivace kaspáz nebo DNáz Proteiny rodiny Bcl-2 Důležité regulatory apoptozy na úrovni mitochondrií Rodina asi 30 proteinů, pro něž je charakteristická přítomnost tzv. domény BH (Bcl-2 homology), které zprostředkovávají interakce s jejich vazebnými partnery Patří sem proteiny jak s proapoptotickou, tak antiapoptotickou funkcí, na jejich rovnováze pak závisí osud buňky Proteiny rodin Bcl-2 Regulace mitochondriální dráhy indukce apoptózy Bcl-2-like survival factors BH4 BH3 BH1 -CZh -cd—nzt Bax-like death factors BH2 membrane anchor r-m -cd—izzi----czh-czh Bcl-2 Bcl-x, Mcl-1 BH3 BH1 BH2 I I I I III Bax -----------------nz\—i CD— -------CD—EZ > Bak BH3-only death factors - V nepřítomnosti apoptotického signálu jsou proteiny Bcl-J rodiny lokalizovány v různých subcelulárních kompartmentech - antiapototické proteiny - integrální membránové proteiny - mitochondrie, endoplazmatické retikuluk, jádro - proapoptotické proteiny - cytosol, cytoskelet - apototický stimulus má za následek jejich konformační změny a translokace, především do mitochondrií - na úrovni mitochondriální membrány pat dochází ke vzájemným interakcím pro- a antiapoptotických proteinů této rodiny ^ - velký význam v regulaci propustnosti membrány, membránového potenciálu a vylití specifických mediátorů apoptózy z mitochondrií do cytosolu Death blocker Bcl-2 Cell death signal Death inducer CHECKPOINT Bax Death signal blocked i CELL SURVIVAL Death signal promoted i CELL DEATH Bcl-2 B-cell lymphoma 2 protein Bcl-2 byl první popsaný člen této rodiny (po něm pojmenována) a zároveň první popsaný savčí regulátor apoptózy Antiapoptotický protein Obrovská úloha v rezistenci nádorových buněk k některým typům chemoterapeutik Mcl-1 - Myeloid cell leukemia 1 protein - Antiapoptotický protein z Bcl-2 rodiny - Úloha v regulaci diferenciace a apoptózy - Krátký poločas rozpadu, „short-term viability protection", po vstupu do apoptózy jeho hladina v buňce prudce klesá, což může ovlivnit spuštění mitochondriální dráhy indukce apoptózy - translokaci Bax, uvolnění cytochromu c, Smac/DIABLO, aktivaci kaspáz... Bid ■ proapoptotický protein ■ obrovský význam v integraci signálů dvou základních drah indukce apoptozy - „vnější a vnitřní" ■ spojení receptorove dráhy indukce apoptozy a mitochondrii, regulace vylití cytochromu c z těchto organel a následné aktivace mitochondriální dráhy Caspase-8 (22kDa) tBid (15kDa) Inactive form cytoplasm Active form mitochondria Initiation and regulation of apoptosis RGceptor Mediated Events Cytotoxic Stress Radiation Chemical Mutagens Fas/AP01/CD95 Procaspase-8 Effector Caspases Caspases 3, 6. 7 centra buněčného dýchání, energetická centra buňky složení: vnější membrána - semipermeabilní (5 kDa), kanálky (porin) vnitřní membrána - nepropustná, pouze selektivní transport, bohatě členěná (kristy - zvětšení povrchu -syntéza ATP), zde ukotveny proteiny - součásti elekron-transportního řetězce, transport elektronů a syntéza ATP intermembránovy prostor (enzymy, proapoptotické proteiny) matrix - vysoce koncentrovaná směs enzymů, DNA, ribozomy, citrátový cyklus Úloha mitochondrií v aooDtóze - Změny v transportu elektronů - Změny energetického metabolismu buňky - Změny v produkci ROS - Změny mitochondriálního membránového potenciálu - Účast proteinů rodiny Bcl-2 (Bid, Bak, Bax...) - Uvolnění proapoptotických proteinů Mediatory apoptozy uvolňované z mitochondrií Cytochrom c - aktivace kaspázy-9 na úrovni apoptozomu Smac/DIABLO - inhibuje lAPs - přispívá tak k aktivaci kaspáz endoG -mitochondriální nukleáza, translokuje se do jádra, kde štěpí DNA Omi/Htra - serinova proteaza, antagonista některých lAPs AIF - translokován do jádra, iniciace řady ** procesů apoptozy včetně např. kondenzace chromatinu Cell Death Sensitization Chnatŕi ^ignal-K SmaĽ/DlABLU 0 HtrAZ'Qni Caü.-CaD LDFKjCúnipleK CAD [DFF4CI] C EndaŮ říutleus DNA Fragmentation Apoptoza zprostředkovaná pres povrchové receptory Tzv. „death receptory" - receptory smrti, přes ně dochází ke spuštění Patří do rodiny TNF (tumor necrosis factor) Obsahují tzv. „death doménu", která umožní pokračování přenosu apoptotickeho signálu (vazba s dalšími členy signální dráhy) Významné ligandy a receptory rodiny TNF CD95L (FasL) - CD95, Fas TNF-alfa-TNF-R1 TRAIL - DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG TNF-a, FasL, TRAIL - členové rodiny TNF - úloha v imunitních a zánětlivých reakcích organismu, v regulaci proliferace, diferenciace a apoptózy -podobnost apoptotickych signálních drah (oligomerizace receptoru, adapterový protein, death doména, iniciační kaspáza) - vazba na tzv „death receptory" (TNFR1, Fas -CD95, TRAIL-R1, TRAIL- TNF-a, FasL, TRAIL - cytotoxické a antiproliferační působení na řadu buněčných linií alternativa ke konvenčním léčebným postupům využívajícím chemoterapii a ionizující záření - omezení: - vedlejší účinky, rezistence Systémová aplikace - NF-a, anti-Fas TRAIL - TNF-a, anti-Fas - silná zánětlivá odpověď, poškození jaterních buněk - TRAIL - výhoda, selektivní toxicita, většina normálních buněk rezistentní k jeho účinkům, otázka - hepatocyty -in vivo - intravenózni infuze, vysoké I dávky - myši, primáti (šimpanzi) - bez toxických vedlejších efektů, co člověk? TRAIL selektivní indukce apoptozy u celé řady nádorových buněk, ne však u většiny normálních TRAIL receptor ind dccov rtccptura T DR4 / DR5 : DcK2 * ~***##**rf Á AÁÁÍ * i I *-« (na rozdíl od TNF, Fas) • možnost interakce s pěti různými receptory TRAIL-R1 (DR-4, APO-2) TRAIL-R2 (DR-5, TRICK, Killer TRAIL-R3(DcR1) TRAIL-R4 (DcR2, TRUNDD) TRAIL-R5 (osteoprotegerin) TRAIL „death receptor" Prokaspáza-8 Kaspáza-8 FADD Buněčná membrána Mcl-1 Bcl-2 Bax tBid Bak Mitochondrie dATP Cytochrom c Apaf-1 Efe kto rove kaspázy Prokaspáza-9 Kaspáza-9 Kaspáza-6 Kaspáza-3 jádro Modelový syste apoptozy Epitel střeva, střevní krypta DIFFERENTIATION Fully differentiated terminal cells Pro! if e rati ng /d ifferenti ating »lis Stem cells m o REPLICATION V^V STAGES O O o PROLIFERATION Modelový system pro studium apoptózy - in vitro Buněčná kultura na Petriho misce -adherentní epitheliální buňky kolonu Postupné uvolňování původně přisedlých buněk do média, apoptóza, apoptotická tělíska v umělé in vitro kultuře nejsou přítomny fagocyty, aby je pohltily, ^ může proto docházet k tzv. sekundární nekróze VÝZKUM APOPTOZY Výzkum zabývající se problematikou apoptozyje velmi aktuální a rozvíjející se oblastí vědy. Má možnosti široké aplikace jak v základním výzkumu, tak v klinické praxi. Regulace průběhu buněčné smrti patří mezi klíčové funkce nutné pro udržení normálních funkcí organismu. V případě jejího porušení může docházet k nekontrolovatelnému úbytku buněk nebo naopak k jejich akumulaci v organismu (např. při nádorovém onemocnění). ^ Důkladné pochopení mechanismů apoptozyje proto nutným předpokladem pro úspěšnou terapii řady onemocnění. Apoptóza vs. léčba rakoviny Možnost spustit apoptozu nádorové buňky je základní podmínkou úspěšné protinádorové terapie Řada nádorových buněk je však vůči apoptóze rezistentní Je nutné objasnit mechanismy rezistence a překonat ji (nová léčiva, spuštění alternativních mechanismů, kombinovaná terapie, genová terapie.. Tumor Diagnosis -*► Biopsy 1 Apoptotic Responsiveness (gene expression of p53, bcl-2, bax, etc.; sensitivity to apoptotic stimuli; basal level of apoptosis- etc.) Sensitive to Apoptotic Stimuli Resistant to Apoptotic Stimul Standard Treatment *■*-{aurgerytchemo» radio, i mmu no-therapy, etc.) Gene Therapy lo Restore sensitivity (e.g. p53, bax, etc.) Vliv narušení (stimulace/inhibice) průběhu apoptozy v rámci procesu vícestupňové karcinogeneze stimulace apoptozy oprava poškozeni buňka s poškozenou DNA iniciovaná buňka m pozmenené ložisko tkáně Růstové zvýhodnění a genetická nestabilita inhibice apoptozy Děkuji Vám i^i za pozorn< ost! fWM