Návody pro praktikum „Analýza struktury chromatinu“ Bi9042: Tatiana Vrtíková-Kubičárová, Eva Sýkorová a Jiří Fajkus 1. Izolace buněčných jader z rostlinných tkání Před začátkem práce je nutno si připravit: Pracovní roztoky - pufr 5xA, pufr 1xA, pufr B, pufr C (pro uchovávání nebo eventuelně jiný pufr, ve kterém budete pokračovat), Percoll, sterilní glycerol (pokud jádra zamražujeme) Laboratorní pomůcky - třecí miska s tloučkem, nádoba na dusík, odměrný válec, kádinka, nálevka, mlynářské hedvábí, centrifugační kyvety nebo Falconky, pipeta 1ml, modré špičky, centrifuga s rotorem odpovídajícím typu kyvet (dát vychladit na 4°C) Izolace a filtrace probíhá v komorové lednici 1. 10g rostlinné tkáně se důkladně rozetře v třecí misce v tekutém dusíku na prášek. Prášek se přesype do kádinky a zalije postupně 60 ml pufru A 2. Obsah se přefiltruje přes mlynářské hedvábí do čisté kádinky nebo přímo do centrifugační kyvety. Centrifugace probíhá v laboratoři, kyvety se ovšem celou dobu temperují na ledu, nutné mít předem vychlazenou centrifugu na 4°C 3. Kyvety se proti sobě vyváži (na předvážkách) a dají se odstřeďovat do předem vychlazené centrifugy na 4°C na 12min na 5000RPM 4. Supernatant se slije a sediment se opět rozsuspenduje v dalších 15ml pufru A/kyvetu a opět se nechá odstřeďovat na 5000RPM/12min/4°C 5. Postup z bodu 4. se opakuje dokud se sediment nezbaví tmavězelených částic (chloroplasty a jejich shluky), které se v supernatantu rozpoznají jako nerozpustné malé okem viditelné částice, obvykle 2x 6. Sediment se rozsuspenduje v 15ml v pufru B/kyvetu a centrifuguje na 7000RPM/10min/10°C 7. Pomocí dávkovací pipety (1 ml) s modrou seříznutou špičkou se odeberou jádra, která plavou na povrchu supernatantu do další čisté centrifugační kyvety. Je nutné dbát na to, aby se neodebraly případné zbytky chloroplastů, které se nepodařilo v předcházejících krocích úplně odstranit. V žádném případě neodebírat sediment ze dna zkumavky (obsahuje zejména škrobová zrna). 8. Odebraná jádra se nechají opět centrifugovat v pufru B na 7000RPM/10min/10°C. V tomto kroku se opatrně odebírá roztok pod jádry, až zůstanou na dně samotná jádra. 9. Jádra se mohou buď zamrazit na -70°C nebo se použijí přímo k další analýze. Pro skladování jader na -70°C se k jádrům přidá1,5 ml pufru C a jádra se rozsuspendují. Suspense jader se rozdělí na aliquoty po 400 µl, ke vzorkům se přidá po 400 µl sterilního glycerolu a promíchá. Pokud se jádra používají dále, převedeme je do příslušného pufru pro další postup. Pufr A se připravuje z pufru 5xA a přidáním merkaptoetanolu a PMSF. 5xA: 50mM NaCl 50mM MES (při naředení na 10mM má pH 6.0) 25mM EDTA 1250mM sacharóza 3% Triton 750µM spermidin Pufr A 10mM NaCL 10mM MES pH 6.0 5mM EDTA 250mM sacharóza 0,6% Triton X-100 150 µM spermidin 100µM PMSF 20mM merkaptoetanol Pufr B se připravuje z pufru A přidáním navážky Percollu. Pufr B 2,4 g pufru 5xA 18g Percoll Těsně před použitím se přidá: 14,2 µl merkaptoetanolu 40µl 0,1M PMSF Pufr C 10mM Tris-Cl pH 7,7 100mM síran amonný 10mM MgCl[2 ]5mM merkaptoetanol 2. Štěpení genomové DNA na nukleozomy mikrokokovou nukleázou Před začátkem práce připravit a zkontrolovat: Pracovní roztoky - nukleozómový pufr, STOP pufr, fenol ekvilibrovaný pufrem, směs fenol/chloroform/isoamylalkohol, chloroform/isoamylalkohol, MNasa, proteináza K, isopropanol, roztoky pro elektroforézu Laboratorní pomůcky - termostat na 37°C a 50°C, stolní centrifuga, agarosová elektroforéza 1. čerstvě připravená jádra rozsuspendujeme v nukleozomovém pufru a rozdělíme na stejné aliquoty (např. 400µl), pracujeme na ledu 2. do každého vzorku kromě vzorku 0 přidáme MNasu na konečnou koncentraci 150U/ml 3. vzorky inkubujeme při 37°C a v jednotlivých časových intervalech (5´, 10´, 20´, 40´) reakci zastavíme přídavkem 1 objemu lyzačního roztoku = STOP pufr, vzorek promícháme 4. ke vzorkům přidáme proteinázu K (na konc. 200ug/ml) a inkubujeme 1 hodinu při 50°C 5. ke vzorkům přidáme 1 objem fenolu ekvilibrovaného pufrem, promícháme dobře na vortexu až zmléční a centrifugujeme při pokojové teplotě 2 min/14000rpm ve stolní centrifuze 6. odebereme vodní frakci do nové eppendorfky (obvykle je to horní vrstva, ale někdy jsou fáze převrácené), ke vzorkům přidáme 1 objem směsi fenol/chloroform/IAA, promícháme na vortexu a centrifugujeme při pokojové teplotě 1 min/14000rpm ve stolní centrifuze pozn.: nesnažit se odebrat vodní fázi do úplného konce, aby nebyla znečištěna vysráženými proteiny, v žádném případě neodebírat druhou fázi 7. odebereme vodní frakci do nové eppendorfky, přidáme stejný objem směsi chloroform/isoamylalkohol, vortex, centrifugace při pokojové teplotě 1 min/14000rpm 8. odebereme vodní fázi do nové eppf, změříme si objem vzorku, přidáme 0,6 až 0,8 násobek objemu isopropanolu na srážení 9. vzorky promícháme převrácením a necháme ustát Pozn.: obě fáze se musí spojit, pokud po ustátí pozorujeme rozdělení dvou fází, je nutno upravit objem vodní nebo isopropanolové frakce, aby se dosáhlo správného poměru smísení, a to přidáním isopropanolu nebo vodního roztoku s přídavkem soli (např. 0,3M acetát sodný, pH 5,5) 10. po 15 min stání při pokojové teplotě centrifugujeme vzorky 15 min/14000rpm při 25°C. 11. odebereme supernatant pipetou a pelet omyjeme 180ul 80%EtOH, opatrně stáhneme ethanol a pelet necháme vyschnout na vzduchu pozn.: lze opatrně sušit i s použitím vývěvy a exikátoru nebo podobného systému, pozor na přesušení. 12. DNA rozpustíme v 20µl sterilní vody. Připravíme si jednotlivé vzorky pro nanesení - 4µl DNA, 1µl sterilní vody, 1µl 6xcc loading buffer (obsahuje bromfenolovou a xylencyanolovou modř) 13. Agarosová elektroforéza - nutno si připravit předem gel 2% agarosy v TAE pufru s etidiumbromidem (nebo 3% NuSieve agarosa v TBE pufru) a elektroforetickou vanu s TAE pufrem. Toto lze učinit v mezičase, např. čekání v bodě 4 a 11) 14. naneseme do jamek gelu po 6µl připravených vzorků, marker. Elektroforézu můžeme nechat probíhat přes noc do druhého dne při nízké voltáži (30-40V), ráno pak na transiluminátoru zkontrolujeme jak je DNA rozdělena a upravíme voltáž 15. dokumentace gelu na dokumentačním systému nebo foto s červeným filtrem na kinofilm z transiluminátoru Nukleozómový pufr: 50 mM Tris-Cl pH 8,0 STOP pufr: 125 mM sacharosa 1% sarcosyl 5 mM MgCl[2 0,5 M EDTA pH 8,0 ] 3 mM CaCl[2 2 M NaCl ] 10 mM merkaptoethanol 250 µm spermidin 100 µm PMSF Směs chloroform/isoamylalkohol: Směs fenol/chloroform/isoamylalkohol: 24 dílů chloroform 1 díl fenol ekvilibrovaný 1 díl isoamylalkohol 1 díl směs chloroform/isoamylalkohol 3. Extrakce chromatinových proteinů 1. Pokud se pracuje přímo s nově připravenými jádry, jádra se promyjí 2x v promývacím pufru a odstředí 2000g/15min/4°C. (Pozor, aby při odlívaní roztoku nedošlo i k vylití jader). Pokud se pracuje s jádry které byly skladovány na -70°C, nutné nejdřív odstranit pufr C tím, že se po rozmrazení odstředí 2000g/15min/4°C a až pak promývat. 2. Usazená jádra na dně centrif. kyvety se rozsuspendují v 0,14M NaCl+ 10mM Tris-Cl pH 7,5. 3. Přidá se HCl na výslednou 0,25 M koncentraci a směs se nechá míchat v komorové lednici při 4-5°C na kolotoči 2 hod. 4. Vzorek se odstředí opět na 2000g/15min/4°C a odebere se supernatant. 5. K supernatantu se přidá studená kys. trichlóroctová (TCA) na 25% w/v. Vzorek se nechá inkubovat 30min na ledu za občasného promíchání. 6. Vzorek se odstředí 5000g/30min/4°C a odstraní se supernatant 7. Precipitát se promyje 1x v ledovém acetonu s 1M HCl; poměr = 98:1, odstředí se 2000g/15min/4°C a supernatant se odstraní. 8. Precipitát se promyje ještě 2x ledovým acetonem a pokaždé se odstředí 2000g/15min/4°C 9. Vzorky se nechají vysušit volně na vzduchu Promývací pufr: 75mM NaCl 10mM EDTA 50mM Tris-Cl pH 8 4. Analýza chromatinových proteinů pomocí SDS-PAGE K nalévaní gelu se použije aparatura od BioRad Mini Protean, skla s 0,75mm spacerem. 12,5% running gel (15ml): 6,3 ml 30% zás. roztoku akrylamidu (37:1) 3,8ml 4x runnig buffer (1,5M Tris-Cl pH 8,8) 0,15ml 10% SDS 6ml H2O 40µl Amonium Persulfát 30% (APS) 5µl TEMED Vrchní okraj running gelu se zalije kapkou destilované vody a nechá se zatuhnout. Po ztuhnutí, se voda odsaje filtračním papírem a nalije se stacking vrstva, s 10-komůrkovým hřebínkem. Stacking gel: 0,88ml 30% zás. roztoku akrylamidu (37:1) 1,66ml 4x stacking buffer (0,5M Tris-Cl pH 6,8) 66µl 10% SDS 4,06ml H2O 20µl APS 30% 3,3µl TEMED Na elektroforézu se používá glycinový pufr (0,025M Tris, 0,192M glycin, 0,1% SDS, pH 8,3), který získáme ředěním 10x ze zásobního roztoku. Před nanesením se vzorky denaturují při 95°C / 5 min po přidání denaturační směsi s barvivem, která je připravena bud 2x nebo 4x koncentrovanější. Do první jamky se zpravidla nanáší proteinový marker (nedenaturuje se ani se nepřidává barvička, už je nabarvený od výrobce). V naší laboratoři se používá od firmy Fermentas; do jamky se nanáší 7µl. 2x denaturační barvička (pH 6,8): 0,125M Tris-Cl 4% SDS 20% v/v glycerol 0,2M DTT 0,02% Bromophenol blue Na zaputování vzorku do stacking gelu se nastaví 50V, (proud při jednom skle 45mA, při dvou sklech 60 mA). Po zaputování do running gelu se zvýší napětí na 100-150V. Gel necháme běžet do doby, než se bromfenolová barvička přiblíží cca 2-5mm od dolního okraje. Po vypnutí a rozdělání aparatury se skla rozloží a gel se opatrně přemístí do misky, kde se nejdřív opláchne vodou a potom se barví Coomasie briliantovou modří (barvící roztok fy BioRad, na bázi kys. fosforečné), cca1-2hod, na třepačce, při nízkých otáčkách. Další 1 hod se zhruba odbarvuje ve vodě. Výsledkem by měly být modře-nabarvené bandy na bezbarvém pozadí.