Úloha1: Stanovení lidského sérového transferinu imunoturbidimetricky Ke stanovení transferinu použijete předpřipravené roztoky z komerčního kit IMU-LA-TEST fy Pliva-Lachema. Stanovení transferinu touto imunoturbidimetrickou metodou je založeno na reakci transferinu se specifickou kozí protilátkou proti lidskému transferinu. Vznikající imunokomplexy zpsobují růst zákalu, který je přímo úměrný koncentraci transferinu a lze jej měřit při 340 nm. Činidla: Roztok 1: 35 mM imidazolový pufr pH 7, 4 % PEG, 150 mM NaCl Roztok 2: 2 % kozí antisérum proti lidskému transferinu v 50 mM HEPES pH 7.4, 9 mM EDTA Kalibrační roztok: krevní sérum obsahující certifikovanou koncentraci lidského transferinu o koncentraci 7g/l. Pracovní postup: V 5 mikrozkumavkách si připravte nejdříve standardy transferinu pro vyhotovení kalibrační křivky postupným ředěním zásobního roztoku 1:1 fyziologickým roztokem. Do jamek mikrotitrační destičky postupně pipetujte 250 ul roztoku 1 a 2 ul vzorku (neznámý vzorek, strandardy). Jako blank místo vzorku použijte 2 ul destilované vody. Promíchejte a inkubujte 5 min při 37 °C. Odečtěte absorbanci při 340 nm (A1). Do všech použitých jamek přidejte 70 ul roztoku protilátky. Promíchejte a inkubujte při 37 °C 5 min. Poté odečtěte absorbanci při 340 nm (A2). Vyhodnocení: Z rozdílů absorbancí A2-A1 vypočítejte přírustek zákalu v jednotlivých jamkách. Od hodnot jednotlivých vzorků odečtěte hodnotu naměřenou pro blank. Z kalibrační křivky vyhodnoťte obsah transferinu ve Vašem neznámém vzorku. Úloha 2: Stanovení lidského sérového transferinu pomocí jednoduché ELISA metody Ke stanovení lidského sérového transferinu je možno využít i několik možností enzymoimunoanalýzy. V této úloze se zaměříme na nejjednodušší verzi ELISA, využívající přímé adsorpce transferinu na polystyrenovou mikrotitrační destičku a jeho následnou specifickou detekci. Roztoky: TBS: 50 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.4 potahovací pufr: 50 mM uhličitanový pufr, pH 9.6 blokovací roztok: 3 % BSA v TBS protilátky: 1: 2 000 prasečí proti lidskému transferinu 1: 10 000 králičí proti prasečímu antiseru značené křenovou peroxidasou vždy v blokovacím roztoku barvící roztok: Sigma Fast OPD (o-fenylendiamin), připravit roztok dle firemního návodu 30 % H[2]SO[4 ] Pracovní postup: Všechny následné kroky provádějte na inkubované třepačce při 200 rpm. Do mikrotitrační destičky pipetujte vždy 100 ul transferinu v uhličitanovém pufru o různé koncentraci (5 -- 100 ug/ml). Jako blank použijte uhličitanový pufr. Neznámý vzorek (lidské krevní sérum) nařeďte 100x. Všechny vzorky stanovujte v tripletech. Inkubujte misku 1 hod při 37 °C nebo přes noc při 4 °C. Odstraňte inkubační roztok a blokujte nevysycená místa přidáním 100ul 3 % BSA v TBS. Inkubujte misku 1 hod při 37 °C. Odstraňte kapalinu a jamky důkladně promyjte TBS pufrem 3 x 3 minuty pomocí intenzivního třepání. Do jamek přidejte 100ul prasečí protilátky proti lidskému transferinu a inkubujte 30 -- 60 min při 37 °C. Odstraňte kapalinu a jamky důkladně promyjte TBS pufrem 3 x 3 minuty pomocí intenzivního třepání. Do jamek přidejte 100ul králičí protilátku proti prasečímu antiséru a inkubujte 30 -- 60 min při 37 °C. Odstraňte kapalinu a jamky důkladně promyjte TBS pufrem 3 x 3 minuty pomocí intenzivního třepání. Přidejte 200 ul OPD substrátu do každé jamky a nechte 30 min inkubovat při 37 °C. Odečtěte absorbanci v jednotlivých jamkách při 450 nm. V případě, že není možno odečíst hodnoty absorbance ihned, zastavte enzymovou reakci přidpřidáním 50 ul 3M kyseliny sírové a následně odečtěte absorbanci při 492 nm. Vyhodnocení: Naměřené hodnoty ze tří měření zprůměrujte a sestrojte kalibrační křivku závislosti absorbance na vstupní koncentraci transferinu. Odečtěte koncentraci Vašeho neznámého vzorku. Úloha 3: Imunoblotting bílkovin krevního séra Proteiny krevního séra ( se zaměřením na lidský sérový transferin) budou imunochemicky detegovány po jejich přenosu (blotting) na nitrocelulosovou membránu. Specifické barvení bude možno porovnat s nespecifickým barvením všech bílkovin. Úloha navazuje na úlohy dělení bílkovin podle velikosti v elektrickém poli pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). I.ELEKTROFORÉZA vlastní provedení viz úlohy SDS PAGE. používané vzorky ( naředěné na konc. 1 mg/ml): lidské sérum (obsahuje lidský transferin) : Exa koňské sérum (negativní konrol: RU sérum standard lidského transferinu hTrf standard hovězího transferinu bTrf Na elektroforézu naneste vzorky v tomto pořadí: sérum standard sérum standard 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Exa Exa Repro 20 ul Repro hTrf hTrf bTrf bTrf Exa lidský 5 ul 20 ul 5ul 20 ul transferin 20 ul 5 ul 5ul 20 ul 20 ul lidské koňské lidský hovězí Vzorky 1-8 budou barveny imunochemicky, vzorky 9 a 10 nespecificky na celkovou bílkovinu. II.BLOTTING Roztoky: přenosový pufr: 15.6 mM Tris/120 mM glycin TBS: 50 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.4 blokovací roztok: 4% netučné sušené mléko v TBS protilátky: 1: 500 prasečí proti lidskému transferinu 1: 2 000 králičí proti prasečímu antiseru značené křenovou peroxidasou vždy v blokovacím roztoku barvící roztok: 4-chloro-1-naftol 3 mg/ml v methanolu (stabilní 1-2 týdny v chladu) A.Příprava elektroforetické aparatury Nitrocelulosovou membránu a gel po elektroforéze ponechte ekvilibrovat 15 minut v přenosovém pufru. Do elektroforetické nádobky vložte blotovací modul a nalijte do ni 400 ml přenosového pufru. Do nádobky vložte vychlazenou chladící jednotku. B.Sestavení blotovací jednotky V Petriho misce otevřete blotovací kazetu šedou stranou dolů a položte na ni houbu. Na její povrch položte filtrační papír nasycený přenosovým pufrem. Na filtrační papír nalijte malé množství přenosového pufru a položte na něj gel, tak aby mezi papírem a gelem nezůstaly vzduchové bubliny. Na povrch gelu nalijte malé množství přenosového pufru a z jedné strany na něho pomalu pokládejte nitrocelulosovou membránu, tak aby mezi gelem a membránou nezůstaly vzduchové bubliny. Přebytek pufru a případné bubliny odstraňte vytlačením skleněnou tyčinkou. Na povrch nitrocelulosové membrány nalijte malé množství přenosového pufru a položte na ni filtrační papír nasáklý v přenosovém pufru. Přebytek pufru a případné bubliny odstraňte vytlačením skleněnou tyčinkou. Na filtrační papír položte houbu a uzavřete blotovací kazetu. C.Blotting Vsuňte blotovací jednotku do blotovacího modulu umístěného v elektroforetické nádobce, a to šedou stranou k šedé straně modulu. Nádobku umístěte na elektromagnetickou míchačku, uzavřete ji víkem a elektrody připojte ke zdroji. Blotting ponechte probíhat 2 hodiny za konstantního napětí 100 V. III.IMUNODETEKCE A.Blokování membrány Vypněte zdroj napětí, otevřete blotovací aparaturu, vyjměte z ní blotovací jednotku. Otevřete blotovací kazetu, odstraňte houbu a filtrační papír a nitrocelulosovou membránu přeneste do blokovacího roztoku. Membránu ponechte v blokovacím roztoku 15 minut za občasného promíchání při 37 ^oC. B.Inkubace s první protilátkou Ponechte inkubovat membránu v blokovacím roztoku obsahujícím první protilátku zředěnou v poměru 1 : 500 a to po dobu 1 hodiny případně přes noc při laboratorní teplotě. Na membráně nesmí zůstat vzduchové bubliny, které by bránily kontaktu epitop - protilátka. C.Promytí a blokování membrány Slijte roztok první protilátky a membránu opláchněte pufrem 3x 10 minut. Membránu ponechte v blokovacím roztoku 15 minut za občasného promíchání při 37 ^oC. D.Inkubace s druhou protilátkou Ponechte membránu inkubovat v blokovacím roztoku obsahujícím druhou protilátku zředěnou v poměru 1 : 2 000 a to po dobu jedné hodiny případně přes noc při laboratorní teplotě. F.Promytí membrány Slijte roztok druhé protilátky a membránu opláchněte pufrem 3x 10 minut. G.Detekce aktivity křenové peroxidasy Připravte detekční směs : 5 ml roztoku methanolického roztoku 4-chloro-1-naftolu (3 mg/ml methanolu) 20 ul 30 % peroxidu vodíku doplňte pufrem na 30 ml Ponořte membránu do detekční směsi a ponechte vyvíjet modré zbarvení po dobu 5 - 30 minut. IV. Barvení na bílkovinu NC membránu promyjte několikrát destilovanou vodou a vložte ji do roztoku Ponceau S asi na 5 minut. Pozadí odbarvěte několikanásobným propíráním v 3% kyselině octové.