1. úloha. Izolace restrikčních endonukleáz z bakteriálních buněk
Restrikční endonukleázy (RE) jsou součástí restrikčně modifikačních systémů řady
bakteriálních druhů. Jednou z jejich funkcí je degradace cizorodé DNA. Izolace RE z
bakteriálních buněk je poměrně jednoduchá a obecně ji lze rozdělit do následujících kroků:
1. Kultivace bakteriálních buněk. Baktérie se pomnoží v tekutém živném mediu do
exponenciální až pozdně exponenciální fáze růstu (růstové podmínky - tj. složení živného
media a teplota - se zvolí podle konkrétního organismu).
2. Shromáždění buněk. Buňky se zcentrifugují při nízkých otáčkách a promyjí vhodným
pufrem.
3. Lyza buněk. Buňky se zlyzují pomocí enzymů (někdy jen částečně nalyzují) a rozbijí. K
lyzi buněk se nepoužívají detergenty (denaturace proteinů). K rozbití buněk se používá
několika způsobů, z nichž nejčastější jsou:
- osmotický šok
- drcení buněk (balotina, skleněný prášek, oxid hlinitý aj.)
- sonikace (představuje univerzální a nejpoužívanější způsob rozbití buněk)
4. Přečištění lyzátu. Lyzát se zbaví zbytků buněčných stěn a ribozómů centrifugací při
vysokých otáčkách.
5. Odstranění nukleových kyselin (před odstraněním jsou NK substrátem řady nespecificky
působících nukleáz a vedou ke zvýšení relativního podílu RE). NK se odstraňují
vysražováním se streptomycinsulfátem nebo polyetyléniminem. Vzniklý precipitát se
odstraní centrifugací. Zbytky streptomycinsulfátu a nízkomolekulární látky se odstraní
dialýzou, případně promytím lyzátu na chromatografické koloně (např. heparin-agaróze).
Takto lze RE rovněž zakoncentrovat.
7. Uchovávání extraktů. RE lze skladovat buď bez purifikace a zakoncentrování při 4°C (jako
tzv. hrubý lyzát), nebo po pročištění a zakoncentrování ve vhodném pufru s 50% glycerolem
při -20°C.
Poznámky k izolaci:
1. Během izolace nesmí teplota překročit 10°C (inaktivace RE!)
2. Sonikační roztok obsahuje merkaptoetanol, který je zdraví škodlivý!
3. Je vhodné k práci použít sterilní materiál; kontaminace mikroorganismy může vést k
degradaci RE.
4. Při práci s ultrazvukem je třeba dodržovat bezpečnostní předpisy.
Izolace restrikčních endonukleáz Sau3AI a Sau96 z buněk S. aureus
Organismy: Bakteriální kmen Staphylococcus aureus PS 3A a S. aureus PS96.
Fág 3A, 96, lambda (nebo jejich DNA).
Materiál: Živný bujon (500 ml), promývací pufr (0,05 M TRIS.Cl, 0,015 M Na3citrát, pH
7,4), lyzostafin (200 U/ml), sonikační pufr (0,01 M TRIS.Cl, 0,01 M 2-merkaptoetanol),
streptomycinsulfát (10% zás. roztok v sonikačním pufru), dialyzační hadice, agaróza, TAE
elektroforetický pufr, nanášecí barvivo pro elektroforézu.
Přístroje: termostat, centrifuga T23, ultracentrifuga UP65, ultrazvukový sonikátor, zařízení
pro elektroforézu, transiluminátor.
Postup
1. 500 ml bujonu naočkujeme 25 ml 18h/37 °C bujonové kultury příslušného bakteriálního
kmene a necháme inkubovat přes noc při 37 °C.
2. Buňky zcentrifugujeme v centrifuze T23 při 6000 ot/min při 4°C, 10 min. Sediment buněk
zvážíme (očekávaná hmotnost 2-3 g, minimální požadovaná hmotnost 1,5 g).
3. Sediment promyjeme promývacím pufrem (1×) a zcentrigujeme jako v bodě 2) a
resuspendujeme v 10 ml promývacího roztoku.
4. Přidáme roztok lyzostafinu do výsledné koncentrace 5U/ml a inkubujeme 15 min při 37 °C
za občasného promíchání. Nesmí dojít k úplné lyzi - kontrolujeme vizuálně.
5. Buňky zcentrifugujeme 10 min při 5000 ot/min a 4 °C a sediment resuspendujeme v 10 ml
sonikačního pufru.
6. Buněčnou suspenzi vychladíme v ledové vodní lázni (5 min) a buňky rozbijeme
ultrazvukem (10× 30-sekundových intervalů - průběžně chladíme tak, aby teplota
nepřekročila 10 °C !)
7. Buněčné zbytky a ribozómy odstraníme centrifugací 1 hod při 35 000 ot/min , 4 °C v
centrifuze UP65 (rotor 8x11 ml).
8. K supernatantu přidáme roztok streptomycinsulfátu do výsledné koncentrace 1% a
ponecháme 1 hod při 4 °C. Sraženinu zcentrifugujeme 10 min při 30 000 ot/min, 4 °C na
centrifuze UP65 (rotor 8× 11 ml).
9. Supernatant přeneseme do připravené dialyzační hadice (vařit 10 min. v roztoku uhličitanu
sodného a potom 2× v destilované vodě) a dialyzujeme proti sonikačnímu pufru přes noc
(4°C, 3× 500 ml pufru).
10. Jemný precipitát odstraníme centrifugací (5000ot/10 min, 4°C) a supernatant přeneseme
do sterilní zkumavky a rozdělíme do několika alikvotních částí. Takto připravený hrubý
extrakt uchováváme při 4°C (zůstává aktivní po dobu nejméně 1 roku).
11. Stanovíme aktivitu restrikčních enzymů přítomných v hrubém extraktu.
Stanovení aktivity restrikčních endonukleáz Sau3AI a Sau96
Restrikční endonukleázy Sau3A a Sau96I štěpí DNA fága lambda a rovněž DNA
stafylokokových bakteriofágů, které byly propagovány na kmenech S. aureus nesoucích
restrikčně modifikačními (RM) systémy odlišné od RM systémů přítomných v kmenech
PS3A a PS96. Této skutečnosti lze využít k důkazu endonukleolytické aktivity enzymů
přítomných v hrubých extraktech připravených v úloze č. 1.
Materiál: Hrubé extrakty připravené v úloze č. 1, DNA fága lambda (1 mg/ml), DNA
stafylokokových fágů 3A, 96 a 71 (konc. 200-500 g/ml), 50× konc. TAE elektroforetický
pufr, agaróza, štěpící pufr 10× koncentr., 6× konc. nanášecí barvivo,
Přístroje a zařízení: mikrocentrifuga, termostat, Eppendorfovy zkumavky, automatické pipety
a špičky, zařízení pro elektroforézu, transiluminátor, fotoaparát.
Postup
1. Do Eppendorfovy zkumavky napipetujeme:
- 10 l sterilní destil. vody
- 5 l roztoku DNA fága (lambda, případně některého ze stafylokokových fágů) (asi 1 g)
- 3 l hrubého extraktu izolovaných RE
- 2 l 10× konc. štěpícího pufru (aktivitu ověřujeme v pufrech A, M a MULTI-CORE)
Současně založíme reakční směs, v níž je hrubý extrakt nahrazen destil. vodou
2. Směs dobře promícháme pipetou a zcentrifugujeme 1 min.
3. Inkubujeme 2 hod při 37 °C.
4. Zahřejeme 5 min při 56 °C a necháme pomalu ochladit na pokojovou teplotu
5. Přidáme 3 ml nanášecího barviva a dobře promícháme pipetou
6. 20 ml roztoku naneseme na 0,7 % agarozový gel a provedeme elektroforetické rozdělení
(3-4 hod při 40 mA)
7. Gel přeneseme do barvící lázně (TAE pufr obsahující 1 mg etidiumbromidu/ml) a necháme
barvit 0,5 hod.
8. Gel opláchneme destil. vodou (5 min) a pozorujeme pod UV světlem. Pořídíme
fotografický záznam.
Poznámky:
1. Etidiumbromid je mutagen - pracujeme v rukavicích a na vyhrazeném místě.
2. Při práci s UV světlem chráníme oči a pokožku
3. úloha. Úprava konců DNA prostřednictvím PCR a klonování ve
vektorech řady pBluescript
Příprava kompetentních buněk pro transformaci
Jako recipientních kmenů pro klonování cizorodé DNA se nejčastěji využívá kmenů E. coli,
které byly mutacemi a metodami genového inženýrství upraveny tak, aby byly schopny s
vysokou účinností přijímat externí DNA (většinou plazmidovou), umožňovaly její replikaci a
udržovaly její původní strukturu (tj. nezpůsobovaly vyštěpování naklonované DNA) a
dovolovaly selekci rekombinantních plazmidů. Podrobná charakteristika těchto kmenů
(zejména jejich genotyp) bývá uváděna v katalozích firem a praktických příručkách.
Vlastní navození kompetence spočívá v pomnožení buněk příslušného kmene E. coli v
tekutém živném mediu (např. LB bujonu) do exponenciální fáze růstu, převedení buněk do
roztoku CaCl2, v němž se buňky ponechají několik hodin, během nichž dojde k jejich
vyhladovění a určitým změnám v buněčné stěně, umožňujícím přijmout externí DNA.
Takto připravené buňky lze použít buď bezprostředně, nebo se převedou do roztoku CaCl2 s
přídavkem glycerolu, v němž je možné buňky zamrazit na -70°C a použít později (takto
připravené buňky lze uchovávat několik měsíců nebo i déle).
Organismy: Bakteriální kmen E. coli DH5
Materiál: LB bujon, sterilní roztok 0,05 M CaCl2, sterilní centrifugační zkumavky, kolorimetr
s příslušenstvím, chlazená centrifuga T23
Postup
1. 20 ml LB bujonu v Erlenmayerově baňce naočkujeme 2 ml bujonové kultury (18
hod/37°C) a inkubujeme při 37°C na vodní třepací lázni do hustoty suspenze OD600 = 0,3.
2. Buněčnou kulturu vytemperujeme na 0°C v ledové vodní lázni a centrifugujeme 10
min/3000 ot/min při 4°C. Od této chvíle nesmí teplota překročit 4°C!
3. Sediment buněk resuspendujeme v polovině objemu ledového roztoku CaCl2 a ponecháme
v lednici při 4°C přes noc.
4. Buňky zcentrifugujeme jako v bodě 2) a sediment resuspendujeme ve 2 ml (obecně v 1/10
výchozího objemu kultury) roztoku CaCl2.
5. Takto připravené kompetentní buňky lze používat přibližně jeden týden. Pro dlouhodobé
uchovávání se k buněčné suspenzi přidá 1/10 objemu sterilního glycerolu (4°C!) a suspenze
se zmrazí na -70°C.
Příprava plazmidového vektoru pBluescript ke klonování
Jedním z běžně používaných vektorů pro klonování v E. coli je bakteriální plazmidový vektor
pBluescript. Jeho polylinker (obsahuje cílová místa pro 16 restrikčních endonukleáz) je
umístěn v části genu lacZ kódující proximální část polypeptidu beta-galaktozidázy, což
umožňuje použít k odlišení rekombinantních a nerekombinantních plazmidů
alfa-komplementace. Gen pro rezistenci k ampicilinu je využíván pro selekci transformant.
Jako hostitelské kmeny pro tento plazmidový vektor jsou používány kmeny E. coli. Pro
klonovací experimenty je nutné použít kmenů, které jsou schopny alfa-komplementace (tj.
nesoucí mutaci lacZ M15), např. E. coli DH5, JM83, JM101, NM522 aj.
K izolaci DNA vektoru je možné použít několika metod, poskytujících DNA o různém
množství a čistotě. Optimální je připravit DNA purifikovanou přes kolonku (spin columns) s
využitím některého komerčního kitu. Je možné však vycházet i z preparátů, připravených
některou z mikrometod, při nichž se získá DNA v množství několika g s dobrou citlivostí ke
štěpení restrikčními endonukleázami a účinně spojovaná ligázou.
Naštěpení vektoru restrikční endonukleázou
Materiál: Eppendorfovy zkumavky, mikrocentrifuga, automatické pipety, špičky, zařízení pro
elektroforézu, transiluminátor, restrikční endonukleázy, štěpící pufry, sterilní destil. voda, TE
pufr, 70% a 100% etanol, QiaQuick PCR purification kit, purifikovaná DNA vektoru
pBluescript, restrikční endonukleázy EcoRI a BamHI.
Nejdříve stanovíme orientačně koncentraci vektoru: 2 l roztoku DNA smícháme s 48 l TE
pufru a stanovíme absorbanci při 260 nm. Z naměřené hodnoty odhadneme koncentraci
DNA.
6 g DNA vektoru pBluescript naštěpíme v objemu 40 l reakční směsi příslušnou dvojicí
RE (2 hod), abychom zabránili znovuspojení přečnívajících konců.
2 l reakční směsi naneseme na agarozový gel a zkontrolujeme, zda je naštěpení vektoru
úplné.
K reakční směsi přidáme 40 l TE pufru a provedeme purifikaci DNA (viz QIAquick PCR
Purification Kit Protocol). Nakonec DNA rozpustíme v 30 l elučního pufru a uložíme při
-20°C.
Příprava cizorodé DNA pro klonování ve vektoru pBluescript
Jako cizorodou DNA lze pro klonování v pBluescriot vektorech použít DNA z jakéhokoliv
organismu za předpokladu, že je tato DNA nativní a lze ji štěpit některou z restrikčních
endonukleáz, jejíž štěpné místo se nachází v polylinkeru (velikost restrikčních fragmentů,
které lze naklonovat, je max. asi 10 kbp). DNA, která není žádnou z těchto RE štěpena, by
bylo nutné nejdříve upravit tak, aby její konce byly s některou z RE kompatibilní - např.
připojením spojek, adaptoru nebo modifikací konců prostřednictvím PCR.
K naklonování lze použít DNA, která byla štěpena buď jednou RE, nebo dvěma různými RE
- v tomto případě dojde k tzv. orientovaném začlenění restrikčního fragmentu do vektoru, což
má řadu výhod, např. umožňuje restrikční mapování a sekvencování z definovaného konce.
Použití DNA štěpené dvěma enzymy zabraňuje její cirkularizaci a zvyšuje pravděpodobnost
vzniku rekombinantních plazmidů při ligaci vektorové a cizorodé DNA.
Materiál: DNA vyizolovaná z bakterií Staphylococcus nepalensis; kmeny: CCM7045,
CCM2433, CCM7317 a NRL04/522.
- restrikční endonukleázy EcoRI a BamHI, štěpící pufry 10× konc., destil. voda
- primer H279 nesoucí EcoRI-místo (5'-GAATTCGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC-3') a
primer H280 nesoucí BamHI-místo (5'-CGCGGGATCCYKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT 3'),
o koncentraci 10 pmol/ul, 10× konc. roztok dNTP, Taq DNA-polymeráza a příslušný reakční
pufr, 50 mM MgCl2,
- automatické pipety, špičky, eppendorfky, mikrofuga, spektrofotometr, termocykler
- zařízení pro elektroforézu a vyhodnocování gelů
Postup
1. Provedeme amplifikaci genu pro 60 kDA chaperonin Cpn60 s primery, jejichž konce nesou
rozpoznávací sekvence pro restrikční endonukleázy EcoRI a BamHI (viz protokol PCR).
2. Provedeme purifikaci PCR-produktu (viz QIAquick PCR Purification Kit Protocol) a
výsledný vzorek ověříme na agarózové gelové elektroforéze, současmě odhadneme
koncentraci DNA.
3. Provedeme štěpení purifikovaného amplikonu restrikčními endonukleázami EcoRI a
BamHI:
V eppendorf. zkumavce smícháme:
- 1-2 g DNA (x ul roztoku DNA)
- 45 - x l H2O
- 5 ul 10x konc. štěpícího pufru
- 5 jednotek restriktáz (asi 1 l )
Obsah zkumavky dobře promícháme a krátce zcentrifugujeme v mikrofuze. Inkubujeme 2
hod při teplotě doporučené pro příslušné restriktázy.
4. Zkumavku zahřejeme 5 minut na 56°C a necháme zchladit na pokojovou teplotu
5. Opět provedeme purifikaci naštěpeného PCR-produktu (viz QIAquick PCR Purification
Kit Protocol). Rozpustíme ve 30 l elučního pufru.
6. Rozštěpenou DNA uložíme při -20°C.
Ligace vektorové a cizorodé DNA
Nejsnadněji se klonují DNA-restrikční fragmenty, získané štěpením DNA dvěma různými
RE. Pokud se liguje DNA po štěpením jednou RE, je vhodné provést defosforylaci vektoru,
která podstatně snižuje jeho recirkularizaci a zvyšuje výtěžek rekombinantních molekul.
Pokud se defosforylace neprovede, je možné výtěžek rekombinantních molekul zvýšit
nastavením optimálního poměru koncentrací vektorové a cizorodé DNA - tento poměr se
mění v závislosti na velikosti vektoru a klonovaného restrikčního fragmentu. Výpočet pro
přesné stanovení koncentrací obou DNA je uveden v řadě příruček. Prakticky lze vyjít z
poměru koncentrací 1:1, 3:1 a 1:3, kde je značná pravděpodobnost, že některá z těchto směsí
obsahuje poměr blížící se optimálnímu.
K ligaci se nejčastěji používá T4-DNA-ligáza (případně i DNA-ligáza z E. coli, která však
nespojuje tupé konce). V reakční směsi o celkovém objemu se kombinuje obvykle 100-500
ng vektorové DNA se 100-500 ng cizorodé DNA. Ligační pufr je dodáván výrobci jako 10x
koncentrovaný roztok (jeho složkou je TRIS, DTT, BSA, ATP a Mg++
). Vlastní ligační
reakce má teplotní optimum při 37°C - při této teplotě jsou však konce nestabilní (s tendencí
k denaturaci), proto se ligace obvykle provádí při teplotách 16-25°C, kdy je soudržnost konců
vyšší.
Výsledek ligační reakce je možné demostrovat elektroforeticky: po ligaci se vytvoří kromě
rekombinantních plazmidových molekul rovněž vysokomolekulární frakce DNA, kterou lze
na gelu dobře rozpoznat: je důkazem, že enzym je aktivní.
Materiál: DNA vektoru pBluescript štěpená RE , cizorodá DNA štěpená RE,
T4-DNA-ligáza, 10x ligační pufr, mikrozkumavky, aut. pipety, špičky, termostat na 16°C,
mikrofuga
Postup
1. Připravíme ligační směsi obsahující různé poměry vektorové a cizorodé DNA (1:1, 3:1,
5:1, 1:3 a 1:5). Každá směs obsahuje v celkovém obejmu 20 ul :
- 100-500 ng vektorové DNA
- 100-500 ng cizorodé DNA
- destil. sterilní vodu (ad 20 ul).
2. Směs zahřejeme 5 minut na 45°C - dojde k rozvolnění kohezních konců. Zchladíme na
4°C.
3. Přidáme:
- 2 l 10x ligačního pufru
- 0,1 Weissovy jednotky T4-DNA-ligázy
4. Po promíchání inkubujeme 4 hod (případně přes noc) při 16°C.
5. Odebereme 2 l a naneseme na 0,7% agrozový gel, na nějž naneseme paralelně 2 ul
vektorové a 2 ul cizorodé DNA.
6. V případě, že došlo k ligaci, pozorujeme rozdíly v elektroforetické mobilitě vzorků DNA.
Transformace kompetentních buněk E. coli rekombinantní DNA
Postup:
1. Do mikrozkumavky se napipetuje 200 ul kompetentních buněk. (V případě, že se používají
buňky zmrazené na -70°C, nechají se pozvolna rozmrznout při pokojové teplotě.)
2. Zkumavka se umístí do ledové lázně.
3. Přidá se DNA (obvykle se 1, 3 a 5 l ligační směsi smíchá s TE pufrem do celkového
objemu 10 l , který se pak přidá ke kompetentním buňkám).
4. Lehce se promíchá a ponechá v ledové lázni 30 minut.
5. Buňky se podrobí tepelnému šoku ponořením zkumavky na 1 min do vodné lázně 42°C,
nebo 3 min /37°C.
6. Zkumavka se přenese do ledové lázně a přidá se 1 ml LB bujonu.
7. Následuje inkubace 1 hod při 37°C na vodní třepací lázni.
8. Buňky se zcentrifugují 5 min při 1500 ot/min (nebo 1 min při 6000 ot/min).
9. Supernatant se sleje - většinou však zůstane ve zkumavce asi 100 l supernatantu, ve
kterém lze buňky resuspendovat.
10. Suspenze se vyseje pomocí bakteriologické hokejky na agarové plotny (LB agar,
obsahující 50-100 g ampicilinu /ml). Pokud se použijí plotny obsahující navíc X-gal a
IPTG, lze přímo odlišit podle zbarvení kolonie obsahující rekombinantní nebo
nerekombinantní plazmid.
11. Plotny se inkubují 24-48 hod při 37°C.
Poznámky:
1. Účinnost transformace kolísá v závislosti na použitém kmeni E. coli, na pracovním
postupu při přípravě kompetentních buněk a na koncentraci DNA použité k transformaci.
Platí, že nejvyšší účinnosti transformace se dosáhne při použití velmi nízkých koncentrací
DNA, nepřesahujících 10 ng/jednu transformační směs (optimální konc. je pod 1 ng DNA).
2. Je vhodné sledovat nárůst kolonií na plotnách: někdy se stává, že v okolí transformantů se
postupně objevujídorůstají) drobné kolonie, které nejsou transformanty a nejsou tudíž
rezistentní k ampicilinu: rostou v okolí rezistentních kolonií, které ampicilin rozkládají.
3. Vyrostlé kolonie je vhodné přepasážovat na čisté plotny a založit klony z jednotlivých
nově vyrostlých kolonií. Přítomnost rekombinantního plazmidu se ověří izolací metodou lyze
varem.
Izolace DNA rekombinantních vektorů pBluescript (potenciálních klonů) metodou lyze
varem (Holmes a Quigley, 1981).
Organismus: E. coli (rekombinantní pBluescript) - nárůst kultury na Petriho misce (LB agar +
100 ug AMP/ml)
Materiál: Eppendorfovy zkumavky, mikrocentrifuga, automatické pipety, špičky, zařízení pro
elektroforézu, transiluminátor, restrikční endonukleázy, štěpící pufry, sterilní destil. voda, TE
pufr, 70% a 100% etanol.
STET Pufr (0,1 M NaCl, 10 mM TRIS.Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8,0), 5% Triton
X-100); Lysozym: 10 mg/ml (ve vodě); 2,5 M Na-acetát (pH 5,2); Izopropanol
Postup:
1. Bílé kolonie přeočkujeme na misky LBA s ampicilinem, IPTG a X-Gal ve formě dlouhých
proužků.
2. Druhý den z nárůstu kultury na Petriho misce odebereme párátkem asi 1-2 mm3
a
resuspendujeme v 350 ul STET pufru v epp. zkumavce. Odběr kultury párátkem provedeme
tak, abychom neodebrali i část agaru.
3. Přidáme 25 l roztoku lysozymu a dobře promícháme (protřepeme).
4. Zkumavku umístíme do lázně s vroucí vodou přesně na 1 minutu.
5. Zkumavku přeneseme do ledové vodní lázně.
6. Bakteriální lyzát zcentrifugujeme v mikrofuze 10 min. při max. ot. a pokojové teplotě.
7. Sterilním párátkem odebereme viskózní sediment
8. K supernatantu přidáme 40 l 3M Na3-acetátu a 420 l izopropanolu. Promícháme
několikerým obrácením zkumavky. Zkumavku ponecháme 5 min při pokojové teplotě.
9. Obsah centrifugujeme 5 minut v mikrofuze při max. otáčkách a 4°C. Supernatant
odebereme pasterkou - je nutno odstranit veškerou tekutinu.
10. Přidáme l ml 70% etanolu, protřepeme a zcentrifugujeme 1 min v mikrofuze. Supernatant
odebereme, sediment opláchneme 100% etanolem (případně znovu zcentrifugujeme, jestliže
se sediment uvolnil) a necháme oschnout v obrácené poloze při pokojové teplotě.
11. Sediment rozpustíme v 50 ul TE pufru.
12. Výsledek izolace ověříme na elektroforéze.
Poznámky:
Uvedeným postupem lze připravit asi 5 ug DNA. Původní předpis vychází z tekuté výchozí
kultury - pokud však použijeme plotny s kvalitním agarem, je čistota získané DNA
dostatečná. Roztok DNA se uchovává při -20°C, nebo krátkodobě při 4°C.
2. úloha. Restrikční mapování DNA
Mapování restrikčních fragmentů DNA lze s řadou výhod provádět po jejich naklonování do
vektorů, obsahujících polylinkery se štěpnými místy pro různé restriktázy. Restrikční místa
polylinkeru pak vymezují konce restrikčního fragmentu a kombinovaným štěpením
jednotlivými restriktázami lze poměrně snadno sestrojit restrikční mapu fragmentu.
Jedním z vhodných vektorů je plazmid pUC18.
K vlastnímu mapování můžeme použít různé strategie, zvláště vhodnou je kombinované
štěpení DNA několika různými RE
Materiál: Rekombinantní plazmid pUC18 nesoucí 5 kb (4992 bp) inzert cizorodé DNA (ve
formě DNA), plazmid pUC18 (ve formě DNA), zařízení pro elektroforézu a vyhodnocování
elektroforetických gelů, standardy molekulové hmotnosti (např. DNA fága lambda štěpená
EcoRI/HindIII + HindIII), restrikční endonukleázy EcoRI, PstI, PvuII, NdeI, SnaBI a XhoI
štěpící pufry, mikrozkumavky, pipety, špičky, vodní lázeň, termostat
Postup:
1. Provedeme izolaci rekombinantního plazmidu pUC18 obsahujícího Eco RI inzert cizorodé
DNA.
2. Stanovíme velikost inzertu (naklonovaného restrikčního fragmentu) štěpením
rekombinantního plazmidu RE Eco RI, který(é) byl (y) použit(y) ke klonování
3. Rekombinantní plazmid štěpíme vybranými restriktázami: EcoRI, PstI, PvuII, NdeI, SnaBI
a XhoI
- jednotlivě
- současně EcoRI a další (případně třemi)
3.Stanovíme velikost vzniklých restrikčních subfragmentů
4. Hodnoty získané v bodě 1) a 3) uspořádáme do tabulky a logickou úvahou uspořádáme
restrikční místa na restrikčním fragmentu, případně nakreslíme restrikční mapu.
Příklad:
do restrikčního místa EcoRI vektoru pBR322 byl naklonován restrikční fragment. K
mapování bylo použito PstI, jejíž štěpné místo je vzdáleno od EcoRI místa 764 bp.
Postup: provedeme následující štěpení:
1 - pBR322/EcoRI
2 - pBR322+inzert/EcoRI
3 - pBR322+inzert/PstI + EcoRI
Pufry pro štěpení 2 enzymy současně volíme podle přiložené tabulky. V případě nutnosti
následného štěpení použijeme jako první pufr s nižším obsahem solí.
Velikost DNA fragmentů se stanoví z elektroforetogramu na základě srovnání s mobilitou
standardních DNA fragmentů. Z velikostí jednotlivých fragmentů se sestaví restrikční mapa.
4. úloha. Přenos DNA na hybridizační membránu (Southernův přenos)
A. Příprava gelu pro kapilární přenos
1. Agarozový gel obsahující rozdělené restrikční fragmenty DNA se ponoří do roztoku 0,25
M HCl a inkubuje se za mírného třepání 15 minut při pokojové teplotě. Dochází k depurinaci
DNA a tím k fragmentaci restriknčích fragmentů na kratší úseky, které se snadněji přenášejí.
2. Roztok HCl se nahradí denaturačním roztokem (0,4 N NaOH, 0,6 M NaCl) a gel se
inkubuje 30 min při pokojové teplotě za mírného třepání.
3. Denaturační roztok se nahradí neutralizačním roztokem (1,5 M NaCl, 0,5 M TRIS.Cl, pH
7,5) v němž se gel inkubuje dalších 30 min za mírného třepání.
B. Příprava membrány pro přenos DNA z gelu (při práci s membránou pracujeme v
rukavicích)
a) Ustřihneme membránu o velikosti gelu, namočíme ji v destilované vodě a poté přeneseme
na 15 min do roztoku 10xSSC.
b) Připravíme můstek (tj. 2-3 pruhy filtračního papíru Whatman 3) pro přenos pufru z
rezervoáru na gel. Velikost můstků se řídí rozměrem gelu a použitého zařízení pro přenos.
Můstek se namočí do roztoku 10xSSC, poté podle nákresu přiloží na podpůrné sklo a pipetou
se odstraní vzduchové bubliny.
c) Na můstech se položí gel a odstraní se vzduchové bubliny
d) Okraje gelu se obloží parafilmem nebo polyetylénovou folií, aby se zamezilo falešnému
nasávání pufru.
e) Na gel se přiloží membrána a popisovačem se označí polohy jamek a orientace membrány.
f) Na membránu se položí 2-3 vrstvy filtračního papíru Whatman o velikosti gelu a dále pak
vrstva savého materiálu (např. buničitá vata), zatíží se sklem a závažím o hmotnosti asi 1 kg.
g) Přenos probíhá 16-24 hodin; podle potřeby je možné doplňovat roztok 10xSSC v
rezervoáru a měnit vrstvu buničité vaty.
h) Po ukončení přesávky odstraníme buničitou vatu a filtrační papír a membránu sejmeme
i) Mmebránu ponoříme na 30 sec do 0,4 M NaOH (denaturace)a poté do roztoku 0,2 M
TRIS.Cl, 2xSSC (neutralizace).
j) Membránu mírně osušíme na filtračním papíru a ozáříme 3 min na transiluminátoru (strana
obsahující přenesenou DNA směřuje k UV lampám). Jen u membrán Boehringer.
k) Membránu můžeme nechat uschnout nebo pokračujeme hybridizací.
Hybridizace DNA se značenou sondou
1. Neradioaktiktivní naznačení DNA digoxigeninem.
a) Stanoví se koncentrace DNA, určené k přípravě sondy.
b) DNA se denaturuje 10 min při 100°C ve vodní lázni a rychle se zchladí na ledě s NaCl.
c) Připraví se směs pro značení DNA (v Eppendorfově zkumavce):
- 1g čerstvě zdenaturované DNA sondy
- 2 l směsi hexanukleotidů (směs náhodných oligonukleotidů - primerů)
- 2 l směsi dNTP a Dig-dUTP
- x l destil. sterilní vody, kterou se směs doplní do 19 ml
- 1 l Klenowovy polymerázy
d) Obsah zkumavky se krátce zcentrifuguje a inkubuje přes noc při 37°C
e) Reakce se zastaví přidáním 2 l 0,2 M EDTA
f) Naznačená DNA se vysráží přídavkem 2,5 l 4M LiCl a 75 l 96% EtOH (vychlazený na
-20°C). Dobře promíchat a ponechat 30 min při -70°C nebo 2 hod při -20°C.
g) Zcentrifugovat 15 min při 12 000 g, promýt 70% EtOH, osušit 96% EtOH, rozpustit v 50
l TE.
h) Uchovávat při -20°C.
2. Hybridizace
(Uvedené objemy roztoků jsou vypočteny na 100 cm3
memebrány).
a) Membrána se prehybridizuje ve 20 ml standardního hybridizačního roztoku při 68°C
nejméně 1 hod. (vysycení míst na membráně, na něž není navázána DNA).
b) Hybridizace při 68°C ve 20 ml hybridizačního roztoku s přídavkem sondy (10-100 ng
DNA/ml roztoku).
c) Promytí membrány (odstranění nespecificky navázané sondy)
- 2 x 5 minut při pokojové teplotě (asi 100 ml roztoku 2xSSC, 0,1% SDS)
- 2 x 15 minut při 68°C (asi 100 ml roztoku 0,1xSSC, 0,1% SDS)
d) Imunologická detekce navázané sondy
všechny reakce se provádějí při pokojové teplotě
a) membrána se promyje 1 min promývacím roztokem (0,1 M Kys. maleionová, 0,15 M
NaCl, 0,3% Tween 20, pH 7.5)
b) membrána se inkubuje 30 minut v blokovacím rotzoku (0,1 M Kys. maleionová, 0,15 M
NaCl, 1% blokovací reagens)
c) Anti-Dig konjugát (zásobní koncentrace 750 U/ml) se rozpustí v blokovacího roztoku
(objem podle velikosti membrány) do konečné koncentrace 150 mU/ml (stačí pouze 1 l).
Membrána se v tomto roztoku inkubuje 30 min.
d) Membrána se promyje promývacím roztokem 2 x 15 minut a poté se přenese na 2 minuty
do detekčního roztoku (100 mM TRIS.Cl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2)
f) Barevná reakce: Membrána se umístí do polyetylénového sáčku nebo do vhodné vany.
Přidá se 5 ml detekčního roztoku obsahujícího 22,5 l NBT a 17,5 l X-fosfátu. Odstraní se
bubliny, sáček se zataví a ponechá bez třepání ve tmě. K barevné reakci dochází během 30
minut (lze ponecht 12 hod).
g) Reakce se zastaví ponořením mebrány do TE pufru (membránu udržujeme vlhkou pro
případnou rehybridizaci).
h) Membrána se vyfotografuje a vyhodnotí.