STANOVENÍ KONCENTRACE A ČISTOTY DNA

                                   SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA - 2

                                       PŘEČIŠTĚNÍ VZORKU DNA

                                   Postup  měření koncentrace DNA

                              Štěpení DNA restrikčními endonukleázami

                                    Restrikční štěpení DNA  - 2

                                       Restrikční štěpení DNA

                                     Složení restrikčních pufrů

                                      Vlastnosti  RESTRIKTÁZ:

                                         Využití restriktáz

•           Klonování DNA

•           Detekce mutací a polymorfismů

•           Stanovení příbuznosti

•           Restrikční mapování (restrikční mapa)



                                    Gelová elektroforéza  - GELY

                               GELOVÁ  ELEKTROFORÉZA – příprava gelu

                                           Princip  ELFO

                            Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu

•             Konformace DNA

•             Složení elektroforetických pufrů (iontová síla-TAE a TBE)

•             Složení bazí a teplota (u PAGE)

•             Přítomnost interkalačních barviv

•             Směr elektrického pole (PFGE > 50 kb)

•             Napětí (5V/cm)

•             Koncentrace gelu

•             Velikost DNA

                            Pohyb fragmentů DNA v gelu a jejich separace

                                        Gelová elektroforéza

                                           Metody detekce

•           Interkalační barviva (ethidium bromid)

•           Indolová a imidazolová barviva (DAPI)

•           Stříbro

•           Kyaninová barviva (SYBR Gold, SYBR Green)

•           Radioaktivní značení NK

                                          Ethidium bromid

                                        Mutagen a karcinogen

                        Interkalace do dsDNA (vazba i na helixy ssDNA a RNA)

                  Po interkalaci – 20-30x větší flourescence (fixní pozice v DNA)

                        Transiluminátor (UV ~ 302 nm), EtBr-DNA emise 590 nm

                                          Citlivost 1-5 ng

                          Postup přípravy gelu pro ELFO a nanášení vzorků

                                      Plazmid pUC18 -2,69 kbp