Všeobecná charakteristika virů Virus je diskrétní částice živé hmoty. Obsahuje nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA), je schopný autoreprodukce a evoluce. Není schopný růst ani dělit se, nemá vlastní proteosyntetický a metabolický aparát, který by mu dodával stavební složky a energii pro autoreprodukci. Reprodukce virů je závislá na prokaryotických a eukaryotických buňkách. Virus je parazit. Velikost virů se pohybuje od 20 - 300 nm Poxvirus Animal _ "^~ cells Bactena + Viruses Proteins Atoms (1 cm) (1 mm) (1 pni) UP* KT' (1 nm) (1 A) Stavba virů: • nukleová kyselina (DNA nebo RNA) • kapsid (složený z kapsomér) • virusový obal (lipidová dvojvrstva s glykoproteiny) Virové kapsidy mohou být organizované do dvou forem s kubickou (ikosaedrální), nebo helikální symetrií Schéma životního cyklu virů 1. přichycení se na buněčnou membránu 2. proniknutí do buňky 3. uvolnění NK 4. transkripce NK - syntéza enzymů 5. replikace NK 6. syntéza obalových proteinů 7. kompletizace 8. uvolnění viru z buňky ATTACHMENT (maturation^ GENE EXPRESSION Onkogenní viry Jsou to viry, které jsou schopné vyvolávat neoplastické transformace nebo je pozitivně ovlivňují. Mechanizmus transformace buněk na nádorovou probíhá: 1. přímo - vnesením genu do buňky (onkogenu) 2. nepřímo - změněním exprese celulárních genů - změnou regulačních mechanizmů Patří sem viry z taxonomických skupin RNA i DNA virů : 1. RNA onkoviry Retroviry: - mají ve svém genomu onkogen: Savčí viry typu C Ptačí viry typu C (virus Rousova sarkomu) - nemají ve svém genomu onkogen: Savčí viry typu B Retroviry BLV, HTLV 2. DNA onkoviry - nemají ve svém genomu onkogen: Hepadnaviry: Virus hepatitídy B (HBV) Herpesviry: Lidský herpesvirus typ2 (HHV2 HSV2) Lidský herpesvirus typ4 (HHV-4, EBV) Lidský herpesvirus typ8 (HHV-8) Papovaviry: Polyomaviry - SV40 Papilomaviry - Lidský papilomavirus typ 16,18 Papovaviry: Adenoviry Poxvirv hledání důkazů virového původu nádorových onemocnění. V r. 1911 Rous podal důkaz virového původu sarkomu u kuřat. Nobelovu cenu dostal až v r. 1966 v 85 letech. B77 - virus slepičího sarkomu z onkol. ústavu v Bratislavě, Jan Svoboda - objevitel virogenie Inbrední kmeny myší - po mnohonásobně opakovaném příbuzenském křížení. Kmeny s různou náchylností k nádorům (studium adenokarcinomu mléčné žlázy a leukémie). Karcinom mléčné žlázy podmiňuje virus a estrogeny - postihuje zvláště samice. Leukémie postihuje samce i samice. Důkaz virového původu byl podán přenosem na novorozené myši. Tzv. onkoviry byly nalezeny u myší, drůbeže, opic (SV40). U člověka viry způsobují benigní nádory (papilomy) i maligní onemocnění (virus hepatitídy B, Papilloma virus -děložní čípek, virus Burkittova lymfomu). Onkoviry s RNA - retroviry - obsahují onkogen, který může transformovat buňku. Reverzní transkriptáza přepisuje RNA do DNA a umožňuje včlenění retrovirových sekvencí do chromosomální DNA v buňce. Virus Rousova sarkomu -- onkogen v-src_-kóduje protein s tyrozinkinázovou aktivitou. V buňkách kuřat a savců podobný gen c-src, tzn., že virové onkogeny mají své ekvivalenty v normálních buňkách - změny těchto strukturálních nebo regulačních genů mají za následek transformaci buňky. Metodv transfekce DNA nebo klonovanvch senu z virů či nádorů - sledování transformace normálních buněk (NIH 3T3 myší fibroblasty). Po virové transformaci vytvářejí buňky na pozadí normálních buněk pozměněné fokusy Fokální metoda je základní metodou nádorové virológie. Koncepty nádorové biologie podpořené virovou karcinogenezí ► Buněčný původ virových onkogenů -onkogeny nesené transformujícími retroviry jsou odvozeny od buněčných genů ► Genetický základ nádorů -onkogeny zahrnuté ve vývoj i nádorů jsou aberantní verze normálních buněčných genů růstové kontroly ► Mnohastupňový proces karcinogeneze -je třeba mnohonásobných genetických změn pro vývoj nádoru ► Pozitivní a negativní regulační geny - v nádorech jsou změněny jak protoonkogeny tak nádorově supresorové geny ► Jednotné molekulání základy nádorů - různé třídy karcinogénu ovlivňují stejné regulační sítě kontroly buněčného růstu Table II. Retroviruses containing cellular oncogenesa General class Oncogene Virus Protein product Name Abbreviation Origin Non-receptor protein tyrosine kinase abl Abelson murine leukemia virus Ab-MLV Mouse Tyrosine kinase 1 fes ST feline sarcoma virus ST-FeSV Cat Tyrosine kinase fps Fujinami sarcoma virus FuSV Chicken Tyrosine kinase src Rous sarcoma virus RSV Chicken Tyrosine kinase i Receptor protein tyrosine kinase erbB Avian erythroblastosis virus AEV-ES4 Chicken Epidermal growth factor receptor fms McDonough feline sarcoma virus SM-FeSV Cat Colony-stimulating factor receptor kit Hardy-Zuckerman-4 feline sarcoma virus HZ4-FeSV Cat Stem cell factor receptor Serine/threonine protein kinase mil Avian myelocytoma virus MH2 Chicken Serine/threonine kinase mos Moloney murine sarcoma virus Mo-MSV Mouse Serine/threonine kinase raf Murine sarcoma virus 3611 MSV3611 Mouse Serine/threonine kinase Growth factor sis Simian sarcoma virus SSV Monkey Platelet-derived growth factor G protein H-ras Harvey murine sarcoma virus Ha-MSV Rat GDP/GTP binding K-ras Kirsten murine sarcoma virus Ki-MSV Rat GDP/GTP binding Transcription factor erbA Avian erythroblastosis virus AEV-ES4 Chicken Transcription factor (thyroid hormone receptor) ets Avian myeloblastosis virus E26 AMV-E26 Chicken Transcription factor fas FBJ osteosarcoma virus FBJ-MSV Mouse Transcription factor (AP1 component) jun Avian sarcoma virus-17 ASV-17 Chicken Transcription factor (AP 1 component) myb Avian myeloblastosis virus AMV Chicken Transcription factor myc MC29 myelocytoma virus MC29 Chicken Transcription factor rel Reticuloendotheliosis virus REV-T Turkey Transcription factor (NF-kB family) Adapter protein crk CT10 avian sarcoma virus CT-10 Chicken aAdapted from Rosenberg and Jolicoeur (15). This list is representative, not exhaustive. Table III. Cellular oncogenes activated by insertion of retroviruses lacking oncogenesa Oncogene Virus Protein product General class Name Abbreviation Origin Non-receptor protein tyrosine kinase Lck Moloney murine leukemia virus Mo-MLV Mouse Tyrosine kinase Receptor protein tyrosine kinase c-erbB Rous-associated virus 1 RAV-1 Chicken Epidermal growth factor receptor c-fins Friend murine leukemia virus Fr-MLV Mouse Colony stimulating factor receptor Serine/threonine protein kinase Pi ml Moloney murine leukemia virus Mo-MLV Mouse Serine/threonine kinase Growth factor Fgß/Int2 Mouse mammary tumor virus MMTV Mouse Fibroblast growth factor Wntl/Intl Mouse mammary tumor virus MMTV Mouse Secreted glycoprotein Wnt3/Int4 Mouse mammary tumor virus MMTV Mouse Secreted glycoprotein G protein c-Ki-ras Friend murine leukemia virus Fr-MLV Mouse GDP/GTP binding Transcription factor Etsl Moloney murine leukemia virus Mo-MLV Rat Transcription factor c-fos Rous-associated virus 1 RAV-1 Chicken Transcription factor (API component) c-myb Rous-associated virus 1 RAV-1 Chicken Transcription factor c-myb Moloney murine leukemia virus Mo-MLV Mouse Transcription factor c-myc Rous-associated virus 1 RAV-1 Chicken Transcription factor c-myc Moloney murine leukemia virus Mo-MLV Mouse Transcription factor Cyclin Fis1'/Cyclin Dl Friend murine leukemia virus Fr-MLV Mouse G j cyclin Vin 1/Cyclin D2 Moloney murine leukemia virus Mo-MLV Mouse G j cyclin aAdapted from Rosenberg and Jolicoeur (15). This list is representative, not exhaustive. Naŕilrinirormlng VfFfclf I psnp-fodue»f call fiir» r»CDmSirt*l ön rmHll n :s;:Lií Ol I (Pif ^ncĎJíílí In (hfl [ vlrfl Jiňům* Ti|ľ-if.ľoíT,»d. vi'js p':tLtn; HM půdufří ís'l Clockwise from the top right: infection of a cell with a retrovirus that contains only viral genes can occasionally initiate tumor formation by insertion of the provirus next to a proto-oncogene. Recombination during subsequent infection can lead to the incorporation into the viral genome of the cell-derived oncogene. Cells infected with virus with only the oncogene-containing genome become transformed non-producer cells from which transforming virus can be rescued by superinfection with a replication-competent, non-transforming helper virus. Reproduced, with permission, from Vogt. Vlľy.j kí&ľ'š lľzub ^dii/M £> níiiUjrovym Diibmu^némm ľiäl Čeľaď vírusov Vírus Ľudský nádor Papovaviridae ľudský papilomavírus (HPV) genitálne nádory nádory viacvrstvového dlaždicového epitelu Herpesviridae Epsteina-Barrovej vírus (EBV) vírus herpes simplex typ 2 (HSV2) nazofaryngálne karcinomy Burkittov lymfóm lymfóm B-buniek cervikálnykarcinóm? Hepadnaviridae vírus hepatitídy B (HB V) hepatocelulárny karcinom Retroviridae ľudský lymfotrofný vírus T-buniek (HTLV) leukémia T-buniek dospelých (Melnick, Adelberg, 1995) VÍWÍllb ílíllímb Viľíí V Üllhü^bllb'Zi N Hill Funkcia Vírusy EBV HBV HPV HTLV HSV HIV Stimulácia proliferacie buniek onkogénom + + ? + + - - Inzercia promótora _9 • + ? _9 • _9 • - - Efekt mutácie DNA hostiteľskej bunky _9 • 9 • + ? _9 • + - Nešpecifická idukcia proliferácie bunky - + - - + - Imuno-supresia - - - _9 • - + (zur Hausen, 1991) ixí^j7;_níi_rnéjái üüküprüismy _DixíA uiikog^nm^h vir h Vírus Onkoproteín Lokalizácia v bunke SV40 veľký Tag malý Tag jadro, plazmatická membrána jadro, cytoplazma Polyomavirus veľký Tag stredný Tag malý TAg jadro, cytoplazma, plazmatická membrána plazmatická membrána jadro, cytoplazma HPV 16 E6 E7 jadro, cytoplazma jadro, cytoplazma Adenovírusy skupina EIA skupina E1B jadro, cytoplazma, plazmatická membrána jadro, cytoplazma EBV EBNA-2 (EB virus nuclear antigen) LPM (latent membrane protein) jadro plazmatická membrána (Žemla a kol., 1995) lixtbnikzb Ľibzi üiiküprüiblny TJľLA virh a bunečnými ^upľ^uľuvýnii prolbíny Vírus Vírusový onkoprotein Bunkový supresorový protein Rb p53 SV40 HPV Adenovirus veľký TAg E6,E7 ElA, ElB veľkýTAg E7 ElA veľkýTAg E6 AlB nucleocapstd tegument genorae men bra rw glycoprotein complex I gtycoproteifi complex III Ccpyrighrt 1994 - '97 Mar4«9 Resthke génom - lineární dsDNA - 230kbp rozdělený je na dvě unikátní domény UL a Us ohraničené dvěma různými obrácenými repeticemi vytváří 4 izoméry genomu, které mají stejné biologické vlastnosti [HUMAN CMV GENOMIC SEQUENCE Pac &3' nucleotide overhang______________________ q an b UL L component b' a'm US c an a P(prototype) S component Genomic Isomers 2 ' IS (Inverted S) IL (Inverted L) ILS (Iverted L&S) Morfogeneze viru • přichycení viru na buňku na specifické receptory plazmatické membrány • fúze viru do buňky - obal splyne s cytopl. membránou, nukleokapsid se uvolní a proniká až do jádra buňky • obnažená virová DNA v cirkulární formě spouští v jádře expresi genomu (transkripci, translaci a replikaci) • transkripci katalyzuje buněčná mRNA-polymerázall • transkripce a replikace probíhá v jádře • mRNA je transportovana do cytoplazmy a tam jsou syntetizované příslušné proteiny • některé proteiny jsou opět transportovane do jádra, kde se zúčastňují na regulaci transkripce a replikace genomu a na maturaci nukleokapsid u • obsahuje tři typy genů a jim odpovídající proteiny a-geny velmi ranné, ß-geny ranné, y- geny pozdní • nukleokapsid při přechodu z jádra do cytoplazmy přes membránu získá tegument a obal Patogeneze • rozmnožuje se v různých druzích epitelových buněk • buňky jsou typicky zvětšené (cytomegalic) • obsahují typické inklúzie • šíří se blízkým kontaktem, slinami, močí, sekrety pohlavních orgánů, slzami, krví • přenáší se z matky na plod nebo na novorozence • vyvolává cytomegalickou chorobu u novorozenců, může vyvolat mentální retardaci, nebo smrt novorozence nebo plodu • způsobuje chronické poškození jater, sleziny, mozku, oka, lymfocytózu, je velmi nebezpečný pro lidi s imunosupresí • kromě produktivní infekce často přechází do latentní formy infekce Mechanismus transformace buňky Transformaci buňky může navodit: kompletní virus genomová DNA specifický fragment genomu jen transformační gen (geny) • HCMV zvyšuje hladinu některých regulátorů buněčného cyklu • proteiny HCMV IE72 a IE86 se váží na nukleotidové sekvence promotora cyklinuE, a aktivují jeho expresi vyvolávají mutace v buněčných genech p53 v genomech HCMV byli identifikované tři oblasti mtrl, mtrll a mtrlll (morfologicky transformující oblasti) z nich fragment mtrll - je považovaný za onkogenní pro buňky génom - cirkulární dsDNA - 8 kbp oblast LCR - reguluje zahájení exprese genů po infekci, je důležitá pro vznik latence oblast LI a L2 - kóduje pozdní strukturální proteiny (kapsid) oblast El až E7 - kóduje časné nestrukturální regulační proteiny, regulačné při produktivní infekci se transkribuj í L i E geny při neproduktívni infekci se transkribuj í pouze E geny i Patogeneze •Papilomaviry jsou druhově, ale i tkáňově velmi specifické viry • (HPV napadá jen buňky epitelu - keratinocyty) množí se v kůži, nebo sliznicích genitálií, ústní dutiny a na spojivce • HPV se přenáší přímým stykem bez porušení kůže nebo sexuálním stykem • vakcína proti HPV nebyla vyvinuta onemocnění, které způsobují HPV: různé benigní nebo maligní hyperplazie kůže a slizníc chodidlové bradavice obyčejné bradavice ploché bradavice laryngeální papilomy genitální papilomy a kondylomy nádorová onemocnění viral proteins required for controlled replication of the virus host chromosome /% ACCIDENTAL INTEGRATION OF VIRAL DNA FRAGMENT INTO HOST CHROMOSOME chromosome of papillomavirus unbalanced production of viral replication proteins integrated gene encoding viral replication protein BENIGN GROWTH OR WART MALIGNANT TUMOR Figure 23-34. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Průběh infekce HPV v epitelu krčku dělohy • virus penetruje přes poškozené místo na kůži, nebo sliznici a infikuje bazálni vrstvu buněk. Tam probíhá latentní infekce, nemnozí se, vznikají transformační proteiny (indukují tvorbu papilomů) • infekční virus se množí jen v nej povrchovej sich vrstvách epitelu 3 Normal cervix Inledion bv HPV Shedding od virus Baeemenl membrane Formation o1 in1eclio.ua virus • Scuaľcusepŕl-elial cells^ C DiHeremiolion ■ü rcvererr o1 cells Efisol epMheliül cells Translorrnalion zone o1 cervix Columnar epMheliurn Squamous epMhelium O Malignanl Iranslar molia n öl cervix Disordered cellular archheclure HPV-1ro reformed epilhelial cells Suprobosal rnholidiguree Invasion ' CIN3 Invasive CoCx + ft G> LI. L2 expression Episomol viral repliaalion: E1. EĚ. Dfl-7 expression f Integration o1 HPVinla nasi chromosomes Expression o1 ES, E7 (pS5. Rb binding) HumEin papillornciviiuů infection £ replication in ceivicaJ epithelial cells Expert Reviews in Molecular Medicine Mechanizmy karcinogeneze HPV genom HPV integruje do různých míst hostitelského chromozomu tato integrace vede k poruše exprese virového genu kódujícího protein E2 protein E2 působí jako represor transkripce genů pro E6 a E7 proteiny E6 a E7 proteiny jsou považované za onkoproteiny E6 se váže na protein p53 a inhibuje jeho aktivitu p53 nezastaví buněčný cyklus, buňka se může neomezeně dělit E7 se váže na nefosforylovaný protein Rb, a tím blokuje jeho vazbu na transkripční faktor E2F. Ten může aktivovat transkripci genů, jejichž produkty jsou nutné pro vstup buňky do Gt fáze RiiküvniüVb üiibiiiü^iieiil züh&üb&iib uiíbkťi TIPY Nádor Typ HPV Podporný faktor Rakovina kože HPV-5, 8 UV, genetická predispozícia Genitálny trakt HPV-16,18,31,32 99 • • Respiračný trakt HPV-6,11 X-žiarenie