Bi8202c Základy proteomiky - cvičení (jaro 2007)
ČASOVÝ ROZVRH:
PONDĚLÍ 7:50- 7:55 Zahájení praktika (UKB, A2, 2.NP, místnost č. 211, Dr. Hejátko)
8:00 ­ 9:00 2-D elektroforéza ­ rehydratace proužků
9:00 ­ 9:30 Exprese rekombinantních proteinů ­ zaočkování expresní kultury
9:30 ­ 10:00 Úvod do experimentální části (přednáška)
9:30-9:40 2D elektroforéza (Dr. Konečná)
9:40-9:50 MS analýza (Dr. Zdráhal)
9:50-10:00 Rekombinantní proteiny (Mgr. Fohlerová)
10:00 ­ 10.50 Příprava 1-DE gelů (pro SDS-PAGE i nativní PAGE)
10.50 -11.20 Příprava gelů pro 2-DE
11:20 ­ 12:30 OBĚD
12:30 ­ 13:30 Exprese rekombinantních proteinů ­ indukce
PAGE analýza ­ příprava gelů (SDS-PAGE, nativní PAGE)
13:30 ­ 14:00 In-solution proteolytické štěpení směsi proteinů pro LC-MSMS
analýzu
14:00 ­ 16:00 Struktura proteinů, proteomické databáze
16:00 ­ 16:45 Exprese rekombinantních proteinů ­ sklizeň kultury
Příprava noční kultury pro izolaci plazmidové DNA
16.45 ­ 18:00 1. rozměr 2-D elektroforézy: izoelektrická fokuzace (IEF)
ÚTERÝ 7:45 ­ 9:15 Izolace plazmidové DNA
9:15­ 10:00 Sekvenování ­ PCR
10:00 ­ 11.00 2. rozměr 2-D elektroforézy: SDS-PAGE
11,00 ­ 12.00 OBĚD
12.00 ­ 14.00 Barvení 2-DE gelů, densitometrie
14.00 ­ 17.00 Software pro vyhodnocování 2-D gelů, databáze 2-D gelů
Sekvenace DNA ­čištění vzorku (prostřídání skupin), nasazení vzorku
17.00 ­ 17.30 Ukončení in-solution proteolytického štěpení proteinů pro LC-
-MS/MS analýzu
Nasazení vzorků do autosampleru a začátek LC-MS/MS analýzy
STŘEDA 7:30 ­ 8:30 In-gel proteolytické štěpení proteinů separovaných 2-D
elektroforézou
8:30-13:00 Purifikace rekombinantních proteinů pomocí metalochelatační
afinitní chromatografie
Demonstrační chromatografie ­ FPLC
PAGE analýza rekombinantních proteinů ­ příprava vzorků
- SDS-PAGE analýza
Stanovení koncentrace proteinů metodou dle Bradfordové
13:00 ­ 14:00 OBĚD
14:00 ­ 15:00 Sekvenování DNA ­ vyhodnocení výsledků
ČTVRTEK 8:00 ­ 9:00 Nativní PAGE analýza
9:00 ­ 11:00 Analýza proteomu ­ identifikace proteinů metodou MALDI-TOF
MS (ukončení in-gel proteolytického štěpení proteinů separovaných
2-D elektroforézou a analýza vzorků MALDI-TOF hmotnostní
spektrometrií)
11:00 ­ 13:00 Ukončení nativní PAGE ­ aktivitní barvení (MUG)
- Western blotting
13:00 ­ 14:00 OBĚD
14:00 ­ 16:30 Western blotting
Analýza obrazu ­ densitometrie. software pro vyhodnocování 1D gelů
Dle dohody (vyhodnocení čistoty purifikovaných proteinů)
Vyhodnocení sekvenování DNA, čtecí rámec (Work Bench)
PÁTEK 8:00 ­ 10:00 Vyhodnocení výsledků LC-MSMS a MALDI-TOF MS analýz
10:00 ­ 12:00 "dodělávky", konzultace, vypracování a odevzdání protokolů
12:00 ­ 13:00 OBĚD
13:00 ­ 17:00 vypracování a odevzdání protokolů
Cvičící (legenda):
2-DE a příprava pro MS Dr. Konečná
Danuše Fridrichová
Analýza obrazu Mgr. Urbánková
MS analýza Dr. Zdráhal
Struktura proteinů Dr. Janda (Dr. Marek)
Exprese a purifikace rekombinantních proteinů Mgr. Fohlerová
Martina Válková
Izolace a purifikace DNA, práce s WorkBench Dr. Nejedlá
Sekvenování DNA Mgr. Paděrová