Předmět: GENOTOXICITA A KARCINOGENEZE SYLABUS VZNIK A ROZVOJ NÁDOROVÉHO ONEMOCNĚNI Genetické teenotoxicke) a enisenetické (nesenotoxické) asnektv vzniku a rozvoie nádorů Fáze karcinogeneze Iniciační, podpůrná (promoční) a progresivní fáze, genetické a epigenetické faktory, karcinogény a kokarcinogeny, antikarcinogeny Typy nádorů Nádory spontánní a indukované (onkogenní viry, chemické a fyzikální karcinogény), nádory benir maligní, invaze, metastázy, klasifikace podle tkání. Molekulární základy vzniku a rozvoie nádorového onemocnění Genetické mechanismy Mutace a mutageny, nádorově promoční faktory (exogénni a endof" Protoonkogeny, onkogeny, nádorově supresorové geny Transformace buněk Denzitně závislá inhibice růstu (kontak závislosti na pozitivních a neaativních růstových faktor« Imortalizace Význam telomer, telomeráz} Negenotoxické (epigenetické) mechanismy Metylace DNA, acetylace histonů, změny exprese genů Změny v regulaci proliferace, diferenciace a apoptózy Změny v mechanismech přenosu (transdukce) signálů Antiproliferační molekuly -jejich vztah k růstovým faktorům, receptorum a dalším součástem kaskády přenosu signálů. Úloha buněčného cyklu a jeho změny v karcinogenezi Rovnováha v buněčných populacích Poruchy proliferace, diferenciace a apoptózy (apoptóza a nekrózíN Patologické účinky cytokinů parakrinní a autokrinní regulace, poruchy pozitivních a negativních regulátorů, důsledky. Význam oxidativního metabolismu rovnováha oxido-redukčních dějů, aktivační a deaktivační enzymy, pro- a antioxidační systémy, oxidatívni stres Úloha oxidačních procesů v apoptóze Komunikace buněk Mimobuněčná, mezibuněčná a vnitrobuněčná komunikace, úloha mezerovitých spojení tzv. "gap junctions" (GJIC) v udržování tkáňové homeostázy, poruchy mezibuněčné komunikace u nádorových buněk, snižování počtu gap junctions, klonální množení iniciované buňky. Změny membránových vlastností, rozpoznávání a komunikace buněk, kadheriny, kateniny, integriny, konexiny. Metastázy Příčiny vzniku, metastatická kaskáda, kontakt buňka-buňka, buňka - mimobuněčná matrix, změny adhezivních molekul a vnitrobuněčného signálování, imunitní systém Angiogeneze Význam, induktory a inhibitory angiogeneze Vznik a rozvoi specifických tvou nádorů Hei ich genetické a eDieenetické Dříčinv) Poruchy krvetvorby - leukémie Chronická myeloidní 1., myelodysplastický syndrom, akutní 1., genetické poruchy, rozpojení procesu proliferace a diferenciace, poruchy apoptózy Nejčastější typy nádoru - kolorektální karcinomy, nádory prsu, prostaty, i Genetické a negenetické příčiny, prekancerózní stavy, etiologie, rozvoj, vnější faktory Endogenní karcinogeneze, hormonálně závislé nádory Přirozenéprotinádorové obranné mechanismy Úloha imunitního sytému, cytostatické a cytotoxické účinky monocytů a makrofágů, působení cytokinů a eikosanoidů FAKTORY VNEJSIHO PROSTREDI V PROCESU KARCINOGENEZE Záření - neionizující a ionizující Chemické karcinogény - polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH), halogenované aromatické uhlovodíky (PCB, PCDD), peroxisomové proliferátory, xenobiotické lipidy, chlorované pesticidy, atd. Onkogenní viry a bakterie Důsledky působení škodlivých faktorů vnějšího prostředí Genotoxické vs. negenotoxické účinky (epigenetická toxicita) - charakteristika Poruchy homeostázy - modulace buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy - příčiny a důsledky, vztah ke karcinogenezi Mechanismy - změny v reparaci DNA, specifické vnitrobuněčné receptory, působení reaktivních forem kyslíku - oxidatívni stres, inhibice GJIC, ovlivnění mechanismů transdukce signálu, změny metylace DNA, ovlivnění exprese onkogenů a nádorově supresorových genů Nutriční aspekty karcinogeneze Karcinogény v potravě, promoční a antipromoční působení složek potravy (vitamíny, antioxidanty) Obsah a složení tuků v potravě, polynenasycené mastné kyseliny (n-6 a n-3 mastné kyseliny) a jejich metabolity jako mediatory a modulátory buněčných signálů, mechanismy působení, oxidatívni metabolismus, lipidová peroxidace, imunitní systém, úloha eikosanoidů v karcinogenezi - interakce s cytokiny Vláknina - mastné kvselinv s skrátkvm řetězcem - butvrát mTraTEBi JIC, detekcí Současný systém detekce karcinogenních účinků látek Genotoxicita (mutagenní účinky) - testy mutagenity Problémy detekce negenotoxicky působících karcinogénu. Dlouhodobé testy na laboj testy - testy buněčné transformace, změny proliferace a apo* biomarkerů (aktivity specif, buněčných enzymů a receptor Modely karcinogeneze - studii čichové orgány Příčiny rozdílné citlivosti (organismů, tkání a buněk) k působení karcinogenních látek Odhady rizik - otázky dávek, prahové hodnoty, křivky dávka-odpověď, působení směsí látek (aditivitř Synergismus, antagonismus Význam experimentálníekotoxikologie - perspektivy, propojení s experimentální a prediktivní onkológií PREVENCE, DIAGNOSTIKA A LECBA NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNI Experimentální, epidemiologické a klinické studie, populační screening Genetická predispozice, životní styl Terapie - chirurgie, záření, chemoterapie, imunoterapie Predikíivní onkológie Typizace nádorů, diagnostické markery, prognostické vs. prediktivní faktory Detekce specifických parametrů - cytokinetické parametry, molekulární a jiné marker} Moderní metody (průtoková a vysokorozlišovací cytometrie, laser scanning, molekulární a další metody, microarrays), stanovení proliferační aktivity, detekce apoptózy Data managment - význam vícerozměrných matematických analýz, prediktivní markery DoDomčená literatura B. Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 4rd edition, Garland Science, New York 2002 B. Alberts et al.: české vydání - Základy buněčné biologie, Espero Publishing, Ústí n./Labem 1998 U.R. Folsch, K. Kochsiek, R.F. Schmidt: Patologická fyziologie, GRADA Publishing, Praha 2003 7 A rl^m, J. Vorlíček, J. Koptíková: Obecná onkológie a podpůrná léčba, GRADA Publishing, Praha 20^ P. Klener: Klinická onkológie, Nakladatelství Galén a Karolinum UK Praha, 2002 rejsek, O. Kopecký: Klinická imunologie, NUCLEUS HK, 2004 .dam, J. Vorlíček, J. Vaniček a kol.: Diagnostické a léčebné postupy u maligních chorob, 2. vydání, GRADA Publishing, Praha 2004 . Rejthar, B. Vojtěšek: Obecná patologie nádorového růstu, GRADA Publishing, s. r. o., 2002 . Štípek a kol.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a v nemoci, GRADA Publishing 2000 V. Hořejší, J. Bartúňková: Základy imunologie, 2. vydání, Triton, Praha 20' Elseviei Carcinogenesis, Vol J. Hofmanová, A. Kozubík: Apoptóza a nádorová onemocnění - Přehled, Klinická onkológie 8, 5, 1995. A.Kozubík, J. Hofmanová: Význam nenasycených mastný - Přehled, Klinická onkológie 1999 J. Hofmanová, M. Machala, A. Kozubík: Epigenetic mechanisms of carcinogenic effects of xenobiotics vitro methods of their detection. Review. Folia Biologica (Prague) 46 Doporučené speciální separáty mil»! wjtnmm RAKOVINA nejrozšířenější epiteliální nádory řecky - karkinos -ra onkos (kra'.., cancer (angl.) der Krebs (něm.) - karcinomy ONKOLOGIE - věda o nádorec adorova onemocněni KARCINOGENEZE (kancerogeneze, onkogeneze, dorového onemocnění iTmnuqii j^gaUE Pojem „rakovina" odpovídá více než sto formám této choroby. Téměř všechny tkáně v těle mohou podlehnout malignitě. Asi 30 trilionů buněk v normálním zdravém organismu žije ve složitém vzájemně propojeném svazku, regulujíc vzájemně svou proliferaci. Vzájemná spolupráce buněk zajišťuje, že každá tkáň těla udržuje svou velikost a architekturu . Nádorové buňky naopak ničí toto schema, stávají se hluchými k obvyklé kontrole proliferace a vytvářejí si svůj vlastní vnitřní program reprodukce. Kromě toho mají ještě nebezpečnější vlastnost - schopnost migrovat a tvořit masu ve vzdálených částech těla. Nádory z takovýchto buněk se stávají čím dál agresivnější a stávají se letální, jestliže rozrušují tkáně a orgány důležité pro přežití organismu jako celku. Nádory vznikají z naší vlastní tkáně. Teorie „nádorové kmenové buňky" - nádor je obecně odvozen od jedné buňky která se dramaticky mění po sérii genetických změn. Zdravá buňka má definovaný tvar a strukturu a prosperuje mezi uspořádanými okolními buňkami. Odpovídá na podněty ze svého okolí a dává vznik dceřinným buňkám jen tehdy, jestliže rovnováha stimulačních a inhibičních signálů z okolí upřednostní buněčné dělení. Avšak v procesu replikace nebo dělení existuje stálá hrozba vzniku mutací, náhodných změn, které mohou tento regulační cyklus porušovat. Jedna mutace může způsobit, že buňka, která vypadá normálně a je méně citlivá na vnější signály se může příležitostně začít nekontrolované dělit. Akumulace genetických změn může způsobit, že se dceřinná buňka stane zcela hluchou k externím signálům a vykazuje znaky malignity. Buňka ztrácí přesný tvar a hranice, nereaguje na růstově inhibiční signály a získává schopnost nekontrolované se dělit. Vznikající masa stlačuje a poškozuje zdravou tkáň ve svém sousedství a může dále překonávat bariéry jednotlivých orgánů a metastázovat, což znamená, že kolonizuje vzdálené tkáně. MUTACE - dědičná genetická změna v buňce (vzniká bodovou mutací, delecí nebo inzercí jednoho či více nukleotidů, amplifikací segmentů DNA, inverzí nebo získáním či ztrátou chromozomu, translokací). Základem je změna genetického materiálu v !eho expresi. .ylENA - je změna v genové expresi beze změny v sekvenci DNA nebo genetickém obsahu buňky - může být dědičná INICIOVANÁ BUNKA, TRANSFORMOVANÁ BUNKA - buňka se změněnou genetickou informací. Vzniká spontánně neboje indukována viry, chem. látkami nebo fyzikálními faktory. Má potenciální schopnost stát se nádorovou nebo maligní. BENIGNÍ NÁDOR - je lokální rozrůstání iniciované buňky. MALIGNÍ NÁDOR - nádor se schopností vrůstat do tkání a rozšiřovat se do vzdálených míst. IGNI TRANSFORMACE - přeměna buňky s normálními růstovými jostmi na buňku maligní ztrácející schopnost adekvátně reagovat i odpovídat na růstové signály. Ztráta kontaktní inhibice růstu. Porušení negativní zpětné vazby. Snížená schopnost komunikace pomocí mezibuněč gap junction^ ovy rust) se používa pro celý rozsah benigního i unek ZÁKLADNI KLASIFIKACE NÁDORU Výchozí tkáň Zralé benigní buňky Nezralé maligní buňky (nezhoubné) (zhoubné) TUjZáJlffil FriMiiniii KuBnTnl^TTMnTiTm \i%%ívi%Mmmsmí ÍmijBtÍTI ÍMijBKHiirTmTl ■mrtiHl mimu UmSHSIBj R^W^W^J rami m mi m í M i I» i HI á IKHTimTill rcreii fila ran m PmT?ÍKHTimTill kwh ni^nm iÜL^Ü^züJLiU ill nasi ÍTVOI LYMFATICKÁ kě m gv/tyAwm ;u ;i i .ti eriferní MEl pihu mi il liinii ixTM p I min UPI 11 lioneu. gangliom [^^u^^^^mra Hmgm3?TimTff) leukémie lymfom, myel irm 3 min mam in leuroblasto mrniTiJT i paragí mlírmil emino umt ermino m Vznik nádoru je vícestupnovitý proces, který je výsledkem složité interakce genetických a negeneticky působících faktorů 'Cl - onální růst iniciovaných preneoplastických buněk -fáze podpůrná - promoční - karcinom in sit 3) Fáze konverze či transformace - změna fenotypu, \ maligního klonu 4) Fáze progrese - lokální rozrůstání nádoru, neschopnost odpovídá na regulační mechanismy, vzrůstající rychlost prolifera "vazivita - šíření nádoru mimo prvotní ložisko - vznik metastáz Onemocnění vzniká v zásadě v r ením homeostázv na úrovni INICIACE (initiation) ireverzibilné mění normální buňku v preneoplastickou PROMOČNÍ STADIUM (promotion) nebo po smrti buněk, růstové signály, působení vnějších signálů - chem. a a fyz. faktorů) zpočátku reverzibilní, později ireverzibilní - přechod do maligní transformace PROGRESE (progression) akumulace dalších mutací + působení promočních faktorů, ztráta regulačních mechanismů invazivita a vznik metastáz ZÁKLADNI ZNAKY NÁDOROVÉ POPULACE ztráta kontaktní inhibice a kontroly růstu ztráta schopnosti terminálni diferenciace ztráta schopnosti apoptózy snížení nebo inhibice mezibuněčné komunikace Ztráta kontaktní inhibice v buněčné kultuře contact-ínhibitedl monolayer of normal cells growth medium plastic tissue-culture dish multilayer of uninhibited cancer cells Figure 23-25. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. INICIACE MUTAGENY RADIACE VÍRUSY.... GENOTOXICITA PROMOCE NEGENOTOXICKE KARCINOGÉNY GENOTOXICKE +NEGENOTOXICKÉ FAKTORY NORMÁLNI BUŇKA INICIOVANÁ. BUŇKA PRENEOPLASTICKE PORUCHY MALIGNÍ NÁDOR INVAZE METASTÁZY AKTIVACE PROTO-ONKOGENU INAKTIVACE NÁDOROVĚ SUPRESOR. GENŮ INAKTIVACE ANTIMETASTAT. GENŮ Mnohostupnový proces karcinogeneze INICIACE PROKARCINOGEN kokarcinogeny exog., endog. (hormony) AKTIVACE VAZBA NA DNA REPARACE DNA NORMÁLNI DNA KARCINOGÉN NENÍ REPARACE DETOXIFIKACE antikarcinogeny (selen, antioxidanty, složky potravy, vit. A, C, B) MUTOVANÁ DNA V REPRIMOVANÉM STADIU PROMOCE DEREPRESE KARCINOGENEZE NÁDOR MUTOVANÁ DNA V REPRIMOVANÉM STADIU PROMOTORY POKRAČUJÍCÍ REPRESE PROMOTORY NORMÁLNI STAV NEVZNIKÁ NÁDOR ANTIPROMOTORY ANTIPROMOTORY Homeostáza ve tkáních je udržována integrovaným systémem komunikačních mechanismů (mimo-vnitro- a mezibuněčných) a reguluje chování buněk především s ohledem n schopnost proliferace, diferenciace, adaptivní odpovědi a apoptózy. Iniciované preneoplastické buňky jsou udržovány v latentním stavu v důsledku V podpůrné (promoční) fázi rozvoje nádorů se uplatňují látky působí" negenotoxickvmi (nebo epigenetickvmi) mechanismy, tzv. nádorové promotory, které způsobují změny chování buněk v důsledku deregulac zmíněných procesů. U ,ahy, které * odehrávají ímena ěnám v expr 'vch úrovi esi genů a k poruchám homeosi a Způsoby promoce iniciované buňky DNADAMAQINQ AGENT PLURIPOTENT STEM CELLS DNA LESION MUTATED QENE - JINITIATIONI OrrtKifitbU) PARTIAL PHYSICAL NECROSIS OHOWTH EXOGENOUS MEPATECTOMV IRRITATION DUE TO VIRAL, STIMULUS PROMOTERS RADIATION OR CHEMICAL TREATMENT . v*-------:*----------,----------*L______é/ DEREPRESSION OF GENES I {REVERSIBLE) ■ | PROMOTION] FT?: REPRESSION OF OENES ADDITIONAL O EN E OR CHROMOSOMAL MUTATION (IRREVERSIBLE) 4 AUTONOMOUS TUMOR FIG. 1. Multiple modes by which initiated cells can be promoted. The concept of promotion is shown as a process that allows cells with a specific carcinogen-induced mutation to multiply, enabling them either to reach a "critical mass" and become resistant to the antiproliferative influences of normal cells or to increase the chance that one of these mutated cells would accumulate a second mutation. [From Ref. (93) with permission from Churchill Livingstone Medical Journal.] BIOLOGICKÉ CHARAKTERISTIKY STADII KARCINOGENEZE INICIACE Genotoxický děj (mutace) Změna v genetickém materiálu (nukleotidy, chromozómy) Ireverzibilní změna Vznik preneoplastické buňky Vykazuje dávkově závislé vlastnosti Možný "spontánní vznik iniciované buňky" Je nutné buněčné dělení pro "fixaci" mutace Při dávkové závislosti neexistuje práh PROMOCE Negenotoxické (epigenetické) děje Reverzibímí změny Selektivní klonální expanze preneoplastické bun. populaci Závislá na konstatní expozici látkou s promočními účinky Vykazuje dávkově závislé vlastnosti Je zjevný prát PROGRESE Genotoxické i negenotoxické děje Změny karyotypu a genetická nestabili Ireverzibilní změna Tvorba neoplastických útvarů (adenomy a karcinomy) Změny podporující přechodr Autonomie nádorové popula Vznik metastáz MUTACE ké informaci "" jako kvalitativní nebo kvantitativní z1 , DNA. Je považována za ireverzibilní změnu a může být indukována viry, fyzikálními nebo chemickými faktory. Mutace mohou vznikat na úrovni genů nebo chromozómů. Jeden specincKy gen může být změněn přidáním, ztrátou nebo záměnou jedné baze. Protein kódovaný tímto genem pak může být změněn s ohledem na stru1" funkci. Jestliže mutace zahrnuje změnu v počtu chromozómů v buňce (nondisjunkce, Horn, mvvĚywwrtfwgmmmK íl^iMMigwiirMiiMí^gjeiÍMai«M^»tMMi'«'illMBi»w»"M*M^"»'' naruší rarraiiiTffiggp íEi:<*Miir>]iit]fai>iiEft]M ÍBiElKl9S^3BTBlSfílKMÍIIt»[miHI WBSEM Změny v uspořádání chromozómů způsobené delecí nebo translokací části jiných chromozómů i ^těnýcl ědičné mutace (Xeroderma pigmentosum, Wilmsův tumor, albinismus atd.) mohou předurčovat jedince k určitým typům nádorů. Fyzikální a chemické faktory, které působí jako muta. nádorovému procesu jako iniciátory nebo progresory. PV^BPV3tvQ m Egsiime^ňfRfrjifl ^^^| Genetické změny a disorganizace chromosomů v nádorových buňkách DNA chromosome gene A Illliflll illtllllllli WěWěěěM -nint ; , - i 7 / ÉlIifitŠI xmmmmm< 8MR translocation lÉSfillilfll {ÍBBW!xUÄ;Wä^ ilSlIBII npnp A ...,--"* ■■^'■''■''■'■ ' fHH viral ; mL_ genetic 1 / material inserted gene B gene B Geny se dědí v odpovídajících párech MATERNAL CHROMOSOME NORMAL COPIES , OF GENE 1 NORMAL COPIES OF GENE 2 PATERNAL CHROMOSOME ACTIVATING MUTATIONS .MUTATED GENE INACTIVATING MUTATIONS a MUTATED GENEX v?----------■—■■ .-víW^ irriJjSiříiMMřřfi MUTATED GENE YIELDS ABNORMAL PROTEIN OR TOO MUCH PROTEIN ,NORMAL GENE MUTATED GENE YIELDS NO PROTEIN OR AN INACTIVE FORM NORMAL GENE, HEALTHY GENE YIELDS NORMAL PROTEIN IN NORMAL AMOUNTS Cell continues to function properly MUTATED GENE ppppjpwy Í5 MUTATED GENE. Cell proliferates excessively Cell proliferates excessively GENES ARE INHERITED IN MATCHING PAIRS—one from the mother and one from the father (top). Sometimes mutation of a single copy pushes a cell toward cancer (left)—such as when it leads to production of a protein that activates excessive cell division. (Oncogenic mutations fall into that category.) Other times both copies must be altered—such as when a gene coding for a protein that stalls cell division is inactivated (right). If only one copy of such a gene is affected (a), the other copy can still generate the needed protein. But if both copies are hobbled (b), an important brake on tumor development is lost. Mateřský a otcovský chromozóm nesou každý jednu normální kopii příslušného genu • Aktivační mutace - mutovaný gen produkuje protein aktivující bun. proliferaci, stačí mutace v jedné kopii genu, dominantní • Inaktivační mutace - mutovaný gen neprodukuje protein zastavující bun. proliferaci nebo produkuje jeho inaktivní formu. K mutaci musí dojít u obou kopií genu, recesívní Vznik nádorové bunky - klonalm evoluce NORMAL EMERGENCE OF A CANCER CELL from a normal one (tan) is thought to occur through a CELL Normální buňka process known as clonal evolution. First, one daughter cell (pink) inherits or acquires a cancer-promoting mutation and passes the defect to its progeny and all future generations. At some point, one of the descendants (red) acquires a second mutation, and a later descendant (green) acquires a third, and so on. Eventually, some cell (purple) accumulates enough mutations to cross the threshold to cancer. 1 mutace Buňka vypadá normálně, ale je predisponována k nepřiměřené proliferaci FIRST MUTATION Cell seems normal but is predisposed to proliferate excessively 2 mutace Buňka začíná příliš proliferovat, ale jinak je normální „r-««^« ....-r.-»».., Ce" begins to proliferate too much SECOND MUTATION but is otherwise normal Buňka proliferuje rychleji a dochází i ke strukturálním změnám THIRD MUTATION Maligní buňka MALIGNANT CELL Cell proliferates more rapidly; it also undergoes structural changes Buňka nekontrolovane roste a vypadá evidentně porušená cm mru no Ce" o/ows uncontrollably i ?™ MiiTATirtw and l00ks obviously LATER MUTATION deranged 4 a další mutace VYZNÁM MUTACI U NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNI Normální frekvence mutací 10~7-10~8 /nukleotid/bun Zvýšená frekvence mutací podporuje karcinogenezi. Mutace jsou nejen znakem nádorů, ale jsou také zásadní pro jejich vývoj. Genom nádorových buněk je nestabilní a tato nestabilita vyúsťuje v kaskádu mutací, z nichž některé umožňují nádorovým buňkám obejít regulační procesy, které kontrolují lokalizaci buňky, její dělení, adaptaci a smrt. Genetická nestabilita je manifestována velkou heterogenitou buněk v každém nádoru. Dva hlavní mechanizmy vzniku mutací v nádorových buňkách: ► deficit v rei NA DNA' ► deficit v rozdělování chromozómů při buněčném dělení V buněčné DNA dochází ke stálému poškozování (environmentálními i endogenními zdroji) a k resyntéze. Mnoho z takto působících látek jsou mutageny a řada z nich i karcinogény. ► rozsáhlé adukty reparované excisí (vystřihnutím) nukleotidů ► malé změny vznikající např. po alkylačních činidlech, která přidávají metyl- a etylskupiny do nukleotidů, a ty jsou pak reparová* ÜHä Další zdroje poškození DNA: ►buněčné metabolické procesy (reaktivní kyslíkové produkty-ROS) Vzhledem k vysoké frekvenci poškození je pravděpodobné, že významná čás ~ní unikne reparaci a produkuje mutace během replikace této nereparované HJéMMíMB Mutace mohou vznikat též chybnou inkorporací nukleotidů DNA polymerázami při »oškozeného templářů DNA, během replikace nebo reparaci otidove sekvence v bunecne DNA jsou udržovaný v homeostaticke avnováze, kdy vzrůst poškození DNA nebo snížení reparace vedou ke zvýšené frekvenci mutací. Mutagenesis Homeostasis Průmyslové chemikálie Přírodní karcinogény Industrial Natural C he mí cal C a rci n o ge ns \ Endogenní zdroje Endogenous Sources Frw Deputation J™»!. "»SKE"— DNA Repair \ \ \ Nereparovaná poškození DNA Chybně inkorporované nukleotidy [disincorporated Unrepaired DNA Damage Nucleotides -MUTACE Mutations / How genetic mutations evolve into genomic instability phenotypes and cancer Clonal selection Genetic Instability (NIN, MIN) 4 Chromosome Instability (CIN) Altered chromosome structure and numbers, contmuouE karyotype change Cause of genetic change : Stress factors and genotoxic insults UV, radiation, ROS, Free Radicals, Viruses. Bacteria, excessive hormone exposure, growth signals Spojení genotoxického stresu a genomové nestability. Díky genetické nestabilitě dochází během času k akumulaci mutací buď v gametách :netické změny zahrnuté v i ira mwi ret i mtumw nebo somatických buňkách. Somatické genetické nestabilitě postihují funkce jako je reparace DNA a kontrolní body bun. cyklu CMM 9i mitíW což předchází zvýšenou telomerázovou aktivitu. Somatické buňky však ' dysfunkci tzv. gatekeeper. Mutace umožňující genomovou nestabilitu jsou v gametách i somatických buňkách selektovány Ke genetické nestabilitě přispívají dva překrývající se mechanizmy : ► nádorové buňky vykazují mutovaný fenotyp založený na vzrůstajícím poctu chyb v syntéze DNA během replikace. Tyto chyby vznikají v důsledků mutací - v DNA polymerázách, takže vnášejí chyby - v DNA reparačních proteinech, které jsou potom defektní ► akumulace mutací založená na postupných vlnách klonální selekce. Buněčný cyklus a apoptóza V průběhu buněčného cyklu existuje několik kontrolních bodů, kde je monitorována reparace poškození před vstupem do následující fáze. Při aktivaci se v těchto bodech cyklus přechodně zastavuje, aby mohla být poškození reparována. Eliminace těchto kontrolních bodů (např. mutace v p53, pRb) vede k vývoji mutovaného fenotypu. V případě vzniku nereparovatelného poškození se normálně spouští apoptóza, která zabrání rozšíření mutací. Mutace, které zpožďují nebo zabraňují apoptóze tak podporují přežití geneticky nestabilních maligních buněk. Mikrosatelity Velké množství mutací (až 100 000 např. u nádoru kolonu) se nachází imiriiíiyHirannrar ^Qnj^ájJiSiMiiiSiiläiXĽl^S^ imtmimunimmuMWi 'unej zkracovány nebo prodlužovány s vysokou frekvencí. Tak dochází patrně k \mS^ßSSmmSfS!^^ßr^SSS!^^!nSmm^mM9KSnEKm Na nestabilitě mikrosatelitů se ve velké míře podílejí ROS, takže se uvažuje LISI Nádory vykazující nestabilitu mikrosatelitů obsahují často změny v déle repetit, sekvencí uvnitř řady genů spojených s nádory jako je APC, spec růstové faktory-IGF, TGF-beta, metastatické geny-hMSH3, hMSH6. Téměř všechny nádory prsu a vaječníku studované s využitím srovnávací 'idizace obsahují řadu změn v počtu genových kopií genom* ^MIMUJI Genetická nestabilita nádorových buněk se projevuje ► nukleotidů - bodové mutace na úrovni HĽJ1 £ Ji iDElÜMQLü li Bltsii ilKfsn IMMtMVSI meunloidie Nestabilita vede k mutantnímu fenotypu funkcí nebo efektem genové dávky. třednic1 víiuwmíí men ,e proteinu, Aneuploidie - změna v počtu chromozómů - vlastnost řady nádorů. Může vzniknout fragmentací chromozómů, translokací, amplifikací nebo nondisjunkcí. Progrese \/ r a \/ r 1 v ' LjaiäiiÄjBusíĽa!! íslý na akumulaci jiných typu mutac, 4wiRMlal£l!i! UgĚSM Obecně existuje pozitivní korelace mezi počtem chromozome 3otenciálem tohoto nádorového onemocnění. v n* u a Existují tetraploidní mezistup H|IK#U liraiiiMi^ra^mwnTun^aífiiííSXä11 fln lalAlJ'ili C-TT v§*)f zz&Vcivz líiitozy v i m n'; 11 i -i r r: r i ífcitiaBiEraiiBrar^SsWžCT ^zejména buňky, které postrádají funkční produkty genů kontrolujících přechod Gl/S fáze jako jsou p53, pRb, p 16, p21 i buňky overexprimující myc) schopny obnovit \o dalšího kola syntézy DNA, což vede k endoreduplik?r' [•WHWgURmTCiuuijyM Dva základni mechanizmy vzniku genetické nestabilitv: fHmjBjHffi ■e v man tná mutace 'tou m u alelác' mi ces arakte Liutace v genech pro segregaci chromozómu manifestující se fragmentací chromozómů nebo duplikací či delecí celýc Stačí pouze jedna mutace, tj. fenotyp nestability chromozómů má dominantní charakter. romozo S růstem počtu mutací přispívá ke genetické nestabilitě jev klonální selektivity. Překážky omezující růst nádor ► vliv oko ► omezená pristu] ilíku ►potřeba růstových faktorů ► nedostatečné zásobování krví ať v důsledku mutací, které yhodu a >vou klonáj :aždým kolem selekce dochází také ke vzniku dalších mutací. Vývoj nádoru založený na selekci mutovaného fenotypu. Jen málo mutovaných buněk překonává bariéry dalšího růstu. V každém dalším kole selekce dochází k progresivnímu obohacení o mutace v tzv. mutátorových genech nutných pro udržení genetické stability. Carcinogen Exposure Dysplasia Carcinoma Íri Silu Expozice karcinogénu ProlilcratiDp Omezená výživa růstové faktory RľiiľjĽľid ľ :!■■■ ::- Gr^wtti fnrl.íirpí Invasion Angiggenesis Inhibice okolní matrix Suircurrjinfl Mnlriř Nedostatečné zásobování krví InjdcqifJŕiĹ Blud f.i.pjily -n* Metastasis o o o o o o o o jo o o o°o Genetická změna + envir. faktory Genetic alteration --------------*- Environmental tactor o o o o o oonoo ogo Genetic Genetická změna alteration fcoooou ooono0 °8§° Normal tissue Normální tkáň Pre-malignant lesion Premaligní změny o°c> n° O qo0o ^oOo Genetic alteration s/ 4ML# - Oo°o°oco^ Oqx)00(To °8o°8oo u o o Primary tumor Primární nádor Genetická změna Metastasis Metastázy O : normal cell, Q: pre-malignant cell, Q ; malignant cell without metastatic ability, # : malignant cell with metastatic ability Různé dráhy vedoucí ke vzniku mutovaného fenotypu nádorové buňky cílové mutátorové geny Target Mutator Genes defective l is match iepair DNA Polymerase , Double i Strand i Repair Ch romosomal Segregation I Amplification 1 Nucleotide ' Recombination , Metabolism i i Genes icrosatellite Instability Nestabilita mikrosatelitů Chrom oso m a I Losses^ Alterations Ztráty a změny chromozómů Hypotéza mutovaného fenotypu předpokládá, že geny vyžadované pro udržení genetické stability jsou prvním cílem poškození DNA karcinogény. Mutace těchto genů pak vyvolávají mutace dalších genů v genomu. Sources of a Mutator Phenotype Zdroj mutátorového fenotypu lEXQGENOUS finical ■ray IU.V. NDOGENOUS Jjcygcn replication Error ;hcmieal AUeralign TARGET CÍL Mismatched Repair H N PC C Sporadic Cancers DNA Repair Genes 1 X.P.AT. \ Helitases J HI Dom1 Werner Synd rome Chromosome BUBs, MADs Cenlrosome- replication OMA Polymerases Nucleotide Synthesis Cell Cycle Checkpoints Tumor Suppressors MALIGNANT PHENOTYPE MALIGNÍ FENOTYP *ÜEicciger-ie£ myc. ras Divide Invade Tumor Suppressor]} Metastasize ^pz---------- IGF TGF-3 Potenciální mitotické cíle vedoucí k aneuploidii Poruchy několika procesů zahrnující jako cíle chromozómy, mikrotubuly vřeténka a centrozomy mohou (kromě abnormální cytokineze) vést k nerovnoměrnému rozdělení chromozómů během mitózy vedoucího k aneuploidii. Karcinogeneze však znamená víc než jen mutagenezi Kromě genových a chromozomálních mutací zahrnuje i negenetické (epigenetické) změny. EPIGENETICKE DEJE způsobují změny v expresi genetické informace na transkripční, translační nebo iffmial ivni eny jsou zapmany a vypína1 ► během vývoje ► během buněčného cyklu, L ► když buňka diferencuje ► když je diferencovaná buňka stimulována k adaptivní odpovědi buňka prohferuje Iniciovaná kmenová buňka je_omezena v dalším růstu okolními normálními buňkami. mizí. Aberantni epigeneticke a genetické deje mohou vest prostřednictvím nesprávné genové exprese k tvorbě nádorů EPIGENETIC EVENTS -► GENETIC EVENTS Aberrant methylation and histone tail modification Pathway disruption p53 i m ► Iniciovaná buňka se může dělit ale není schopna terminálni diferenciace jako normální kmenová buňka, akumulují se klony dysfunkčních buněk (papilomy, polypy, noduly, enzymově změněné fokusy). Faktory, které fungují jako nádorové promotory působí jako mitogeny a inhibitory programované buněčné smrti. Hormony, růstové faktory, cytokiny mohou fungovat jako přirozené nebo endogenní nádorové promotory. Chemikálie, mohou indukovat v buňkách různé transdukční signály, které vedou k blokáde kontaktní inhibice prostřednictvím inhibice mezibuněčné komunikace zprostředkované tzv. gap junctions. ► Totipotentní kmenová buňka je buňka, která může dát vznik všem buňkám v mnohobuněčném organismu, jako je oplodněné vajíčko nebo raná embryonální buňka. ► Brzy po embryonálním vývoji, některé buňky částečně diferencují v pluripotentní kmenové buňky. ► Z nich pak vznikají různé třídy buněk pro několik různých orgánů (např. slinivku a játra). Během dalšího vývoje jsou některé buňky omezeny tak , aby z nich vznikalo jen málo buněčných typů, stávají se z nich tzv. "komitované buňky". ► Konečným výsledkem komitovaných buněk je produkce terminálne diferencovaných buněk (spermie, vajíčka, keratinocyty, červené krvinky, neurony atd.). V dané tkáni a orsánu i e důležitá správná regulace a rovnováha procesů PROLIFERACE DIFERENCIACE APOPTOZA Deregulace těchto procesů vede k poruše homeostázy ve tkáni a ke vzniku nádorů TERMINÁLNI DIFERENCIACE MUTACE nebo INICIACE TERMINÁLNI DIFERENCIACE INICIOVANÁ BUŇKA SELEKTIVNÍ KLONÁLNÍ EXPANZE INICIOVANÝCH BUNĚK nebo PROMOCE |^ \| Ik sl Ik nI Ik nI Ik mI Ik nI MUTACE 2--n nebo PROGRESE MALIGNÍ ZVRAT INICIOVÁN BUŇKY Model iniciace/promoce/progrese v karcinogenezi. ßl5 míra terminálni diferenciace a smrti kmenové buňky; ß2, míra smrti, ale nedochází k term. diferenciaci iniciované buňky; oc^míra buněčného dělení kmenových buněk; oc2, míra buněčného dělení iniciovaných buněk; [iv míra molekulárních dějů vedoucích k iniciaci (tj., eventuálně mutaci); (li2, míra výskytu druhého zásahu v iniciované buňce. Nádor je výsledkem mnohocetných genetických a epigenetických změn, kdy normální buňky s kontrolovaným růstem a schopností terminálne diferencovat ztrácí tyto schopnosti a zároveň získávají schopnost rozšiřovat se do jiných tkání v těle - metastázova Jednu z hlavních teorií karcinogeneze představuje tzv. teorie buněk. 'nových Pozorování, že každý nádor se jeví jako monoklonální ve svém původu, tj. přes všechny genotypové a fenotypové rozdíly se všechny buňky nádoru vytvořily z jedné původní kmenové. Základní předpoklad zmíněné teorie karcinogeneze je, že normální kmenová buňka je nesmrtelná. Smrtelnou se stává při indukci terminálni diferenciace. Kmenové buňky se dělí "asymetricky", tj. jedna dceřinná buňka zůstává jak< kmenová a druhá získává schopnost terminálne diferencovat. S tím souvisi domněnka, že prvním krokem v karcinogenezi je imortalizace buňky. Každý nádor obsahuje malou část buněk schopných sebeobnovy : Nádorové kmenové buňky - zodpovědné za neomezený růst, minimální reziduálni chorobu, následné obnovení nemoci a metastázování. Schopnost repopulace hostitele (pacienta) danou neoplasií (včetně všech elementů, línií a subklonů primárního nádoru) po neomezenou dob Důležitý cíl terapie Neoplastické kmenové buňky identifikovány u myeloidních leukémií, nádorů prsu, prostaty, mozku a vaječníku. 3 základní kritéria kmenových buněk: Y^H^tfH Schopnost sebeobnovy, tj. proliferace bez diferenciace a bez ztrá proliferační kapacity, což umožňuje udržení zásoby nedif--------------'•■ kmenových buněk během život Seberegulace počtu kmenových buněk rovnováhou mezi sebeobnovou a diferenciací dělících se dceřinných buněk Schopnost diferenciace a maturace dostačující pro rekonstituci a dlouhodobé přežití všech funkčních elementů dané buněčné populace )lastickv k1 ■♦iiiira»iirsiiiiu?Mľfsuwi]í»fcuwirat]^i - r j r^y^awm Při vzniku nádorů nůsobí dva tvtw mechanizmů: environmentálni faktory a genetické vybavení jedince V některých případech je primární envir. faktor, který způsobí vznik nádoru u "normálního" jedince. Avšak i v tomto případě jsou zasaženy geny, protoonkogeny a nádorově supresorové geny. Kromě toho existují další geny, které mohou způsobit větší či menší citlivost (susceptibility) jedince k envir. faktorům. Předpokládáme-li, že všechny nádory jsou výsledkem iniciační, promoční a progresivní fáze karcinogeneze, měly by existovat geny, které a) buď chrání nebo predisponují protoonkogeny nebo nádorově supr. geny k aktivaci nebo inaktivaci, b) selektivně podporují nebo suprimují růst a expanzi iniciované buňky, c) zabraňují nebo zvyšují možnosti získání genetické/epigenetické nestability iniciované buňky, které zapříčiňují její malignitu. Lidské genetické syndromy: Albinismus -jedinci nemají melaninovou pigmentaci, která chrání kůži nebo oči před škodlivými účinky UV záření. Normální DNA reparační mechanismy, ale množství poškození je větší než je tento systém schopen zvládnout. Nereparovaná poškození DNA fungují jako substrát pro vznik mutací v protoonkogenech nebo nádorově supr. genech. Syndrom je klasifikován jako jako typ náchylný ke vzniku nádorového onemocnění. Protože poškození DNA je velké, mnoho buněk umírá a smrt kožních buněk stimuluje kompenzační - regenerační růst buněk přežívajících - možnost promoce iniciovaných buněk. Klony iniciovaných buněk dále exponované UV - zvýšena pravděpodobnost dalších mutačních (genetických)změn - postup populace buněk do progresivního stadia. Xeroderma pigmentosum - genetický syndrom, který také předurčuje jedince k rakovině kůže, avšak na jiném principu. Jedinci jsou nositeli genu, který neumožňuje reparovat poškození DNA indukované UV. Výsledkem jsou nereparovaná poškození DNA, která vedou ke smrti buněk nebo k Iniciovaná buňka kůže proliferuje, ale nediferenci^ citlivý k indukci dalších genet/epigenet. změn a k progresivním Jedinci s albinismem nebo XP však nejsou odsouzeni k nádorovému onemocnění. Jestliže je pokožka chráněna před UV, nemusí být vyvoláno. lou být postiženi i "normální" jedinci. Re] 3ět k mutacím a ke smrti buněk podobně jigmentací jsou lépe chráněni před škodlivými účinky Existuje řada envir. faktorů a genů, které předurčují nebo chrání jedince před vznikem nádi Existuje řada chemikálií buď exogenních (dieta, životní styl, léčiva, polutanty) nebo endogenních apopiozy. Jedinci, kteří jsou normálně exponováni a akumulují iniciované buňky (což se normálně děje s přibývajícím věkem), ale kteří jsou exponováni abnormálnímu množství promočních látek v těle v důsledku genetického defektu jsou označování jako "promotion-prone". ' může u normálních jedinců snížit vznik nádorů přesto, že dojde k iniciaci. Naopak pravidelná a chronická expozice dostatečnému množství nádorovéh promotoru zvyšuje riziko vzniku nádoru. Podobně jako existují antiiniciátorové geny a látky, ta*v existují i geny a látky působící antipromočně. NÁDOROVÁ GENETIKA Zárodečná b. (Z) and somatická b. (S) Bloom S. Fanconi S. RB1 TP53 WT1 NF1 BLt(8; 14) ALLt(11; ) CML t(9; 22) ESt(11;22) ARMSt(2; 13) Geny predisponující jedince k nádorům mohou být mutovaný v zárodečné linii a produkovat recesivně děděné onemocnění jako je Bloomův a Fanconiho syndrom, AT a xeroderma pigmentosum. Ostatní, jako RB1, TP53, NF1 a Wilmsův tumor 1 (WT1), mohou být mutovaný v zárodečné linii, čímž vzniká náchylnost u heterozygotů nebo somaticky v případě nedědičných případů nádorů. Mnoho somatických translokací je spojeno se specifickými chorobami, jako je Burkittuv lymphom (BL), akutní lymfocytární leukémie (ALL), chronická myeloidní leukémie (CML), Ewingův sarkom (ES) a alveolárni rhabdomyosarkom (ARMS). t(11; ) translokace může zahrnovat kterýkoli z velkého počtu chromozómů partnerských k chromozómu 11. ^jednotlivé buňce mutace jbostupně a společně podporují odchylku od regulovaného růstu a tastavují nebo revertují specializaci buňky. Změny buněčné topografie a uchycení mění vlastnosti povrchu buňky a umožňuj její odpoutání od sousedních buněk. rozmenené nebo nefunkční receptory pak ovlivňujte transport přes membránu. Uvnitř buňky se mění metabolismus, jádro mění |var, dochází ke shlukování chromatin^ zlomům v 1 thromosomech a poruchám buněčného dělení. t^od vrstvou epitelu j iné i punky produkují kolagenázu| a jiné proteázy, které nanišn j í extracelulární tnatrix a usnědňují tak další azí - invazi. ľti | hfítrjAflLiřJJlW V |J iťii-urnr | /