Molekulární podstata nádorového bujení klíč k porozumění procesů v základech lidské rakoviny. Nádor vzniká ze společné buňky, ve které byl - většinou desítky let před vznikem viditelného nádoru - zahájen program neregulovaného dělení Maligní transformace buňkv urobíhá uřes akumulaci mu specifických třídách gen Existují dvě třídy genů, které dohromady tvoří jen malou část celé genetické vvbavv. ale hraií hlavní úlohu v zaháiení nrocesu tvorba nádo e své normální konfiguraci řídí životní cyklus bunky, tj. sled deju, při kterých se buňka zvětšuje a dělí. PROTOONKOGENY jsou normální buněčné geny mající základní význam ve fyziologii buňky. Hraií úlohu Dředevším v regulaci životního cvklu buněk: ► Buněčného cyklu ► Buněčné proliferace ► Diferenciace ► Apoptózy V průběhu evoluce dobře konzervovány a jejich přítomnost v normálních buňkách všech vyšších organismů předpokládá, že mají základní význam v buněčné fyziologii. Kódují proteiny, které hrají klíčovou na různých úrovních integrace mitogenních signálů nesených růst. faktory a hormony. Jsou-li modifikovány, ať na strukturální nebo kontrolní úrovni, začnou se chovat jako onkogeny a podporují vývoj nádoru. ONKOGENY mutované nebo aktivované protoonkogeny Proces karcinogeneze zahrnuje změněné exprese nebo funkce protoonkogenů na různých stupních transdukce signálů. NÁDOROVÉ SUPRESOROVE GENY (ANTIONKOGENY) zabraňují abnormální buněčné proliferaci VQ^Kjl. ■%V» MÉ\ v- ;1j^-----nucleocapstd ^^^MF^Lé-^É^B^MF^Ub- ^ft^^" \ 9«w>me ^K*í"3B Copyright 19« - '97 Marko Ptíchk? y^ *í**# 7 :lp'í^r-------gfycoprotein complex I *■_.-' j-v*--v- — glycoprotein compfex IIT V posledních 30 letech byla objevena řada genů odpovědných za vývoj nádorů. Na porozumění maligní transformaci má zásluhu zejména široká škála dřívějších prací s onkogenními virusy. První sarkoi K T>GEN s . Virus Rouso ^v^^^^^IS^^^^^^^^^s^^^^^^X^^^ {■cnff ffmiffffiKgt mmam n IčfflKl z/7 v/vo u 2J \WYAiVMU . Normami Kuřecí genom oosanuje pn Později se ukázalo, že řada retro virů je onkogenních. Bylo též prokázáno, že src není jednoznačně retro virový gen, ale spíše téměř přesná kopie genu nalezeného Tento normální gen, tzv. proto-onkogen je v retro viru modifikován (aktivoval tak, že působí po přenesení do buněk nádor. luu3SiSijí auBSBi H9! v HiTiB!oíi I33!T5jí transformovat normální buňky DNA stejným způsobem jaký užívají retro virusy. Mnoho protoonkogenů kóduje proteiny mající vztah k růstově stimulačním signálům přecházejících z vnějšího prostředí do nitra buňky. Růst buňky je deregulovaný, jestliže mutace v protoonkogenů způsobící trvalou aktivaci růstově stimulační dráhy. Toto souvisí se signály, které si navzájem předávají buňky v tkáních. Jedny buňky uvolňují růstové faktory, proteiny (glyko), které se pohybují mezi buňkami a po vazbě na vhodný receptor na povrchu jiných buněk vyvolávají kaskádu dějů, které přenáší tento signál přes cytoplasmu až do jádra. V jádře pak proteiny nazývané transkripční faktory odpovídají tím, že aktivují řadu genů, které pomáhají buňce procházet buněčným cyklem. Podobně funguje i přenos růstově inhibičního signálu. V normální buňce je rovnováha stimulačních a inhibičních signálů pečlivě regulována, protože to souvisí s regulací buněčného cyklu, který je rozhodující pro buněčnou proliferaci a diferenciaci. V nádorové buňce je v důsledku změn v signálních drahách organizace buněčného cyklu narušena. Buňka je vybavena také zpětnovazebnými mechanismy, které mohou působit proti neobvyklým změnám v procesu bun. dělení. Apoptóza - schopnost buňky spáchat za určitých podmínek „sebevraždu", tj. jestliže její základní komponenty jsou porušeny nebo jestliže je její kontrolní systém deregulován. Tak působí např. poškození chromozomální DNA. V tomto procesu se účastní také specifické geny např. p53 nebo bcl-2. Mutace těchto genů pak způsobují poruchy apoptózy. Bylo zjištěno, že neschopnost apoptózy přispívá ke vzniku nádorů a k jejich rezistenci k terapii. Druhým obranným mechanismem proti neustálé proliferaci je vestavěný buněčný mechanismus, který sčítá a limituje celkový počet dělení buňky, buňka stárne a hyne. Molekulárním nástrojem tohoto sčítaní jsou segmenty DNA na koncích chromosomů tzv. telomery. Ty se při každém dělení zkracují a když dosáhnou kritické délky dochází k stárnutí a krizi. Jestliže tento sčítací systém funguje v nádorové buňce řádně, její nadměrná proliferace je přerušena předtím, než je nádor příliš velký. Aktivací genu, který kóduje enzym telomerázu, který není v normálních buňkách, ale byl nalezen v nádorových buňkách, však dochází k obnově telomerických segmentů a to umožňuje buňce se nekonečně množit, tj. stát se nesmrtelnou. ■GGGTTAG n -GGGTTAGGGTTAG -GGGTTAGGGTTAG Většinou trvá desítky let než se v prekarcinogenní populaci nasbírá dostatek mutací k malignímu růstu. U některých jedinců je však tato doba silně zkrácena. To je vysvětlováno dědičností některých genů způsobujících rakovinu. Jestliže rodičovská zárodečná buňka obsahuje mutaci tak u potomka je tato mutace přítomna ve všech buňkách těla a pravděpodobnost vzniku nádoru je vysoká. Protoonkogeny lze dělit ^ Podle lokalizace jejich produktu na ty, které kódují 1) sekreční proteiny 2) proteiny buněčného povrchu 3) cytoplasmatické proteiny 4) jaderné proteiny ^ Podle funkce jej ich produktů na 1) růstové faktory (např. sis, hst), 2) receptory pro růst. faktory (např. fms, kit, erb B), 3) cytoplasmatické proteiny - protein kinázy (např. raf) a G-proteiny (např. ras), 4) jaderné proteiny (např. myc, myb, fos, jun) (immediate early genes) a jejich produkty jsou proteiny vážící se na DNA a fungující jako tzv. transkripční faktory, které regulují transkripci pozdních genů. Jsou většinou aktivovány overexpresí, která může být indukována různými způsoby: translokací (Burkitt lymphoma), insercí retroviru (spíše v experimentálních systémech), amplifikace genů - to je obecný mechanismus aktivace jader, protoonkogenů a byla pozorována u řady nádorů. RUSTOVE FAKTORY - EGF, TGFcc, TGFß, IGF G - PROTEIN ras, rev —> TYROSIN KINAZY / src, abl / ► PROTEIN / Kl N AZA C / RECEPTORY PRO RŮSTOVÉ FAKTORY - EGF-R -NEU - PDGF-R JADERNE PROTOONKOGE myb myc GENY PRO RUSTOVE FAKTORY v Přenos signálů a růstová regulace v eukaryotických buňkách. Jsou znázorněny reprezentativní protoonkogeneny v signálních dráhách. ONKOGENY a ANTI-ONKOGENY Externí signály J. T Přenos externích signálů Růstové faktory mas Transmembranove receptory ras rap Tyrosinové kinázy GTP-vazebne proteiny Jaderné děje Serme -treoninové kinázy Rb myc ets sls I-o fos P53 myb Jun Replikace DNA METABOLICKÁ ODPOVĚĎ Onkogeny a anti-onkogeny: hlavní funkční skupiny onkogenních proteinů a jejich pravděpodobná vnitrobuněčná lokalizace. Anti-onkogeny jsou označeny větším písmem. Mutace protoonkogenu vedoucí k transformaci můžeme funkčně rozdělit do dvou tříd: získání funkce (gain-of-function), kde aktivita protoonkogenu vzrůstá a má za následek abnormální nebo nadměrmou růstovou stimulaci ztráta funkce (loss-of-function), která vede k inaktivaci represorové složky, která normálně negativně ovlivňuje buněčnou proliferaci (nádorově supresorové geny - p53, RB, geny pro antiproliferační molekuly -TGF ß, TNFoc, interferon y) V obou případech je výsledkem nadměrná stimulace růstu. (A) overactivity mutation (gain of function) single mutation event creates oncogene normal cell activating mutation enables oncogene to stimulate cell proliferation cells that proliferate abnormally (B) underactivity mutation (loss of function) second mutation x ■ é x mutation event event — normal cell inactivates V I inactivates *" tumor ^s!jl/ second gene -suppressor no effect of copy ' / | \ Öene mutation in one two inactivating mutations gene copy functionally eliminate the tumor suppressor gene, Stimulating cell proliferation Autokrinní signál A SINGLE SIGNALING CELL RECEIVES A WEAK AUTOCRINE SIGNAL IN A GROUP OF IDENTICAL SIGNALING CELLS, EACH CELL RECEIVES A STRONG| AUTOCRINE SIGNAL Figure 15-6. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Při buněčné transformaci a karcinogenezi se uplatňují autokrinní mechanismy (vznik autokrinní smyčky) - neplánovaná produkce růstových faktorů buňkami nesoucími odpovídající receptory nebo aberantní exprese receptoru. proto-oncogene DELETION OR POINT MUTATION IN CODING SEQUENCE I DNA— i M RNA I CHROMOSOME REARRANGEMENT or i hyperactive protein made in normal amounts normal protein greatly overproduced nearby regulatory DNA sequence causes normal protein to be overproduced I DNA I RNA fusion to actively transcribed gene greatly overproduces fusion protein; or fusion protein is hyperactive HEALTHY CELL WITH ONLY 1 NORMAL fíbGENE COPY rnutatio Rb loc in maternal chromosome ion at N N no ícus^^LJ U_ in pate irmal flbgene irnal chromosome POSSIBLE WAYS OF ELIMINATING NORMAL Rb GENE n Q Q n nn n o ky/H nondisjunction nondisjunction mitotic (chromosome and recombination loss) duplication gene deletion conversion Figure 23-29. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Spektrum účinků p53 v modulaci přežívání a frekvence změn genu p53 u lidských nádorů Fig, 1 The spectrum of survival-modulation effects of p53 p2l: promotes growth arrest bct-x: blocks apoptosis gadd-45: DNA repair (?) MDM-2 C095 (?) Cyclin G (?) p21: promotes growth arrest bax: promotes apoptosis IGF-BP3: inhibition of IGF signalling bci-2: blocks apoptosis MDR; increases drug resistance Survival Death Fig. 2 Frequency of p53 gene alterations in human cancer (Greenbtatt et al. 1994) Lung Colon Esophagus Ovary Pancreas Skin Stomach Head and neck Bladder Sarcoma Prostate Liver Bram Breast Kidney Blood Melanoma Cervix Testis ZU 10 20 30 40 Frequency of p53 alterations [%] 50 60 Vztahy mezi genetickými a fenotypovými změnami u nádorů Gentic alterations Phenotypic alterations <*****- Proliferation Differentiation Apoptosis Response to genetic damage Oncogene Tumor suppressor gene ^•••♦. * Invasion 1 Metastasis Onkogeny a nádorově supresorové geny mají funkce v regulaci proliferace, diferenciace, apoptózy a odpovědi na genetické poškození. Jejich úloha v invazi a vzniku metastáz je však nejasná. NORMÁLNI , KONTROLOVANÝ RŮST Onkogeny GAP JUNCTION Ztráta nádorově supr. genů INICIACE ABNORMÁLNÍ RŮST, ale stále ještě nějak kontrolovaný adorove su geny Aktivované okogeny ++ GAP JUNCTION nebo Aktivace více onkogenů NEKONTROLOVANÝ Rľ o» Li Nefunkční mezibuněčná komunikace NEKONTROLOVANÝ RUST Poznatky o molekulárně genetické podstatě nádorového onemocnění lze shrnout takto: ► primární pro vznik nádoru jsou změny vyvolané jak genetickými (mutace v DNA) tak negenetickými příčinami (ovlivnění exprese genů) ► karcinogeneze je několikastupňový proces založený na poruše genetické homeostázy a pouze dílčí změna v kterémkoliv článku ke vzniku nádoru nevede ► ke vzniku nádoru může vést jen kombinace poruchy několika různých o \/ • \/ \/ rozdílné ra^Qffifl ► byly nalezeny velké individuální a mezidruhové rozdíly i tkáňová a orgánová specifita ve spojitosti se vznikem nádorů ► na vzniku ná ohou významně podílet látky z vnějšího prostředí ZMENY METYLACE DNA A ACETYLACE HISTONU NÁDOROVÁ EPIGENETIKA EPIGENEIKA - dědičné změny v genové expresi beze změn v sekvenci DNA únětické změny hrají významnou úlohu v karcino; Savčí buňky mají schopnost epigeneticky modifikovat svůj genom prostřednictvím ► METYLACE DNA, tj. kovalentního přidávání metylových skupin do 5 pozice na Mižnř Renomuje chudá na CpG. Metylace DNA hraje zásadní úlohu v normálním vývoji, v inaktivaci chromozómu X a supresi tzv. parazitických sekvencí DNA. Umožňuje „zapínat a vypínat" geny na správném místě a ve správné době. Aberantní metylace DNA v promotorové oblasti je však také klíčovým mechanismem inaktivace nádorově supresorových genů. Může způsobit zvýšení mutací a dědičně tlumí gei jejichž promotory jsou asociovány s tzv. CpG „islands" a které kontrolují buněčnou proliferaci. Zatím neznámé mechanizmy zabraňují de novo metylaci těchto promotorů u normálních buněk. Důkazy spojitosti mezi metylaci DNA a genovou expresí s využitím inhibitoru metylace - 5-ayarvtidinu (5-AZAV mnoho senu může bvt reaktivováno. Hypo- nebo hypermetylace DNA (obsah 5-metylcytosinu) patří mezi negenotoxické mechanismy karcinogeneze. Metylaění struktura v nádorových buňkách se liší od normálních buněk. Globální hypometylace genomu je doprovázena místně specifickou hypermetalací. Hypermetylace promotorů pro nádorově supresorové geny v CpG islands je doprovázena jejich utlumením a růstovou výhodou pro tyto buňky. Hypometylace DNA je spojena se zvýšenou genovou expresí. ~vat n, MiilllJB I IM IMmlm ermi snsBHHfflfcíC miižt spontánne cbaiSEu tahiľffm ► ACETYLACE HISTONU Genová exprese je regulována i strukturou chromatinu. Chromatin obsahující hypoacetylované lysiny v histonech má kompaktní strukturu represivní pro transkripci. Inhibitory histonových deacetyláz (HDAC) mohou vytvářet otevřené struktury chromatinu a aktivovat určité geny inhibující nádorový růst využití v terapii (butyrát, trichostatin). Existuje „crosstalk" mezi metylací DNA a acetylací histonů při tlumení (silencing) love exprese. 5 AZA a HD AC inhibitory v kombinaci způsobují reaktivaci nádorově supresorových Unmethylated CpG Island Activators» Historie Acetyltransferases, Basal Transcriptional Machinery Protect the Island r um mi 0 a íl 1 T 1 T RNA Transcription Hypermethylated CpG Island Transcriptional Repressors, Histone Deacetylases, DNA Methyltransferases and Methyl-binding Proteins Shut-Down the Island ,—a—s Spreading from Methyiation Centers, Seeding of Methyiation, Selective Advantage urn 0 1 C 1 i Transcription is Abolished jj Figure 1 The typical CpG island of a tumor suppressor gene is represented in a normal and a tumor celh The presence of a dense hypermethylation changes completely its molecular environment, White dots, unmethylated CpGs; Black dots, methylated CpGs Utlumení genové exprese aberantní metylací DNA a modifikací histonů MeCP2 CH3 DNA methylation histone deacetylation H-3 Lys-9 methylation CH3 CH3 DNA demethyiation histone acetylation H-3 Lys-4 methylation CH3 Ac Ac CH3 Ac Ac CH 3 Ac Ac Nukle místu y v promotorové oblasti. Proteiny vážící se k 5MeC (MeCP2) se váží k metylovaným CpG ůsobují tlumení genové exprese histon deacetylázou (HDAC). Přítomnost toh( MKKjl Kfl í iTI^E^fl IIIC1 ÍVl ÍTvTM l^rSHI iTvl Ě^M wSTwK iítícii MM 1ÍB1 ÍRI Ri irSTSiilf] řeměňuje nukleosom v kompaktní konfiguraci, která zabraňuje vazbě transkripčních faktorů. )emetylace a deacetylace způsobuje pak zase uvolnění inhibičního proteinového komplexu a tvorbu premenuje nuKieosom v KompaKtni Konnguraci, Která zaon Demetylace a deacetylace způsobuje pak zase uvolnění inh otevřené struktury nukleosomu, která umožňuje transkripci A Percentage of CpG Island Hypermethytation in Human Cancer According to the Tumor Type 30 25 20 15 10 0 vi---------------- i n n ! I n ! !i FTl ^-^ 1 UiinillJDDDoii 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 .Lymphoma 2-Esophftgus 3-Stom.ich 4-Colon 5.Pane re as 6,LeiikeEni» 7-Uierus 8. Liver 9 JHead & Neck 1 ».Glioma 1 L Kidney IZ.Breast 13Xuitg 14,Ovary lS.BIadder % 30 n 25 20 15 10 5 O Percentage of CpG Island Hy per met hy lat ion in Human Cancer» According to the Tumor Suppressor Gene noo i. pi*1™"- 2. pl5INKib 3. »A PK 4.hMLHl 5. MC MT 6. AFC 7. GSTPI 8.p73 9. pl4ARr 10. BRCA1 2 3 5 6 8 10 Figure 3 (a and b) are alternative ways to present our CpG island hypermethylation profile o ť human cancer (Esteller et aL, 200 la). (a) an average value oľ the frequency of hypermethylation of II tumor suppressor genes fpló 1MK4J! p 14 AlíK p!5JNK*_ m GMT. hMLHI. BRCAl, GSTPI. DAPK, CDHl, p73 and A.PC) is shown according to tlie most common types of human tumors, fb) the other side of the coin: the frequency of CpG island hypermethylation of ten particular tumor suppressor genes in the tumor types described in a. In the cases of p!51_ K4b and hMLHI an overestimate exists due to the high number of leukemias and micro-satellite unstable tumors included, respectively Table 1 Hallmarks oí cancer and different types of genes silenced by aberrant DNA methylation Hallmark" (acquired capability) Gĺw silenced by DNA methylathm Gene function References Insensitivity to antigrowth signals plfi(TDKN2A Cyclin-kinase inhibitor induce differentiation cell cycle arrest Herman etal{ 1995) RARj? Coté ť/«/, (1998) Sigma 14-3-3 Umbricht et al (2001) Self-sufiiciency in growth signals RASSF1A Regulation Ras pathway Dammann etai (2000) Evading apoptosis Capase-8 Initiate apoptosis Teitzf/íí/,(2000) TMSI Proapoptosis Stimson and Vertino (2002) DAP-kinase Proapoptosis Kissilťŕŕŕ/,(1997) pl4ARF Proapoptosis Robertson and Jones (1998) Limitless replicative potential Rb Tumor suppressor gene Ohtani-Fujitar/üUI993) Sustained angiogenesis Thrombospondin-I Angiogenesis inhibitor stimulate angiogenesis Li et aL{\m) VHL Herman etal{ 1994) Increased invasion And metastasis E-cadherin Suppress metastasis Graff etai (1995) TIMP3 Inhibit metastasis Bachmanť/í//,(l999) Genome instability hMLHI DNA missmatch repair Esteller (2000) (enabling characteristic) M GMT Repair alkylated guanine Qian and Brent (1997) BRCA1 Repair DNA damage Bianco et al (2000) DAP-kinase, death-associated protein kinase: M GMT, 06-methylguanine DNA methyltransferase; RAR/f, retinoic acid recept or-/í2; Rb, retinoblastoma; TIMP3, tissue inhibitor of metalioproteinase-3; VHL von Hippel Lindau tumor suppressor gene, The table is illustrative, but not comprehensive, For a list of many cancer-related genes silenced by aberrant methylation, see Tsou etai, 2002, "anahan and Weinberg (2000), IMORTALIZACE BUNĚK Imortalizace zahrnuje inaktivaci specifických nádorově supresorových genů jako jsou RB a p53, které se účastní regulace přechodu Gl-S fáze buněčného cyklu a indukce apoptózy i dalších genů spojených s buněčným cyklem a apoptózou. Kromě toho existuje v buňkách mechanismus - buněčné hodiny - odpočítávající počet dělení a regulující stárnutí buňky. Normální somatická buňka m ireverzibilní zástava růstu tzv. j TELOMERY -jsou vysoce konzervované nukleoproteinove komplexy přítomné na koncích chromozómů a obsahují tandemové opakující se sekvence DNA bohaté na guanin (TTAGGG) obalené specifickými na DNA se vázajícími proteiny. Telomery tvoří protektivní čepičku kolem genomové Dl^ chromozomálním ztrátám a aberantním fúzím během mitotického cyklu. Te1 luněčnými děleními, což může způsobit genovou nestabilitu a změněnou ge„ procházejí krizovým stadiem (Hayflickův limit) nebo umírají. Zkracování telomer vybudí proliferativní stárnutí přes aktivaci pRB a p53 kontrolních bodů, což vede u p53-wild typů k zástavě proliferace. Dochází k bariéře v proliferaci charakterizované dysfunkcí telomer, extrémní genomovou nestabilitou a rozsáhlou smrtí buněk mechanismy závislými i nezávislými na p53. existují zádi kači j iných druhů. Heterogenita průměrné délky telomer odráží genetické rozdíly a komplexní rovnováhu mezi procesy, které vedou k degradaci a těmi, které prodlužují telomery. Např. buňky se sebeobnovnou kapacitou mají delší telomery než diferencované, nebo telomery lab. myší jsou delší než u člověka. Telomery jsou kratší u lidských somatických tkání ze starších lidí než u mladších jedinců nebo u zárodečných buněk. Děti s genetickými nemocemi projevujícími se rychlým stárnutím tzv. progerickým syndromem (Down, Werner, At. telangiectasia) umírají v raném věku s tělem 90ti letých a jejich telomery jsou drasticky zkráceny. Imortalizované buňky vznikající z krizového stadia (inaktivací p53 a pRB, overexpresí cMyc a Ras a v důsledku vážné genové nestability) obnovují funkci telomer aktivací telomerázy, alternativním telomery udržujícím mechanismem (ALT) nebo jiným adaptivním mechanismem. Ve skutečnosti mají nádorové buňky kratší telomery než jejich odpovídající normální buně< Tyto telomery se dále zkracují během progrese nádoru a u myších exp. modelů, jsou zkrácené telomery spojeny se zvýšenou genetickou nestabilitou a zvýšenou nebo redukovanou spontánní malignitou v závislosti na genetickém kontextu. Mnoho faktorů (genetických, nutričních, hormonálních, environmentálních, farmakologických) může modulovat udržování telomei notenciál buněčného : itgiaiCT TELOMERAZA. Telomery nejsou udržovány normálním replikačním procesem. U kmenových, nádorových a imortalizováných buněk, je zkracování telomer zastaveno aktivací telomerázy -reverzní transkriptázy, která rozšiřuje telomerické TTAGGG opakované sekvence. 3 hlavní složky: s telomerázou spojený protein, TLPl, telomerázovou RNA -hTR a telomerázovou 1 tickou iednotku TP2 - lidská telomerázová reverzní ti Lomeraza používa svou UßllKKI ji gitygjsp na telomery, zatímco katalytická proteinová jednotka u transkripcí temniátu RNA. Telomeráza je vysoce exprimována ve většině nádorů a kmenových buněk, středně v hyperplastických a metaplastických buňkách a velmi nízká nebo žádá v normálních dif. tkáních a postupně se snižuje s věkem. Její exprese i e spojena s vysokým proliferačním indexem a obnovným tkáňovým potenciálem. agresivitou nádorů, vvsokým histopatolosickvm sradem a s proliferací cévního endotelu. Telomerázová aktiv; 'erexprese je c? T^uftnwj aceni leiom lorove supresorový gen, ale regulována nahoru nebo dolů mnoha fakto^ důležitým predisponujícím dějem u karcinogeneze nebo cílené nádorové terapie. Homeostáza systému telomery - telomeráza je komplexní a je svázána s genetickými a environmentálními faktory. _enciační činidla, epigallocatechin gallate ( cisplatina, doxorubicin, protein fosfatáza 2, MAPK, tamoxifen, androgeny, volné radikály, inhibitory reverz, tarnskriptázy) a řada zvyšuje (I chemické karcinogény, mutace telomerických sekvencí, gamma záření, PKC, EGF, estrogeny) telomerázovou aktivitu. Vztahy mezi telomerázovou aktivitou a nádorovým onemocněním jsou složité a jen částečně objasněné. Telomeráza může paradoxně buď podporovat nebo inhibovat tvorbu nádorů v závislosti na genetickém kontextu U nádorovvch buněk i sou telomerv kratší a telomerázová aktivita obwkle následuie do zkracování telomer. Ztráta funkce telomer při raném dělení zahajuje genetickou nestabilitu, zatímco v pozdějším bodě progrese nádoru absence telomerázy inhibuje růst. Tak zatímco inhibice telomerázy u ustanovených nádorů může být cenným terapeutickým přístupem, na věku závislé zkracování telomer může být rizikovým faktorem pro nádory tím, že umožňuje obejít kontrolní bod mortality. Systém telomery-telomeráza představuje komplexní skupinu molekul interagujícíh jsou spojeny také odpovídající problémy. ' ľoviiL ne lom e razy z y ;hanismů na buněčné a zejména organismální úrovni, nelze tento probL zjednodušovat. Z onkologického hlediska, může overexprese telomerázy zvyšovat riziko vzniku nádc Včkoliv normální buňky s delší dobou života a udržovanými telomerami se nejeví jako neoplastické, zpoždění fyziologické smrti může zvyšovat pravděpodobnost kontaktu s karcinogény. Telomeraza sama také zvyšuje onkogenní potenciál predisponovaných buněk a je cílem protinádorových terapií. Zatím se pozornost soustřeďuje na zvýšení doby života několika cílových buněk nebo snížení proliferujícíh nádorových buněk. Málo pozornosti je věnováno organismální úrovni, mikro- a makroprostředí, ve kterém tyto buňky rostou jako normální nebo imortalizovai angiogenezi, růstovým a difernciačním faktorům, cytokinům, hormonům, imunitnímu environmentálním faktorů ;mu a ? ? ? ? ? Zbwá odnovědět na otázkv: Je bezpečné prodlužovat lidský život použitím terapeutických látek? Je lepší prodlužovat lidský život nebo zlepšovat kvalitu života? Rozšiřování na guanin (G) bohatých telomerových vláken telomerázou ■GGGTTAG AAUC GGGTTAGGGTTAG S' GGGTTAGGGTTAG The telomerase holoenzyme contains protein subunits including a catalytic subunit with reverse transcriptase activity and an RNA molecule that acts as the template for addition of TTAGGG repeats to telomeres. c; CT- O Q c •4—' CL C CL immortalization crisis p53-minus TPA senescence Time in Culture Normal cells divide a limited number of times before permanently exiting the cell cycle and remaining in a viable non-proliferative state referred to as senescence (1). If p53 is inactivated in these cells, the cells may resume dividing a limited number of times, before they permanently exit the cell cycle (p53-minus TPA) (38,39). If p53 and the pRb/pl6INK4a pathway are both disrupted, for example, by the presence of SV40 or HPV viral oncoproteins, the cells may bypass senescence but subsequently arrest in a state referred to as crisis (44). A rare cell (~1 in 107) may escape from crisis and become immortalized. Transduction of some normal cells with hTERT expression constructs may result in expression of telomerase and bypass of senescence. Zkracování telomer může vést k chromosomální nestabilitě a vzniku nádoru SELF-RENEWAL OF EPITHELIAL CELL POPULATION BY REPEATED CELL DIVISION -----------------telomeres shorten and uncap f normaí p53 and ceil cycle checkpoint control i loss of p53 and cell cycle checkpoint control 4 mutant cell survives and proliferates! chromosome fusion CHROMOSOME f \ normal senescent cells stop dividing BREAKAGE- chromosome FUSION-BRIDGE translocation CYCLE . f chromosome breakage chromosome bridge cell dies dueto | catastrophic genomic "*" instability and DNA damage \ massive chromosomal damage telomerase reactivated chromosomes are partially stabilized and cell survives with many mutations \ CANCER JFigure 23-36. Molecular Bioiogy of the Cell, 4th Edition. Imortalizace je nutná,ale ne dostačující pro maligní transformaci Normal cells rati ras SVWransduoed V^_ mortal cells r.:ťs SV4G-immortalized cells V No transformation! No transform alio n I _^ Maligr^anr. iransfoirnalionl B ras Normal cells ^ ME< immortalized cells ras *MEK Premalure senescence Malignant transformation! A) In a number of in vitro models it has been shown that oncogenes, such as activated ras, can cause malignant transformation of immortalized cells but not their normal mortal counterparts. In the example illustrated, activated ras caused malignant transformation of SV40-immortalized fibroblasts, but not normal fibroblasts nor SV40-transduced fibroblasts that had not become immortalized (67). (B) Mouse fibroblasts transduced with activated ras obtain a constitutively active MEK signaling pathway. In immortalized cells this may result in malignant transformation, but in normal cells this results in upregulation of p53 and p16INK4a and premature senescence (74). Adenovirová terapie využívající promotoru pro telomerazu normal cell viral agent hTERT adenovirus \ telomerase- cancer cell telomerase+ viral replication blocked viral replication v á « 4 cell destruction viral release virus spread telomerase inhibitor alone m tumor size telomere length (kbp) » 7 6 1 i»MBLUii. 5 conventional therapies alone tumor size telomere length (kbp) « « 1M1 4 • iiiiij«M».,ii i. iiiüiaMBtüiüj liii'iaimi. 7 7 7 conventional therapies + telomerase inhibitor tumor size telomere OTIIÍI—lift DÍTI length (kbp) 7 5 apoptocic ► time of treatment