Standardní metody Mnoho metod standardizováno mezinárodními i národními organizacemi Organization for Economic Cooperation and Materials (OECD) International Organization for Standardization (ISO) American Society for Testing and Materials (ASTM) - US EPA Národní standardizační programy a legislativa — CNI Český normalizační institut -MŽP -MZE Výhody standardních metod • Metodiky testů j sou jednotné a porovnatelné s předchozími výsledky v té stejné i v dalších laboratořích • Mohou být zopakovány dalšími laboratořemi • Výsledky jsou dobře akceptovatelné pro regulační orgány • Zjednodušená logistika, vývoj a optimalizace už provedena • Tyto metody poskytují základ, na němž se dá dále stavět a který se dá případně modifikovat • Získaná data mohou být kombinována s daty z jiných laboratoří pro využití v QSAR, ERA's • Detailní seznam použitých přístrojů, medií, modelových organismů, atd. • Popsány experimentální, analytické a documentační postupy • Specifikována pravidla validity testu Nevýhody standardních metod • Často příliš specifické -> těžko aplikovatelné pro jiné situace nebo k odpovědi dalších otázek • Bývají používány v nevhodných situaacích (výzkum, hodnocení příčiny a účinku) • Nemusí být aplikovatelné do reálného prostředí Moderní přístupy studia biochemických a buněčných mechanismů toxicity v ekotoxikologických biotestech Klára Hilscherová W) MB > \ — o Biosféra Ekosystém I Společenstvo I Populace ZT" Jedinec '._ .o. Soustava organu Orgán Tkáň Buňka Organela Biomolekula NÍZKÁ VYSOKÁ I rX- I Ekologická I relevance I Trvání odpovědi I Dlouhodobější I následky Flexibilita I Schopnost určit I příčinu I Specifita I Citivost I "i I VYSOKÁ NÍZKÁ BS BIOMARKERY • Časné varovné signály potenciálního poškození organismu i celé populace, časný marker toxicity (i bez morfologických změn) • Cizorodými látkami způsobené změny buněčných nebo biochemických složek, struktur, nebo funkcí, které jsou měřitelné v biologickém vzorku • Citlivé, rychlé odpovědi, mohou ukazovat mechanismus účinku, předcházejí viditelným symptomům toxicity • Nejlépe prostudovány u vyšších živočichů (savců, ryb) • Možno sledovat i u druhů ze standardních akvatických biotestu (řasy, makrofyta, bezobratlí) Biochemické markery - screeningové metody s vysokou predikční schopností, alternatíva vůči stávajícím metodám. - používány v základním toxikologickém, ekotoxikologickém a farmakologickém výzkumu. - některé obecně akceptovány. - řada parametrů testována jako potenciální biochemické markery. - potenciál využití jako alternativní metody pro toxikologické hodnocení nových xenobiotik. Výhoda biologických a biochemických indikátorů kontaminace: schopnost vypovídat o vlivu znečištění v celém jeho komplexu, se všemi synergistickými a antagonistickými vlivy mezi jednotlivými znečišťujícími komponenty. Biochemické markery Princip: toxické látky v subletálních koncentracích způsobují změny hodnot hematologických, biochemických, ukazatelů nespecifické imunity, vyvolávají histopatologické změny v tkáních. Po vstupu cizorodých látek do organismu či buňky dochází: • k jejich vazbě na buněčné receptory, kontrolující klíčové buněčné pochody, • ke vzniku reaktivních intermediátů, • k inhibici určitých enzymových aktivit a dalším procesům, které předcházejí toxickým a dalším negativním efektům na úrovni buňky, orgánů, organismů a populací. Biochemické markery toxicity = vybrané parametry, jejichž měřitelné změny jsou prvními, časnými odpověďmi na expozici cizorodými látkami („early warning of biological impact"). - indikují mechanismus toxicity, nikoliv určitou cizorodou látku. - některé biochemické parametry specificky odrážejí expozici některou třídou nebo skupinou kontaminantů. - biologickými modely jsou nejčastěji jaterní tkáň, primární hepatocyty nebo permanentní linie odvozené od hepatocytů, případně odebraná krev či jiné tělní tekutiny • Vhodně zvolené biomarkery jsou významnými indikátory zdravotního stavu organismů v monitorovaném ekosystému. • Předností je schopnost detekovat toxické účinky látek před manifestací jejich účinku, tzn. před narušením fyziologických funkcí jako např. růstu, vývoje, reprodukce. Biomarkery = biochemické, fyziologické či histologické indikátory expozice nebo vlivů xenobiotik na suborganismální nebo organismální úrovni Výhoda: odpovídají na expozici = reagují pouze polutanty dostupné pro organismus. Vhodné biomarkery by měly splňovat následující vlastnosti: (i) senzitivní ve srovnání s ostatními biomarkery; (ii) specifičnost ke konkrétním druhů chemických xenobiotik; (iii) permanentní odpověď; (iv) jasnost v interpretaci a propojení na vlivy vyšší úrovně; (v) spolehlivost, reprodukovatelnost; (vi) preciznost, jednoduchost a nízké náklady; (vii) aplikovatelnost v terénních podmínkách a validace v terénu BIOMARKERY I Pesticidy | ^^ ■ mm w 4 V ■ V ^ Specifičtější parametry Nespecifické parametry Histologické m a r ke ry Imulogické m a r ke ry Fyziologické m a r ke ry Růst Reprodukce I Xenobiotika | • environmentálni polutanty • léky • agrochemikálie x Eliminace •UDPGTs Bioaktivace Detoxifikace • GSH • GST • epoxid hydroláza Reaktivní intermediaty | elektrofily ■ volné radikály i Reaktivní kyslíkové radikály + Bunečná ochrana • GSH »GR • GPx *SOD • GST • Cat • G6PD Olove molekuly ßPBB • DNA • proteiny • lipidy Poškození • adukty • oxidace Teratogenita Malformace Mortalita BIOMARKERY EXPOZICE • identifikují látku v systému a interaktivní produkt mezi xenobiotikem a endogenní složkou nebo jiné skutečnosti v biologickém systému způsobené expozicí. • charakterizují množství toxikantu, které proniklo do organismu • neposkytují příliš informací o následcích expozice, různě specifické BIOMARKERY ÚČINKU-VLIVU • biochemické změny, které se projevily jako výsledek negativní interakce toxikantu a biologického systému a mohou vyústit až v patologické poškození organismu Biomarkery expozice I. Stresové proteiny (proteiny teplotního šoku) - nespecifické, indukovatelné u rostlin i živočichů II. Inhibice esterázové aktivity (acetylcholinesterázy) - enzym nervového systému živočichů, specifická odpověď - po expozici organofosfátových pesticidů a karbamátů - primární toxický vliv těchto látek, stupeň inhibice enzymů je v úzkém vztahu k expozici tkání Acetylchohnesteraza (AchE): zejména v mozku, červených krvinkách a plasmě některých obratlovců, zodpovědná za hydrolýzu acetylcholine hlavního přenašeče neuronů. Její inhibice silně ovlivňuje přenos nervových signálů. Metalothioneiny - cytoplasmické kovy-vážící proteiny, vyskytují se u řady eukaryot, indukce po expozici kovy, biomarkery vlivu toxických kovů. - skupina proteinů s nízkou molekulovou hmotností (6 000-20 000), vysokým obsahem aminokyselin obsahujících sulfhydrylové skupiny (zejména cystein) a schopností vázat těžké kovy. K jejich zvýšené syntéze dochází při zvýšené koncentraci iontů kovů jak esenciálních tak toxických BIOMARKERY EXPOZICE IV. Indukce detoxikačních enzymů u rostlin i živočichů A. Enzymy I. fáze biotransformace - enzymy MFO (monooxygenázy smíšené funkce) - indukce enzymů cytochromu P450 (EROD, MROD, PROD) cytochrom P4501A - biomarker expozice důležitých skupin organických látek - hladina cytochromu indukována 2,3,7,8-tetrachlodibenzo-p-dioxinem a příbuznými látkami, PCB, PAU - cytochromy P450 (CYP) jsou hemoproteiny schopné vázat molekulární kyslík a vsunovat jeho jeden atom do molekuly substrátu, kterým mohou být i cizorodé látky, které jsou jedním nebo více cytochromy přeměněny tak, aby mohly být z organismu např. exkretovány. B. Enzymy II. fáze biotransformace - glutathion transferazy (GST), uridinedifosfoglukuronosyl transferazy, sulfotransferázy Biomarkery účinku CPßB I. Parametry oxidativniho stresu - produkce kyslíkových radikálů, aktivita antioxidačních enzymů koncentrace neenzymatických antioxidantů, oxidatívni poškození makromolekul II. Parametry energetické bilance organismu - obsah lipidů, proteinů, uhlovodíků a aktivita elektronového transportu III. Indikátory narušení metabolismu - metabolické enzymy pyruvát kináza, laktát dehydrogenáza, isocitrát dehydrogenáza IV. Biomarkery zatížení endokrinního systému - vitelogenin, hormony T3 a T4, enzymy metabolizmu steroidních hormonů. V. Genotoxické biomarkery (narušení integrity DNA - zlomy v DNA, mikrojadérka) VI. Histologicko-patologické změny některých orgánů BIOMARKERY UCINKU Parametry oxidativního stresu > produkce kyslíkových radikálů - Superoxid, peroxid vodíku, hydroxylový radikál > aktivita antioxidačních enzymů - glutathion peroxidáza, glutathion reduktáza, superoxidáza, kataláza > koncentrace neenzymatických antioxidantů > oxidatívni poškození makromolekul - lipidní peroxidace, oxidatívni adukty DNA, produkty oxidace proteinů Jedná se biomarkery organochlorových pesticidů, PCB, pesticidů typu paraquat apod. Genotoxické biomarkery (narušení integrity DNA - zlomy v DNA, mikrojadérka) - využívány při hodnocení zatížení ekosystémů látkami s genotoxickým účinkem, které indukují vznik chromosomálních aberací a mutací. alternativa detekce - metody PCR, RT-PCR a DNA-fingerprintingu test mikrojader Test mikrojader (MNT) - jednoduchá orientační metoda ke stanovení genotoxicity. Pozitivní po působení PCB, benzpyrenu, benzidinu, apod. Biomarkery účinku na endokrinní systém Stanovení produkce vitelogeninu • Vitelogenin je bílkovina produkovaná jaterními buňkami ryb, obojživelníků, plazů a ptáků. • Produkce je indukována vazbou estrogenu na jaterní receptory. • U samic je vitelogenin transportován do vaječníku, kde tvoří součást žloutkových proteinů. • U samců je hladina endogenních estrogenu přirozeně velmi nízká, a proto je i produkce vitelogeninu minimální • Po působení ED's s xenoestrogenním účinkem (ze známých látek je to např. chlordan, toxafen, dieldrin, 4-nonylfenol) dochází u obou pohlaví ke stimulaci tvorby endogenních estrogenu a ke zvýšení hladin vitelogeninu. • Naopak působením antiestrogenních ED's (např. metoxychloru) se produkce vitelogeninu minimalizuje pod měřitelnou úroveň. • Sledován zejména u ryb a obojživelníků Další parametry: vitelin, cytochromy, hladiny hormonů Histochemická charakteristika a lokalizace Doporučené metody pro biologické monitorovací programy ve vodním prostředí na národních úrovních Metoda Organismus V současnosti používán v monitorovacích programech Biom arke r 1 átek Biologický význam Tvorba DNA aduktů Ryby, mlži Francie, Holandsko, Švédsko, USA P AU, nitro látky, amino triazinové pesticidy Parametr genotoxických vlivů, citlivý indikátor minulé a současné expozice Inhibice acetylcholiesterázy Ryby, korýši, mlži Francie Organofosfáty a karbamáty nebo podobné molekuly, možné rasové toxiny Parametr expozice Indukce met allothioneinů Ryby Monitoring and Research Programme of the Mediterranean Action plan, Holandsko Indukce met allothioneino vých proteinů vlivem určitých kovů (Zn, Cu, Cd, Hg) Parametr expozice a disturbance metabolismu mědi a zinku Indukce ethoxyresorufin-0-deetylázy (EROD) nebo cytochromuP450 1A Ryby Německo, Francie, Holandsko, UK, Belgie, Monitoring and Research Programme of the Mediterranean Action plan, Norsko Indukce enzymů detoxikujících planární organické kontaminaty (PAU, planární PCB, dioxiny) Možný prediktor patologie vlivem mechanistických propojení, senzitivní indikátor současné expozice Inhibice A-amino levulinové kyselina (ALA-D), indukce vitellogeninu Samci a juvenilní jedinci ryb Holandsko, UK Estrogenní látky Parametr feminizace samčích ryb a reprodukční poškození Aplikace biomarkerů v akvatických testech CPßB > > > Při přípravě testu nezbytné používat dobře charakterizovaný materiál - homogenní populaci faktory ovlivňující biomarkery - druh organismu, pohlaví, věk, vývojové stadium a výživa, environmentálni faktory (teplota etc.) otestovat a nakalibrovat potřebné množství vzorku podle množství sledovaných parametrů, jejich limitu detekce a spotřeby biologického materiálu pro jednotlivé metodiky - u malých druhů směsné vzorky z více jedinců CPßB Biomarkery - závery Biomarkery = citlivé indikátory zatížení organismů environmentálními stresory a subletálních účinků Umožňují náhled do subletálních fyziologických procesů -charakterizují mechanismus účinku Specifické markery - informují o přítomnosti specifického stresom Použitelnost určitého biomarkeru pro každý nový druh musí být validována a optimalizována, musí být posouzena jeho relevance a míra odpovědi pro nový druh Nezbytný multiparametrický přístup Studium spojení časných subletálních biochemických a buněčných změn s dlouhodobějšími negativními účinky na úrovni populace a společenstva 88 Speciální ekotoxikologické biotesty - in vitro • standardní testy (normy ISO, ČSN, USEPA) • optimalizace/vývoj nových testů • Toxicita • Specifické mechanismy neletálních účinků > Genotoxicita > Dioxinová aktivita > Mechanismy endokrinní dismpce - estrogenita, androgenita > Imunotoxicita > Biochemická ekotoxicita • Testování čistých látek (environmentálni polutanty) modelových směsí komplexních environmentálních extraktů EMI In vitro toxikologie Testy na původních či geneticky modifikovaných prokaryotických či eukaryotických buňkách BAKTERIÁLNI TESTY, KVASINKOVÉ TESTY TESTY NA TKÁŇOVÝCH KULTURÁCH r* „ t , O ^" Q- i "(J* ^° o c ° o i5b "-«^ r <5°0 o a „ŕto0 i tC ' ° ' :,,, "O mi ^L Využití tkáňových kultur (TK) = Alternativní metoda k pokusům na živých organismů Výhody TK: výrazné snížení množství zvířat použitých v experimentu • zajištění vysokého počtu vzorků a možnost odběru kontrolních i experimentálních vzorků z tkáně jednoho zvířete, což minimalizuje variabilitu získaných výsledků. Nevýhoda TK: možnost sledovat účinky testované látky pouze na konkrétním druhu tkáně, ze kterého byla TK připravena, tedy chybějící možnost posouzení zdravotního stavu a chování celého živočicha. Např. k testování účinků ED's se využívají TK z jater drápatky vodní. Za 6 až 8 dnů po expozici xenoestrogenním látkám začne TK produkovat vitelogenin. Bylo prokázáno, že hladiny vitelogeninu vyprodukovaného TK a játry živé drápatky se statisticky významně neliší Nejznámější stabilní rybí buněčné linie využívané v testech toxicity jsou: RTG-2 (fibroblasty gonád pstruha duhového), EPC (epithelioma papillosum cyprini), R-l (fibroblastické buňky jater pstruha duhového, PLHC-1 (jaterní buňky Poecilopsis lucida). Testy na buněčných kulturách • využívány zejména pro teoretické objasnění účinku toxického agens. • v poslední době i pro rutinní provádění testů toxicity. • prováděny za využití primárních buněčných kultur a stabilních buněčných kultur. Primární buněčné kultury se získávají z jednotlivých tkání organismů, jsou nestandardní, což může významnou měrou ovlivnit výsledek testu toxicity (= nízká reprodukovatelnost). například stabilizované linie kožních buněk, nervových buněk, buněk srdečního svalu, buněk odvozených od tkání ledvin a pod. • buněčný substrát pro založení kultury se kdysi získal většinou od lidského dárce (jako vedlejší materiál např. při operaci), pak se stabilizoval a uzpůsobil k neomezenému dělení a následné kultivaci. • dnes se kupuje v buněčné bance, respektive Sbírce buněčných kultur. • možno získat stabilní buněčné linie z různých orgánů a z různých druhů organismů • tyto linie se velmi dobře přechovávají v hybernovaném stavu. • podle předepsaných podmínek (výživa, teplota, vlhkost apod.) lze danou buněčnou kulturu rozpěstovat použít v toxikologickém testu. • buňky se nasazují do speciálních nádob pro pěstování buněčných kultur, přidává se živné medium obohacené o antibiotika, případně antimykotika • stabilizované linie se dobře pěstují, rychle rostou a lze vytvořit mnoho vzorků menších kultur, ke kterým se přidávají do kultivačního prostředí chemické či jiné látky a zkoumá se charakter toxických účinků dané látky. 97 Používané metody Rada testů optimalizována na provedení v mikrodestičkách Toxicita a genotoxicita: měřen zákal či aktivita reporterového genu -spektrofotometrický, fluorimetricky či přirozená bioluminiscence Cytotoxicita: hodnocena přímými a nepřímými metodami. Přímé metody = posouzení celkového počtu uhynulých buněk a rozsahu cytopatických efektů. Nepřímé metody založeny na fyziologických reakcích buněk hodnocených na základě barevných reakcí. Mezi nejpoužívanější patří NR-test, který využívá schopnosti nepoškozených buněčných lysozomů přijímat neutrální červeň a dále MTT-test, založený na redukci MTT tetrazolové soli účinkem mitochondriální sukcinátdehydrogenázy. Výhodou těchto metod je jejich časová nenáročnost, možnost standardizace a miniaturizace. Modulace receptorově-závislých odpovědí: aktivita reporterového genu, např. luminometrie - indukce nebo inhibice reportérové luciferázy, nebo spektrofotometrie - indukce nebo inhibice reportérové ß-galaktosidazy Stan - elektroforetické a imunoblotovací metody, Western blot, molekulárně biologické techniky Řada autorů provedla porovnání výsledků testů in vivo s výsledky testů in vitro s cílem posoudit možnost náhrady testů na živých organismech. Výsledky testů in vivo a in vitro spolu korespondovaly, v řadě případů byly shodné a v některých případech byla citlivost testů in vitro nižší. MECHANISMY chronické toxicity polutantů Princip: různé chronické účinky chemické látky vycházejí ze společného biochemického mechanismu působení - Základní výsledky z mechanisticky založených in vitro testů LCEPT roxiN RECEPTOR hC5rmo^>e O Biochemické účinky ^> In vivo účinky zhodnocení in vitro účinků jednotlivých látek • Poznání zásadního mechanismu, predikce rizika Využití pro hodnocení rizik a/nebo monitoring • Určení relativních potencí ("toxických ekvivalentů") -> RA • Biomarkery in vitro - přímá charakterizace komplexních vzorků Receptorově-mediované mechanismy toxicity ESTROGENNI RECEPTOR - ER Testy receptorově-mediovaných mechanismů • Nejvíce studovaný - Aryl hydrokarbon receptor - umístěný v cytosolu • Jaderné receptory zahrnují několik rodin receptoru: Androstanový receptor (AR), estrogenní receptor (ER), progesteronový receptor (PR), glukokortikoidní receptor (GR) a mineralokortikoidní receptor (MR) jsou hlavními představiteli rodiny steroidních receptoru • Receptory slouží jako poslové mezi genomem a extracelulárními signály, na které musí buňka reagovat, aby přežila. • Buněčné receptory regulují na základě interakce s xenobiotiky expresi enzymů I. a II. fáze biotransformace a některých detoxifikačních transportérů. • Ve většině případů se jedná o indukci exprese (up-regulaci) cílových genů, které se přímo podílejí na biotransformaci nebo exkreci xenobiotik. Princip testu: sledovaná aktivita reporteroveho enzymu odpovídá potenci látky či směsi pro interakci s receptorem In vitro stanovení dioxinové toxicity - Stanovení na buněčné linii krysího hepatomu H4IIE.luc Pod kontrolu AhR-responsivního elementu vložen gen pro luciferázu Diox aktivní látky □ □ luminometr <- AhR HSP90 HSP90 HSP90) DRBLuc HSP90) A1P+ lucigenin In vitro stanovení estrogenní aktivity Estrogen or xenoestrogen + EB^ \P) Civ ^ Nuclear Factors EBJO© Protein Phosphorylation of ER: Ligand-Independent Activation ERE-Luc DNA Binding mRNA / "Estrogenic Effects' ER-Responsive Genes CPßB In vitro biotesty k detekci dioxinové a estrogenni aktivity Buňky H4IIE-LUC J «^ZZ^^T^ \ Buňky MVLN OOO <^> <=> C35 cz> <^> <^> <=> <^> c^> Po 24 hodinách vyměněno medium, dávkovány testované látky Expoziční doba : 3-72 hod Po expozice odstraněno medium, buňky vymyty pufrem a přidán Luclite reagent. Po 20 minutách měřena aktivita luciferázy v destičkovém luminometru. 4599 5499 1599 1599 1599 5599 In vitro testy na bunečných liniích - hodnocení expozice látkami se specifickým mechanismem účinku (látky s dioxinovou, estrogenní aktivitou) - reportérové buněčné linie transfekované genem luciferázy, který je indukován po navázání ligandu na receptor - kalibrace odpovědi standardním ligandem (2,3,7,8-TCDD pro dioxinovou aktivitu, 17ß-estradiol pro estrogenní aktivitu) Vztah mezi dioxinovými toxickými ekvivalenty stanovenými v biotestu na buněčné linii (TCDD-EQ) a spočítanými z výsledků chemických analýz 1600 _1200 O) O) Q. — 800 O LU H 400 0 y=1,1217x-36,261 R2 = 0,9422 ♦ ♦ 30000 25000 ^ 20000 O) 2 15000 O LU 10000 H 5000 0 y= 1.0764X+723,67 R2 = 0,8345 ^ 0 500 1000 TCDD-EQ (pg/g) 1500 5000 10000 15000 20000 25000 TCDD-EQ [pg/g] Srovnání různých látek -> Použití v hodnocení rizik Kvantifikace účinků (EC50) - relativní potence Srovnání s účinkem referenčního toxikantu (2,3,7,8-TCDD) • Vyjádření jako relativní potence/ Ekvivalenční Faktor (~ TEF) X (0 E Q Q ü o «J ■o o «J '■B o E 120 100 TCDD B [a] P B [e] P TCDD: PAH: IC50 IEC 50 Relativní potence IEF = IC50 / IEC50 Kolikrát je ta látka slabší Ugánd než TCDD ? 1.E-07 1.E-04 1.E-01 1.E+02 concentration 4 M) Toxické equivalenční faktory pro PCDDs, PCDFs a PCBs: Table 4. Toxic Equivalent Factors established by the WHO tWHO-TEFs) for dioxins and dioxin-lilte PCBs [41 PC D D Congener WHO-TEF PC D F Congener WHO-TEF PCB Congener WHO-TEF 2,3,7,8-TCDD 1 2,3,7,8-TCDF 0.1 Non-ortho 12,3,7,8-PeCDD 1 1237,8-PeCDF 0.05 pcb#81 0 0005 123478-HxCDD 0.1 23478-Pe CD F 0.5 PCB#77 0.0005 123678-HxCDD in 123478-HxCDF 001 PCB#12Ó 0.1 12,3,7,89-HxCDD 0.1 123ň78-HxCDr 0.1 PCB#1Ó9 0 01 12:M678-HpCDD 0.01 234678-HxCDr 0.1 Mono-ortho OCDD 00001 12,3,7,89-Hx CDF 0.1 PCB#105 0 0001 1234678-H pCD ľ 001 PCB#114 0 0005 1234789-H pCD F 0.01 PCB#118 0.0001 OCDF 0.0001 PCB#123 PCB#156 PCB#157 PCB#167 PCB#189 0.0001 0.0005 0 0005 0 00001 0 0001 Eljarrat & Barceló, Trends Anal. Chem.22: 655 Testování komplexních vzorků ze životního prostředí • vzorky vzduchu, sedimentů, půd • rychlý screening znečištění • hodnocena toxicita, genotoxicita, dioxinová a estrogenní aktivita • výběr vzorků pro podrobnej ší studium/analýzu • spojení s analytickou chemií, frakcionace Problém reprezentativního vzorkování, uchovávání vzorku „pseudopersistentní látky" - kontinuální expozice nízkým dávkám Hodnocení přítomnosti látek se specifickým mechanismem toxicity v komplexních vzorcích. Příklad: AhR-aktivita 1) Srovnání toxicity různých vzorků, identifikace problematických 2) Identifikace nejdůležitějších toxických látek ve sledované oblasti: PAHs Q Q O 3,3 11,1 33,3 111,1 333,3 sample concentration (Mg/ml) 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 1 10 102 103 104 __________________Kpncentrace(|jg/niD_____________ Sample No. Locality AhR-activity fTEQ/g sed.) ER-activityjEEO/g sed.) Chemical analysis 24 h 72 h H2SO4 treated (24h) 24 h 72 h 7EQ(PAHJf* EPAH** Z PCB*** 1 Litvínov 5363 2939 1419 4347 8650 280 3081 133,5 2 Litvínov 551439 120743 4220 69873 15255 5005 65346 45,6 3 Litvínov 1761 w.i. w.i. w.i. w.i. 169 1941 13,1 4 Zub ň 22725 996 w.i. w.i. w.i. 641 4207 32,1 5 Chropyně 7426 w.i. w.i. w.i. w.i. 586 3458 9,7 6 Chropyně 7281 1162 w.i. w.i. w.i. 1763 10278 37,0 7 Kroměříž 6179 741 w.i. w.i. w.i. 911 5263 13,6 8 Otrokovice 19282 1162 10 w.i. w.i. 1198 9428 14,8 Výhody toxikologických in vitro testů • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, snadnost provedení, menší náklady • ukazují celkovou biologickou aktivitu látek, které působí specifickým mechanismem • možnost provést screening velkého množství vzorků • mohou poukázat na přítomnost toxikologický významných látek, které nejsou běžně analyticky stanovovány • sledují i možné interakce (jako Synergismus či antagonismus) působení látek v komplexních směsích Nevýhody toxikologických in vitro testů • nezohledňují biotransformaci látek v organismu • nemohou plně nahradit enzymaticko-imunitní reakci živého organizmu • neposkytují informaci o tom, které jednotlivé látky ze směsí vyvolaly odpověď • poskytují informaci jen o celkové aktivitě látek působících určitým specifickým mechanismem Závěr: Testy toxicity na buněčných kulturách jsou vhodný screening před provedením baterie testů na živých organismech. íéfX