§ IN VITRO TESTY ■ rychlé, citlivé a nenáročné testy ■ možnost hodnocení environmentálních vzorků > abiotických: voda, sedimenty, ovzduší, půda > biotických ■ testy na povodních či geneticky modifikovaných prokaryotických či eukaryotických buňkách ■ modely bakteriální, kvasinkové či testy na živočišných a humánních tkáňových kulturách ■ vhodné pro zkoumaní endokrinní aktivity > čistých látek > modelových směsí > komplexních environmentálních extraktů ■ hodnocení potenciálu xenobiotik pro endokrinní disrupci IN VITRO TESTY ■ nejčastěji testy s reportérovými geny vloženými do kvasinkových nebo savčích buněk ■ sleduje se: > estrogenní aktivita > androgenní aktivita > aktivita dioxinového typu > (progesteronová aktivita, glukokortikoidní aktivita) ■ dobra reprodukovatelnost výsledků ■ nezohledňují biodostupnost, vstup latky do organismu ani toxokinctickc děje PRINCIP TESTŮ S REPORTÉROVÝMI SENY ■ používají se geneticky modifikované linie kvasinkových buněk nebo buněk z tkaní obratlovců (savců) ■ buňky se transf ekují reportérovým genem (přechodně, nastalo), který je pod kontrolou endogenního receptoru ■ reportérovy gen kóduje enzym lucif erázu (ß- galaktozidázu) ■ testovaná latka -* buňka -* vazba na receptor ~* aktivace -* vstup do jddra a vazba na DNA -► exprese reporteroveho genu -► produkce enzymu ■ aktivita enzymu luciferázy se stanovuje luminiscenčně (ß- galaktoziddza metabolizuje médium- změna barvy) TESTY NA BUŇKÁCH SAVCŮ ■ celý test trvá 48 h, je nutné pracovat ve sterilním prostředí ■ MVLN > buňky lidského karcinomu prsu > luciferdzový gen pod kontrolou estrogenního receptoru (ER) > men se estrogenní a antiestrogenní aktivita, luminiscenčně ■ H4IIE- lue > buňky krysího hepatomu > luciferdzový gen pod kontrolou „aryIhydrocarbon''receptoru (AhR) > měří se aktivita dioxinového typu, luminiscenčně ■* test s neutrální červem > test cytotoxicity na buněčných kulturách > živé b. přijímají a váží v lysozomech barvivo > stanovení spektrofotometricky ■ testuje se také androgenní, progesteronova a glukokortikoidni aktivita TESTY NA BUNKÁCH SAVCŮ PRACOVNÍ POSTUP ■ kultivované buňky jsou nasazeny do jamek 96- jamkové mikrotitrační desky o určité koncentraci buněk na jamku ■ inkubace 24 h při 37 °C a 5 % C02 ■ Expozice: testovanou latkou (rozpouštědlo- ethanol, ĎAASO) negativní kontrolou (čisté rozpouštědlo) pozitivní kontrolou (E2/ TCĎĎ- 6 konc. kalibrační řada) > každý vzorek ve 3 opakováních > při testování antiestrogenní aktivity- přidán k testované látce E2 ■ inkubace 24 h při 37 °C a 5 % C02 ■ expoziční směs se odpipetuje, přidá se luciferázový kit ■ po 10 min. třepáni se luminometrem změří aktivita indukované luciferázy KVASINKOVÉ TESTY ■ geneticky modifikovaný kmen Saccharomyces cerevisiae ■ celý test trvá cca 24 h, nutné pracovat ve sterilním prostředí ■ kmen kvasinkové kultury AR > luciferazový gen pod kontrolou androgenního receptoru (AR) > měří se androgenní a antiandrogenní aktivita, luminiscenčně ■* kmen kvasinkové kultury LUC > kontrolní kmen pro měření cytotoxicity ■ testuje se také estrogenní, progesteronova a glukokortikoidní aktivita KVASINKOVÉ TESTY PRACOVNÍ POSTUP ■ naočkujeme kvasinkovou pře- kulturu do minimálního média ■ narůst přes noc, za tmy, třepáni, ve 30 °C ■ změříme optickou denzitu při 660 nm, výpočet ředění ■ naředěnd kultura- inkubace 2 h při 30 °C za tmy při stálém třepáni ■ do mikřotitřační desky (96) pipetujeme do každé jamky kvas. kulturu + testovanou látku/ negativní kontrolu/ pozitivní kontrolu- testosteron (ve 100 % ethanolu nebo ĎAASO) > každý vzorek ve 3 opakováních > při testování antiandrogenní aktivity- přidán k testované látce T ■ inkubace 2,5 h při 30 °C za tmy ■ po inkubaci pipetu jeme do každé jamky 1 mM roztok luciferinu (pomocí dispenzořu v luminometřu) ■ krátce třepeme a ihned měříme luminometřem (vzorek je stálý pouze okolo 5 min.) �519 VYHODNOCENÍ ■ odhad specifické aktivity environmentálního vzorku- nutné stanovit ekvivalent specifické aktivity porovnáním s referenční látkou Př. Ekvivalent estradiolu (EEQ)- vyjadřuje ekvivalentní množství E 2 na množství vzorku, které by vyvolalo stejnou odpověď jako množství vzorku ■ je vytvořena ředící rada vzorku, EC50 nerii koncentrace, ale zředění, při kterém došlo k 50 % účinku ■ EEQ = EC50(E2) / EC50(vzorku) ■ EEQ umožňuje kvantifikovat estrogenní aktivitu bez znalosti chemických látek působících estrogenně ■ ekvivalenty specifické aktivity získáme pomocí křivky dávka- odpověď DĚKUJI ZA POZORNOST