1. úloha. Izolace restrikčních endonukleáz z bakteriálních buněk
Reštrikční endonukleázy (RE) jsou součástí reštrikčné modifikačních systémů řady bakteriálních druhů. Jednou z jejich funkcí je degradace cizorodé DNA. Izolace RE z bakteriálních buněk je poměrně jednoduchá a obecněji lze rozdělit do následujících kroků:
1. Kultivace bakteriálních buněk. Baktérie se pomnoží v tekutém živném mediu do exponenciální až pozdně exponenciální fáze růstu (růstové podmínky - tj. složení živného media a teplota - se zvolí podle konkrétního organismu).
2.   Shromáždění buněk. Buňky se zcentrifugují při nízkých otáčkách a promyjí vhodným pufrem.
3.  Lyza buněk. Buňky se zlyzují pomocí enzymů (někdy jen částečně nalyzují) a rozbijí. K lyži buněk se nepoužívají detergenty (denaturace proteinů). K rozbití buněk se používá několika způsobů, z nichž nejčastější jsou:
- osmotický šok
- drcení buněk (balotina, skleněný prášek, oxid hlinitý aj.)
- sonikace (představuje univerzální a nejpoužívanější způsob rozbití buněk)
4.  Přečištění lyzátu. Lyzát se zbaví zbytků buněčných stěn a ribozómů centrifugací při vysokých otáčkách.
5.  Odstranění nukleových kyselin (před odstraněním jsou NK substrátem řady nespecificky působících nukleáz a vedou ke zvýšení relativního podílu RE). NK se odstraňují vysražováním se streptomycinsulfátem nebo polyetyléniminem. Vzniklý precipitát se odstraní centrifugací. Zbytky streptomycinsulfátu a nízkomolekulární látky se odstraní dialýzou, případně promytím lyzátu na chromatografické koloně (např. heparin-agaróze). Takto lze RE rovněž zakoncentrovat.
7. Uchovávání extraktů. RE lze skladovat buď bez purifikace a zakoncentrování při 4°C (jako tzv. hrubý lyzát), nebo po pročištění a zakoncentrování ve vhodném pufru s 50% glycerolem při -20°C.
Poznámky k izolaci:
1. Během izolace nesmí teplota překročit 10°C (inaktivace RE!)
2.  Sonikační roztok obsahuje merkaptoetanol, který je zdraví škodlivý!
3. Je vhodné k práci použít sterilní materiál; kontaminace mikroorganismy může vést k degradaci RE.
4. Při práci s ultrazvukem je třeba dodržovat bezpečnostní předpisy.
Izolace restrikčních endonukleáz Sau3Al a Sau96 z buněk S. aureus
Organismy: Bakteriální kmen Staphylococcus aureus PS 3A a S. aureus PS96.
Fág 3A, 96, lambda (nebo jejich DNA).
Materiál: Živný bujon (500 ml), promývací pufr (0,05 M TRIS.Cl, 0,015 M Na3citrát, pH
7,4), lyzostafin (200 U/ml), sonikační pufr (0,01 M TRIS.Cl, 0,01 M 2-merkaptoetanol),
streptomycinsulfát (10% zás. roztok v sonikačním pufru), dialyzační hadice, agaróza, TAE
elektr of or etický pufr, nanášecí barvivo pro elektroforézu.
Přístroje: termostat, centrifuga T23, ultracentrifuga UP65, ultrazvukový sonikátor, zařízení
pro elektroforézu, transiluminátor.
Postup
1.  500 ml bujónu naočkujeme 25 ml 18h/37 °C bujónové kultury příslušného bakteriálního kmene a necháme inkubovat přes noc při 37 °C.
2. Buňky zcentrifugujeme v centrifuze T23 při 6000 ot/min při 4°C, 10 min. Sediment buněk zvážíme (očekávaná hmotnost 2-3 g, minimální požadovaná hmotnost 1,5 g).
3.  Sediment promyjeme promývacím pufirem (lx) a zcentrigujeme jako v bodě 2) a resuspendujeme v 10 ml promývacího roztoku.
4. Přidáme roztok lyzostafinu do výsledné koncentrace 5U/ml a inkubujeme 15 min při 37 °C za občasného promíchání. Nesmí dojít k úplné lyži - kontrolujeme vizuálně.
5. Buňky zcentrifugujeme 10 min při 5000 ot/min a 4 °C a sediment resuspendujeme v 10 ml sonikačního pufru.
6. Buněčnou suspenzi vychladíme v ledové vodní lázni (5 min) a buňky rozbijeme ultrazvukem (10x 30-sekundových intervalů - průběžně chladíme tak, aby teplota nepřekročila 10 °C !)
7. Buněčné zbytky a ribozómy odstraníme centrifugací 1 hod při 35 000 ot/min , 4 °C v centrifuze UP65 (rotor 8x11 ml).
8. K supernatantu přidáme roztok streptomycinsulfátu do výsledné koncentrace 1% a ponecháme 1 hod při 4 °C. Sraženinu zcentrifugujeme 10 min při 30 000 ot/min, 4 °C na centrifuze UP65 (rotor 8x11 ml).
9.  Supernatant přeneseme do připravené dialyzační hadice (vařit 10 min. v roztoku uhličitanu sodného a potom 2x v destilované vodě) a dialyzujeme proti sonikačnímu pufru přes noc (4°C, 3x 500 ml pufru).
10. Jemný precipitát odstraníme centrifugací (5000ot/10 min, 4°C) a supernatant přeneseme do sterilní zkumavky a rozdělíme do několika alikvotních částí. Takto připravený hrubý extrakt uchováváme při 4°C (zůstává aktivní po dobu nejméně 1 roku).
11.  Stanovíme aktivitu restrikčních enzymů přítomných v hrubém extraktu.
Stanovení aktivity restrikčních endonukleáz Sau3Al a Sau96
Reštrikční endonukleázy Sau3A a Sau96l štěpí DNA fága lambda a rovněž DNA stafylokokových bakteriofágů, které byly propagovány na kmenech S. aureus nesoucích reštrikčné modifikačními (RM) systémy odlišné od RM systémů přítomných v kmenech PS3 A a PS96. Této skutečnosti lze využít k důkazu endonukleolytické aktivity enzymů přítomných v hrubých extraktech připravených v úloze č. 1.
Materiál: Hrubé extrakty připravené v úloze č. 1, DNA fága lambda (1 mg/ml), DNA stafylokokových fágů 3A, 96 a 71 (konc. 200-500 |og/ml), 50x konc. TAE elektr of or etický pufr, agaróza, štěpící pufr 10x koncentr., 6x konc. nanášecí barvivo,
Přístroje a zařízení: mikrocentrifuga, termostat, Eppendorfovy zkumavky, automatické pipety a špičky, zařízení pro elektr of or ézu, transiluminátor, fotoaparát.
Postup
1. Do Eppendorfovy zkumavky napipetujeme: -10 [0.1 sterilní deštil, vody
- 5 [0.1 roztoku DNA fága (lambda, případně některého ze stafylokokových fágů) (asi 1 |og)
- 3 [0.1 hrubého extraktu izolovaných RE
- 2 jol 10x konc. štěpícího pufru (aktivitu ověřujeme v pufrech A, M a MULTI-CORE) Současně založíme reakční směs, v níž je hrubý extrakt nahrazen deštil, vodou
2.  Směs dobře promícháme pipetou a zcentrifugujeme 1 min.
3. Inkubujeme 2 hod při 37 °C.
4. Zahřejeme 5 min při 56 °C a necháme pomalu ochladit na pokojovou teplotu
5. Přidáme 3 ml nanášecího barviva a dobře promícháme pipetou
6. 20 ml roztoku naneseme na 0,7 % agarozový gel a provedeme elektrofor etické rozdělení (3-4 hod při 40 m A)
7.  Gel přeneseme do barvící lázně (TAE pufr obsahující 1 mg etidiumbromidu/ml) a necháme barvit 0,5 hod.
8.  Gel opláchneme deštil, vodou (5 min) a pozorujeme pod UV světlem. Pořídíme fotografický záznam.
Poznámky:
1. Etidiumbromid je mutagen - pracujeme v rukavicích a na vyhrazeném místě.
2. Při práci s UV světlem chráníme oči a pokožku
3. úloha. Úprava konců DNA prostřednictvím PCR a klonování ve
vektorech řady pBluescript
Příprava kompetentních buněk pro transformaci
Jako recipientních kmenů pro klonování cizorodé DNA se nej častěji využívá kmenů E. coli, které byly mutacemi a metodami genového inženýrství upraveny tak, aby byly schopny s vysokou účinností přijímat externí DNA (většinou plazmidovou), umožňovaly její replikaci a udržovaly její původní strukturu (tj. nezpůsobovaly vystepování nakloňované DNA) a dovolovaly selekci rekombinantních plazmidů. Podrobná charakteristika těchto kmenů (zejména jejich genotyp) bývá uváděna v katalozích firem a praktických příručkách.
Vlastní navození kompetence spočívá v pomnožení buněk příslušného kmene E. coli v tekutém živném mediu (např. LB bujónu) do exponenciální fáze růstu, převedení buněk do roztoku CaCl2, v němž se buňky ponechají několik hodin, během nichž dojde k jejich vyhladovění a určitým změnám v buněčné stěně, umožňujícím přijmout externí DNA. Takto připravené buňky lze použít buď bezprostředně, nebo se převedou do roztoku CaCl2 s přídavkem glycerolu, v němž je možné buňky zamrazit na -70°C a použít později (takto připravené buňky lze uchovávat několik měsíců nebo i déle).
Organismy: Bakteriální kmen E. coli DH5a
Materiál: LB bujón, sterilní roztok 0,05 M CaCl2, sterilní centrifugační zkumavky, kolorimetr s příslušenstvím, chlazená centrifuga T23
Postup
1. 20 ml LB bujónu v Erlenmayerově baňce naočkujeme 2 ml bujónové kultury (18 hod/37°C) a inkubujeme při 37°C na vodní třepací lázni do hustoty suspenze OD6oo = 0,3.
2. Buněčnou kulturu vytemperujeme na 0°C v ledové vodní lázni a centrifugujeme 10 min/3000 ot/min při 4°C. Od této chvíle nesmí teplota překročit 4°C!
3.  Sediment buněk resuspendujeme v polovině objemu ledového roztoku CaCl2 a ponecháme v lednici při 4°C přes noc.
4.  Buňky zcentrifugujeme jako v bodě 2) a sediment resuspendujeme ve 2 ml (obecně v 1/10 výchozího objemu kultury) roztoku CaCl2.
5.  Takto připravené kompetentní buňky lze používat přibližně jeden týden. Pro dlouhodobé uchovávání se k buněčné suspenzi přidá 1/10 objemu sterilního glycerolu (4°C!) a suspenze se zmrazí na -70°C.
Příprava plazmidového vektoru pBluescript ke klonování
Jedním z běžně používaných vektorů pro klonování v E. coli]e bakteriální plazmidový vektor pBluescript. Jeho polylinker (obsahuje cílová místa pro 16 reštrikční ch endonukleáz) je umístěn v části genu lacZ kódující proximální část polypeptidu beta-galaktozidázy, což umožňuje použít k odlišení rekombinantních a nerekombinantních plazmidů alfa-komplementace. Gen pro rezistenci k ampicilinu je využíván pro selekci transformant.
Jako hostitelské kmeny pro tento plazmidový vektor jsou používány kmeny E. coli. Pro klonovací experimenty je nutné použít kmenů, které jsou schopny alfa-komplementace (tj. nesoucí mutaci lacZ M15), např. E. coli DH5a, JM83, JM101, NM522 aj.
K izolaci DNA vektoru je možné použít několika metod, poskytujících DNA o různém množství a čistotě. Optimální je připravit DNA purifikovanou přes kolonku (spin columns) s využitím některého komerčního kitu. Je možné však vycházet i z preparátů, připravených některou z mikrometod, při nichž se získá DNA v množství několika |Lig s dobrou citlivostí ke štěpení restrikčními endonukleázami a účinně spojovaná ligázou.
Naštěpení vektoru reštrikční endonukleázou
Materiál: Eppendorfovy zkumavky, mikrocentrifuga, automatické pipety, špičky, zařízení pro elektroforézu, transiluminátor, reštrikční endonukleázy, štěpící pufry, sterilní deštil, voda, TE pufr, 70% a 100% etanol, QiaQuick PCR purification kit, purifikovaná DNA vektoru pBluescript, reštrikční endonukleázy EcoKl a BamHL.
Nejdříve stanovíme orientačně koncentraci vektoru: 2 \xl roztoku DNA smícháme s 48 \xl TE pufru a stanovíme absorbanci při 260 nm. Z naměřené hodnoty odhadneme koncentraci DNA.
6 |Lig DNA vektoru pBluescript naštěpíme v objemu 40 \xl reakční směsi příslušnou dvojicí
RE (2 hod), abychom zabránili znovuspojení přečnívajících konců.
2 |Ltl reakční směsi naneseme na agarozový gel a zkontrolujeme, zda je naštěpení vektoru
úplné.
K reakční směsi přidáme 40 \xl TE pufru a provedeme purifikaci DNA (viz QIAquick PCR Purification Kit Protocol). Nakonec DNA rozpustíme v 30 \xl elučního pufru a uložíme při
-20°C.
Příprava cizorodé DNA pro klonování ve vektoru pBluescript
Jako cizorodou DNA lze pro klonování v pBluescriot vektorech použít DNA z jakéhokoliv organismu za předpokladu, že je tato DNA nativní a lze ji štěpit některou z restrikčních endonukleáz, jejíž štěpné místo se nachází v polylinkeru (velikost restrikčních fragmentů, které lze nakloňovat, je max. asi 10 kbp). DNA, která není žádnou z těchto RE štěpena, by bylo nutné nejdříve upravit tak, aby její konce byly s některou z RE kompatibilní - např. připojením spojek, adaptoru nebo modifikací konců prostřednictvím PCR. K nakloňování lze použít DNA, která byla štěpena buď jednou RE, nebo dvěma různými RE
- v tomto případě dojde k tzv. orientovaném začlenění restrikčního fragmentu do vektoru, což má řadu výhod, např. umožňuje reštrikční mapování a sekvencování z definovaného konce. Použití DNA štěpené dvěma enzymy zabraňuje její cirkularizaci a zvyšuje pravděpodobnost vzniku rekombinantních plazmidů při ligaci vektorové a cizorodé DNA.
Materiál: DNA vyizolovaná z bakterií Staphylococcus nepalensis; kmeny: CCM7045, CCM2433, CCM7317 aNRL04/522.
- reštrikční endonukleázy EcoRI aBamHI, štěpící pufry 10x konc, deštil, voda
- primer H279 nesoucí EcoRI-místo (5'-GAATTCGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC-3") a primer H280 nesoucí BamHl-místo (5'-CGCGGGATCCYKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT 3'),
o koncentraci 10 pmol/ul, 10x konc. roztok dNTP, Taq DNA-polymeráza a příslušný reakční pufr, 50 mM MgCl2,
- automatické pipety, špičky, eppendorfky, mikrofuga, spektrofotometr, termocykler
- zařízení pro elektroforézu a vyhodnocování gelů
Postup
1. Provedeme amplifikaci genu pro 60 kDA chaperonin Cpn60 s primery, jejichž konce nesou rozpoznávací sekvence pro reštrikční endonukleázy EcoRI a BamHL (viz protokol PCR).
2.  Provedeme purifikaci PCR-produktu (viz QIAquick PCR Purification Kit Protocol) a výsledný vzorek ověříme na agarózové gelové elektroforéze, současmě odhadneme koncentraci DNA.
3.   Provedeme štěpení purifikovaného amplikonu restrikčními endonukleázami EcoRI a BamHl:
V eppendorf zkumavce smícháme:
-  1-2 ug DNA (x ul roztoku DNA)
- 45 - x |il H20
- 5 ul lOx konc. štěpícího pufru
- 5 jednotek restriktáz (asi 1 ul)
Obsah zkumavky dobře promícháme a krátce zcentrifugujeme v mikrofuze. Inkubujeme 2 hod při teplotě doporučené pro příslušné restriktázy.
4. Zkumavku zahřejeme 5 minut na 56°C a necháme zchladit na pokojovou teplotu
5.  Opět provedeme purifikaci naštěpeného PCR-produktu (viz QIAquick PCR Purification Kit Protocol). Rozpustíme ve 30 ul elučního pufru.
6. Rozštěpenou DNA uložíme při -20°C.
Ligace vektorové a cizorodé DNA
Nejsnadněji se klonují DNA-restrikční fragmenty, získané štěpením DNA dvěma různými RE. Pokud se liguje DNA po štěpením jednou RE, je vhodné provést defosforylaci vektoru, která podstatně snižuje jeho recirkularizaci a zvyšuje výtěžek rekombinantních molekul. Pokud se defosforylace neprovede, je možné výtěžek rekombinantních molekul zvýšit nastavením optimálního poměru koncentrací vektorové a cizorodé DNA - tento poměr se mění v závislosti na velikosti vektoru a Honovaného restrikčního fragmentu. Výpočet pro přesné stanovení koncentrací obou DNA je uveden v řadě příruček. Prakticky lze vyjít z poměru koncentrací 1:1, 3:1 a 1:3, kde je značná pravděpodobnost, že některá z těchto směsí obsahuje poměr blížící se optimálnímu.
K ligaci se nejčastěji používá T4-DNA-ligáza (případně i DNA-ligáza z E. coli, která však nespojuje tupé konce). V reakční směsi o celkovém objemu se kombinuje obvykle 100-500 ng vektorové DNA se 100-500 ng cizorodé DNA. Ligační pufr je dodáván výrobci jako lOx koncentrovaný roztok (jeho složkou je TRIS, DTT, BSA, ATP a Mg++). Vlastní ligační reakce má teplotní optimum při 37°C - při této teplotě jsou však konce nestabilní (s tendencí k denaturaci), proto se ligace obvykle provádí při teplotách 16-25°C, kdy je soudržnost konců vyšší.
Výsledek ligační reakce je možné demostrovat elektrofor eticky: po ligaci se vytvoří kromě rekombinantních plazmidových molekul rovněž vysokomolekulárni frakce DNA, kterou lze na gelu dobře rozpoznat: je důkazem, že enzym je aktivní.
Materiál: DNA vektoru pBluescript štěpená RE , cizorodá DNA štěpená RE, T4-DNA-ligáza, lOx ligační pufr, mikrozkumavky, aut. pipety, špičky, termostat na 16°C, mikrofuga
Postup
1. Připravíme ligační směsi obsahující různé poměry vektorové a cizorodé DNA (1:1,3:1, 5:1, 1:3 a 1:5). Každá směs obsahuje v celkovém obejmu 20 ul :
-  100-500 ng vektorové DNA
-  100-500 ng cizorodé DNA
- deštil, sterilní vodu (ad 20 ul).
2.  Směs zahřejeme 5 minut na 45°C - dojde k rozvolnění kohézni ch konců. Zchladíme na 4°C.
3. Přidáme:
- 2 ul lOx ligačního pufru
-0,1 Weis sovy jednotky T4-DNA-ligázy
4. Po promíchání inkubujeme 4 hod (případně přes noc) při 16°C.
5.  Odebereme 2 ul a naneseme na 0,7% agrozový gel, na nějž naneseme paralelně 2 ul vektorové a 2 ul cizorodé DNA.
6. V případě, že došlo k ligaci, pozorujeme rozdíly v elektrof or etické mobilitě vzorků DNA.
Transformace kompetentních buněk E. coli rekombinantní DNA
Postup:
1. Do mikrozkumavky se napipetuje 200 ul kompetentních buněk. (V případě, že se používají buňky zmrazené na -70°C, nechají se pozvolna rozmrznout při pokojové teplotě.)
2. Zkumavka se umístí do ledové lázně.
3. Přidá se DNA (obvykle se 1, 3 a 5 ul ligační směsi smíchá s TE pufrem do celkového objemu 10 ul, který se pak přidá ke kompetentním buňkám).
4. Lehce se promíchá a ponechá v ledové lázni 30 minut.
5. Buňky se podrobí tepelnému šoku ponořením zkumavky na 1 min do vodné lázně 42°C, nebo3min/37°C.
6. Zkumavka se přenese do ledové lázně a přidá se 1 ml LB bujónu.
7. Následuje inkubace 1 hod při 37°C na vodní třepací lázni.
8. Buňky se zcentrifugují 5 min při 1500 ot/min (nebo 1 min při 6000 ot/min).
9.  Supernatant se sleje - většinou však zůstane ve zkumavce asi 100 ul supernatantu, ve kterém lze buňky resuspendovat.
10.  Suspenze se vyseje pomocí bakteriologické hokejky na agarové plotny (LB agar, obsahující 50-100 ug ampicilinu /ml). Pokud se použijí plotny obsahující navíc X-gal a IPTG, lze přímo odlišit podle zbarvení kolonie obsahující rekombinantní nebo nerekombinantní plazmid.
11. Plotny se inkubují 24-48 hod při 37°C. Poznámky:
1. Účinnost transformace kolísá v závislosti na použitém kmeni E. coli, na pracovním postupu při přípravě kompetentních buněk a na koncentraci DNA použité k transformaci. Platí, že nejvyšší účinnosti transformace se dosáhne při použití velmi nízkých koncentrací DNA, nepřesahujících 10 ng/jednu transformační směs (optimální konc. je pod 1 ng DNA).
2. Je vhodné sledovat nárůst kolonií na plotnách: někdy se stává, že v okolí transformantu se postupně objevuj í dorůstají) drobné kolonie, které nejsou transformanty a nejsou tudíž rezistentní k ampicilinu: rostou v okolí rezistentních kolonií, které ampicilin rozkládají.
3. Vyrostlé kolonie je vhodné přepasážovat na čisté plotny a založit klony z jednotlivých nově vyrostlých kolonií. Přítomnost rekombinantního plazmidu se ověří izolací metodou lyže
varem.
Izolace DNA rekombinantních vektorů pBluescript (potenciálních klonů) metodou lyže
varem (Holmes a Quigley, 1981).
Organismus: E. coli (rekombinantní pBluescript) - nárůst kultury na Petriho misce (LB agar + 100ugAMP/ml)
Materiál: Eppendorfovy zkumavky, mikrocentrifuga, automatické pipety, špičky, zařízení pro elektroforézu, transiluminátor, reštrikční endonukleázy, štěpící pufry, sterilní deštil, voda, TE pufr, 70% a 100% etanol.
STET Pufr (0,1 M NaCl, 10 mM TRIS.C1 (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8,0), 5% Triton X-100); Lysozym: 10 mg/ml (ve vodě); 2,5 M Na-acetát (pH 5,2); Izopropanol
Postup:
1. Bílé kolonie preočkujeme na misky LBA s ampicilinem, IPTG a X-Gal ve formě dlouhých proužků.
2. Druhý den z nárůstu kultury na Petriho misce odebereme párátkem asi 1-2 mm3 a resuspendujeme v 350 ul STET pufru v epp. zkumavce. Odběr kultury párátkem provedeme tak, abychom neodebrali i část agaru.
3. Přidáme 25 ul roztoku lysozymu a dobře promícháme (protřepeme).
4. Zkumavku umístíme do lázně s vroucí vodou přesně na 1 minutu.
5. Zkumavku přeneseme do ledové vodní lázně.
6. Bakteriální lyzát zcentrifugujeme v mikrofuze 10 min. při max. ot. a pokojové teplotě.
7.  Sterilním párátkem odebereme viskózni sediment
8.   K supernatantu přidáme 40 ul 3M Na3-acetátu a 420 ul izopropanolu. Promícháme několikerým obrácením zkumavky. Zkumavku ponecháme 5 min při pokojové teplotě.
9.   Obsah centrifugujeme 5 minut v mikrofuze při max. otáčkách a 4°C. Supernatant odebereme pasterkou -je nutno odstranit veškerou tekutinu.
10. Přidáme 1 ml 70% etanolu, protřepeme a zcentrifugujeme 1 min v mikrofuze. Supernatant odebereme, sediment opláchneme 100% etanolem (případně znovu zcentrifugujeme, jestliže se sediment uvolnil) a necháme oschnout v obrácené poloze při pokojové teplotě.
11.  Sediment rozpustíme v 50 ul TE pufru.
12. Výsledek izolace ověříme na elektroforéze.
Poznámky:
Uvedeným postupem lze připravit asi 5 ug DNA. Původní předpis vychází z tekuté výchozí kultury - pokud však použijeme plotny s kvalitním agarem, je čistota získané DNA dostatečná. Roztok DNA se uchovává při -20°C, nebo krátkodobě při 4°C.
2. úloha. Reštrikční mapování DNA
Mapování restrikčních fragmentů DNA lze s řadou výhod provádět po jejich nakloňování do vektorů, obsahujících polylinkery se štěpnými místy pro různé restriktázy. Restnkční místa polylinkeru pak vymezují konce restrikčního fragmentu a kombinovaným štěpením jednotlivými restriktázami lze poměrně snadno sestrojit restrikční mapu fragmentu. Jedním z vhodných vektorů je plazmid pUC18.
K vlastnímu mapování můžeme použít různé strategie, zvláště vhodnou je kombinované štěpení DNA několika různými RE
Materiál: Rekombinantní plazmid pUC18 nesoucí 5 kb (4992 bp) inzert cizorodé DNA (ve formě DNA), plazmid pUC18 (ve formě DNA), zařízení pro elektroforézu a vyhodnocování elektroforetických gelů, standardy molekulové hmotnosti (např. DNA fága lambda štěpená EcoRI/HindlII + HindlII), restrikční endonukleázy EcoRI, Pstl, PvuII, Ndel, SnaBI a Xhol štěpící pufry, mikrozkumavky, pipety, špičky, vodní lázeň, termostat
Postup:
1. Provedeme izolaci rekombinantního plazmidu pUC18 obsahujícího Eco RI inzert cizorodé DNA.
2.  Stanovíme velikost inzertu (nakloňovaného restrikčního fragmentu) štěpením rekombinantního plazmidu RE Eco RI, který(é) byl (y) použit(y) ke klonování
3. Rekombinantní plazmid štěpíme vybranými restriktázami: EcoRI, Pstl, PvuII, Ndel, SnaBI a Xhol
-jednotlivě
- současně EcoRI a další (případně třemi)
3.Stanovíme velikost vzniklých restrikčních subfragmentů
4. Hodnoty získané v bodě 1) a 3) uspořádáme do tabulky a logickou úvahou uspořádáme restrikční místa na restrikčním fragmentu, případně nakreslíme restrikční mapu.
Příklad:
do  restrikčního  místa EcoRI vektoru  pBR322  byl  nakloňován  restrikční  fragment.  K
mapování bylo použito Pstl, jejíž štěpné místo je vzdáleno od EcoRI místa 764 bp.
Postup: provedeme následující štěpení:
1  - pBR322/£coRI
2 - pBR322+inzert/£coRI
3  - pBR322+inzert/ftrI + EcoRI
Pufry pro štěpení 2 enzymy současně volíme podle přiložené tabulky. V případě nutnosti následného štěpení použijeme jako první pufir s nižším obsahem solí. Velikost DNA fragmentů se stanoví z elektroforetogramu na základě srovnání s mobilitou standardních DNA fragmentů. Z velikostí jednotlivých fragmentů se sestaví restrikční mapa.