Dvourozměrná elektroforéza (2D-PAGE)

2D-PAGE je vysoce efektivní separační metodou umožňující rozdělení komplikovaných směsí stovek různých bílkovin a představuje základní nástroj v novém rozvíjejícím se směru proteomiky. Je kombinací isoelektrické fokusace (IEF)a elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (PAGE). Obě separace se provádějí postupně tak, že nejprve se provede isoelektrická fokusace na proužku gelu s imobilisovaným pH gradientem (IPG), kdy se bílkoviny rozdělí podle svých isoelektrických bodů (pI) - viz obr. 1(a). Rozsah gradientu pH je udán výrobcem a pI skvrn lze určit podle její polohy.
Poté se připraví polyakrylamidový gel (s přídavkem dodecylsulfátu sodného - SDS), na jehož startovní stranu se těsně přiloží proužek IPG a po zalití spojovacím gelem (obvykle agarosa) se provede elektroforesa ve směru kolmém na původní směr IEF. Bílkoviny se zde rozdělí podle svých Mr - obr. 1 dole. Po jejím ukončení se gel obarví na bílkoviny a získá se

Obr. 1. Schematické znázornění 2D-PAGE (převzato z Lodish, H. a kol.: Molecular Cell Biology, 3. vyd., Freeman 1996)

dvourozměrný obraz sestávající z více či méně dobře oddělených skvrn představujících jednotlivé bílkoviny - ukázka je na obr. 2, kdy byl dělen bezbuněčný extrakt bakterie Escherichia coli. Spolu se vzorkem je možno ve 2. směru (SDS-PAGE) dělit standartní směs bílkovin o známých Mr a okalibrovat gel tímto parametrem. Tak můžeme každou skvrnu charakterisovat podle její polohy jak pI tak Mr.

Obr. 3. Reálný příklad 2D-PAGE (stejný zdroj)

Vyhodnocování elektroferogramů se provádí pomocí počitače speciálními programy, kdy po oskenování gelů se dají porovnávat jednotlivé obrazy a srovnávat s hodnotami z databází event. vzájemně mezi sebou a sledují se tak např. rozdíly v expresi bílkovin za různých podmínek apod. Častým, nicméně experimentálně náročným způsobem je charakterisace jednotlivých bílkovin tak, že se odpovídající skvrna vyřízne, podrobí specifickému štěpení (obvykle trypsinem) a produkty se analysují pomocí hmotnostní spektroskopie (MS). Získané údaje se opět pomocí počitačových programů srovnávají s hodnotami uloženými v databázích. Oba tyto způsoby vyhodnocení daleko přesahují rámec této úlohy, v níž se prakticky seznámíte s technikou dělení vzorků. Zpracování pomocí MS se provádí specialisovanými laboratořemi formou servisu

Vlastní provedení 2D-PAGE sestává z několika kroků.

POZOR! Veškeré operace se provádějí v ochranných rukavicích: jednak z důvodů zdravotních, jednak aby se předešlo kontaminaci bílkovinami z kůže (zvl. kolagenem).

Úprava vzorku

Cílem úpravy je zajistit dobrou rozpustnost bílkovin a převést jejich  molekuly do pokud možno uniformního tvaru tak, aby neovlivňoval dělení. Toho se dosáhne účinkem detergentů usnadňujících rozpouštění, chaotropních látek rušících vodíkové vazby a redukujících látek rušících disulfidické můstky v molekule bílkoviny. Jeden z nejužívanějších roztoků pro tuto úpravu (tzv. extrakční roztok) má toto složení:
8 M močovina (chaotropní agens)
50 mM DTT (ditiotreitol, redukující agens)
4% CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimetylamonio]-1-propansulfonát, detergent)
0,2% amfolyt (speciální pufr pro IEF podle požadovaného rozmezí pH gradientu)
0,0002% bromfenolová modř (slouží ke sledování postupu dělení)
Tímto roztokem se bílkoviny extrahují z tuhého vzorku jako je sediment buněk (min. 9 ml na 1 ml sedimentu) nebo se k němu přidává roztok bílkovin (nejvíce 20% objemu činidla) - přitom je nutno dbát na to, aby se nezvýšila iontová síla např. přítomným pufrem (maximum je 40 mM Tris).
Uvedená směs je již připravena a skladována při -20 oC. Obsahuje amfolyt 3/10 (pro gradient pH 3-10). Pro práci se 7 cm proužky rozmrazte špičku se 150 ml roztoku a přidejte 10-30 ml směsi bílkovin tak, aby obsahovala 200 - 500 mg bílkovin (preparát obdržíte od vedoucího spolu s údajem o koncentraci bílkovin). Po dobrém promíchání nechte stát 30 min. za laboratorní teploty a pak zcentrifugujte 8 min. při 12 000 ot.min-1. Supernatant použijete k rehydrataci proužků pro IEF.

Rehydratace proužků pro IEF (IPG proužky)

IPG proužky se dodávají v suchém stavu s imobilisovaným pH gradientem různých rozsahů. Nechávají se nabotnat v extrakčním roztoku, s výhodou v přítomnosti vzorku, který se tak spolu s ostatními komponentami přenese do gelu.
Napipetujte 125 ml supernatantu do rehydratační vaničky. Odstraňte ochrannou folii z IPG proužku pH 3-10NL a položte ho opatrně pomocí pinsety gelem dolů na vrstvičku kapaliny tak, aby celý povrch byl dobře smočen. Nechejte stát po dobu 1 hod. a pak proužek opatrně převrstvěte minerálním olejem a nechejte v chladničce botnat přes noc.

Isoelektrická fokusace (IEF)

Pinsetou umístíme na elektrody aparátu pro IEF tamponky z buničité vaty ovlhčené 5-8 ml vody. Nabotnalý IPG proužek položíme do dráhy gelem dolů tak, aby jeho konce spočívaly na tamponech s odpovídající orientací - tj. konec 3 na katodě a konec 10 na anodě. Převrstvíme opatrně minerálním olejem tak, aby proužky byly zaplaveny. Na aparátu nastavíme požadované parametry (pod dohledem vedoucího), obvykle 50 mA na proužek, maximum 4000 V, celkovou hodnotu 7-10000 V.hod a zvolíme program (obvykle rychlý způsob). Po ukončení běhu proužky můžeme skladovat v rehydratačních vaničkách při -20 oC i níže nebo je okamžitě podrobíme SDS-PAGE.

Příprava gelu pro SDS-PAGE

Sestavíme formu pro gel ze dvou skel (pro 7 cm aparát) a distančních proužků 1 mm a zafixujeme v držáku šrouby. Vložíme do stojánku a zaklapnutím zajistíme. Připravíme roztok pro 12% gel smícháním připravených roztoků:
6 ml zásobního roztoku A ( 87,6 g akrylamid + 2,4 g BIS v 300 ml)
3,75 ml roztoku B ( 1,5 M Tris pH 8,8)
5,05 ml vody
0,1 ml roztoku D ( 10% SDS)
0,1 ml čerstvého roztoku persíranu amonného ( 150 mg . ml-1)
10 μl TEMED (tetrametyletylendiamin)
 Směs vpravíme injekční stříkačkou mezi skla tak, aby nahoře zůstal asi 1 cm volný pro vložení IPG proužku a převrstvíme isobutanolem. Necháme polymerovat asi 1 hod. i více a mezitím si upravíme IPG proužek po IEF.

  
Ekvilibrace IPG pro SDS-PAGE

Tento krok zajišťuje redukci -SH skupin (DTT) a jejich alkylaci (jodacetamid, IAA), aby nemohlo dojít k vytváření disulfidických můstků, rozrušení vodíkových vazeb (močovina) a navázání SDS na bílkovinné molekuly (podjednotky) v uniformním tvaru. Je to analogie úpravě vzorku před jednorozměrnou SDS-PAGE varem v SDS-pufru.
Je připraven základní pufr o složení
50 mM Tris.HCl, pH 8,8
6 M močovina
2% SDS
20% glycerol.
Z něho připravíme po 2,5 ml pufru 1 a 2 tak, že v jednom rozpustíme 50 mg DTT (2%) a nalejeme ho na IPG proužek umístěný ve vaničce. Necháme působit 10 min. za mírného pohybu kapliny (na třepačce nebo ručně). Mezitím upravíme pufr 2 přidíním 65 mg IAA (2,5%) a až ukončíme působení pufru 1 zdekantujeme ho a nalejeme na IPG proužek pufr 2. Po 10 min. IPG proužek vyjmeme a vložíme na připravený PAG. Zatlačíme ho špachtlí do těsného kontaktu s gelem bez bublin a zalejeme teplým roztokem agarosy (1% v pracovním pufru pro SDS-PAGE). 

SDS-PAGE
Připravíte si pracovní elektrodový pufr zředěním 60 ml zásobního roztoku (15 g Tris, 72 g glycinu a 3 g SDS v 1 litru, upraveno HCl na pH 8,3) 240 ml destilované vody. Po zatuhnutí agarosy se desky vloží do aparátu Protean II a jeho nádobky se naplní pracovním elektrodovým pufrem. Do horní nádobky kápneme několik kapek 0,05% bromfenolové modři, aby byl pufr slabě modře zbarven. Připojíme zdroj, zapneme a nastavíme napětí na 150 V. Dělení trvá asi 4 hodiny, jeho postup sledujeme podle modré linie bromfenolové modři. Až doputuje na konec gelu, odpojíme zdroj, vyjmeme desky a opláchneme vodou. Poté demontujeme skla a gel opatrně přeneseme do misky s fixačním roztokem (30% isopropanol, 10% kys. octová). Po 2 hod. roztok slijeme a nahradíme barvicím roztokem (0,04% Coomasie Blue R-250 v 25% isopropanolu a 10% kys. octové). Necháme působit alespoň  6 hod. za mírného pohybu (na třepačce), pak slejeme a gel odbarvujeme 40% metanolem s 10% kys. octovou, který vyměňujeme po 30 min. až 2 hod. (zprvu častěji) až je pozadí gelu téměř bezbarvé. Hotový gel se oskenuje (provede obsluha vyhodnocovacího zařízení, obrázek se
vytiskne a přiloží k protokolu.